Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Summary

Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.

Abstract

Métastases du cancer est connu pour causer des 90 % de létalité du cancer. Métastase est un processus à plusieurs étapes qui initie avec la pénétration/invasion des cellules tumorales dans les tissus voisins. Ainsi, l’invasion est une étape cruciale à la métastase, rendant l’invasion processus recherche et le développement de médicaments anti-métastatiques, hautement significative. Pour répondre à cette demande, il est nécessaire de développer des modèles 3D dans vitro qui imitent l’architecture des tumeurs solides et leur microenvironnement plus étroitement à l’état in vivo d’une part, mais en même temps être reproductible, robuste et adapté aux haut rendement et hautes teneur Mensurations. Actuellement, la plupart analyses d’invasion se pencher sur technologies microfluidiques sophistiqués qui sont adéquates pour la recherche, mais pas pour le dépistage des drogues un volume élevé. Autres dosages utilisant des dispositifs à base de plaque avec des sphéroïdes individuels isolés dans chaque puits sont matériel consommant et ont la taille de l’échantillon faible par l’État. L’objectif du protocole actuel est de fournir un système de base de cellules 3D biomimétique simple et reproductible pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Nous avons développé un modèle 3D pour invasion analyse basée sur la plaque d’imagerie HMCA de recherche sur l’invasion tumorale et la découverte de médicaments anti-métastatique. Ce dispositif permet la production de nombreux sphéroïdes uniformes par puits (taille de l’échantillon élevé par État) entouré de composantes d’ECM, tout en permanence et simultanément observer et mesurer les sphéroïdes à élément simple résolution pour les moyennes criblage de médicaments anti-métastatiques. Cette plateforme est présentée ici par la production des sphéroïdes HeLa et MCF7 pour illustrant la cellule individuelle et collective invasion. Nous comparons l’influence de l’ECM composant l’acide hyaluronique (HA) sur les capacités invasives de collagène qui entourent les sphéroïdes HeLa. Enfin, nous ne présentons fisétine (inhibiteur de l’invasion) HeLa sphéroïdes et l’oxyde nitrique () (activateur d’invasion) à MCF7 sphéroïdes. Les résultats sont analysés par un logiciel interne qui permet l’analyse semi-automatique, simple et rapide qui facilite l’examen des paramètre multiples.

Introduction

Décès par cancer est attribuée principalement à la diffusion des cellules métastatiques à des endroits éloignés. Beaucoup d’efforts dans le traitement du cancer se consacrée sur le ciblage ou de prévenir la formation de colonies métastatiques et la progression de la maladie métastatique systémique¹. Migration des cellules du cancer est une étape cruciale dans le processus de métastase tumorale, ainsi, la recherche de la cascade d’invasion du cancer est très important et une condition préalable à la recherche de thérapies anti-métastatique.

L’utilisation de modèles animaux comme outils pour l’étude de la maladie métastatique s’est avérée pour être très coûteux et pas toujours représentatifs de la tumeur chez les humains. En outre, la topologie du microenvironnement extracellulaire, la mécanique et la composition fortement affectent cancer cell comportement². Car en vivo modèles intrinsèquement n’ont pas la capacité de séparer et de contrôler ces paramètres spécifiques qui contribuent à l’invasion du cancer et des métastases, on a besoin pour biomimétique contrôlables en vitro modèles.

Pour métastaser dans des organes éloignés, cellules cancéreuses doivent présenter des caractéristiques phénotypiques migrateurs et envahissantes qui peuvent être ciblés pour la thérapie. Toutefois, étant donné que la plupart des modèles in vitro du cancer ne pas imiter les caractéristiques réelles des tumeurs solides³, c’est très difficile de détecter des phénotypes physiologiquement pertinents. En outre, l’hétérogénéité phénotypique qui existe au sein de la tumeur, dicte la nécessité pour l’analyse des migrations de la tumeur à élément simple résolution afin de découvrir les thérapies axées sur le phénotype, par exemple, en ciblant les cellules déclenchant les métastases population au sein de tumeurs hétérogènes⁴.

L’étude de la motilité cellulaire et migration collective est menée principalement dans des cultures monocouches de cellules épithéliales sur des surfaces planes homogènes. Ces modèles cellulaires classiques pour la migration des cellules du cancer sont basées sur l’analyse de populations de cellules individuelles envahir à travers les membranes et les ECM composants⁵, mais dans ces systèmes, les différences intrinsèques entre les cellules individuelles ne peuvent pas être a étudié. Générer des sphéroïdes 3D par échafaudages ou en microstructures exempte d’échafaudage est considéré comme un supérieur moyen étudier la tumeur de cellules croissance et cancer invasion^6,7,8. Cependant, la plupart des systèmes 3D ne sont pas adaptés aux formats à haut débit, et interaction entre sphéroïde habituellement ne peut être atteints depuis sphéroïdes individuels isolés sont générés à chaque micro puits⁹. Des études récentes portant sur la migration du cancer reposent sur des dispositifs microfluidiques^3,10,11,12, cependant, ces complexes microfluidique outils sont difficiles à produire et ne peut pas servir à haut débit (HTS) de dépistage des drogues anti-invasives.

Deux principaux phénotypes, migration des cellules individuelles et collectives, qui jouent un rôle dans les cellules tumorales, surmonter l’obstacle de l’ECM et envahissent les tissus voisins, ont été démontrées^13,14, chaque affichage distinct morphologiques caractéristiques, les mécanismes biochimiques, moléculaires et génétiques. En outre, les deux formes de migration des cellules tumorales, fibroblastes-like et amiboïdes, sont observées dans chaque phénotype. Depuis les deux phénotypes de l’invasion et les modes de migration, sont principalement définies par les propriétés morphologiques, il y a un besoin pour cellulaires modèles qu’activer la détection basée sur l’imagerie et l’examen de toutes les formes de l’invasion tumorale et la migration des cellules.

L’objectif global de la méthode actuelle doit fournir un système de biomimétique simple et reproductible 3D in vitro sur les cellules pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Ici, nous introduisons la plaque d’imagerie basée sur HMCA 6 puits de recherche sur l’invasion tumorale et de la thérapie anti-métastatique. Cette technologie permet la formation d’un grand nombre des sphéroïdes de tumeur 3D uniforme (450 / puits) dans une structure de micro-chambres (MC) d’hydrogel. Divers composants de l’ECM sont ajoutés au tableau sphéroïde pour permettre l’invasion des cellules dans le milieu environnant. Processus d’invasion est surveillée de façon continue par l’observation des cellules individuelles sphéroïdes/envahir même court et long terme et facilite la caractérisation morphologique, coloration fluorescente et récupération des sphéroïdes spécifiques à tout moment. Puisque les sphéroïdes nombreux partagent l’espace et médium, interaction par l’intermédiaire de molécules solubles sphéroïdes individuels et leur impact sur l’autre est possible. Analyse d’images semi-automatique est effectué au moyen de code interne de MATLAB qui permet une collecte plus rapide et plus efficace de grandes quantités de données. La plateforme facilite la mesure précise et simultanée de nombreuses cellules sphéroïdes/envahir temps-efficacement, permettant le criblage de débit moyen des médicaments anti-invasion.

Protocol

1. HMCA plaque de gaufrage

Remarque : Le processus complet pour la conception et la fabrication du timbre de polydiméthylsiloxane (PDMS) et plaque d’imagerie HMCA utilisé dans le présent protocole est décrit en détail dans notre précédent article^15,16. Le timbre PDMS (forme négative) sert à gaufrer le HMCA (forme positive) qui se compose d’environ 450 MCs / puits (Figure 1 a). Comme le montre la Figure 1 b, chacune des MCs a une forme d’une pyramide tronquée de forme carrée à l’envers (hauteur : 190 µm, petite surface de base : 90 µm x 90 µm et grande surface de base : 370 µm x 370 µm). La plaque HMCA est utilisée pour la préparation et la mise en culture des sphéroïdes 3D tumeur et par la suite, pour l’analyse de l’invasion. Par ailleurs, un timbre commercial pourrait servir pour la production de HMCA.

1. Préparer une solution de 6 % d’agarose fusion faible (CGL). Insérez la poudre LMA salin stérile tamponnée au phosphate (PBS) (0,6 g de CGL pour 10 mL de PBS) dans une bouteille en verre avec un agitateur magnétique. Placer la bouteille sur une plaque chauffante et agiter la solution tout en chauffage à 80 ° C pendant quelques heures jusqu'à l’obtention d’une solution uniforme. Conserver la solution à 70 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. Pré-chauffer le timbre PDMS à 70 ° C dans le four. Garder au chaud jusqu'à l’utilisation. Vous pouvez également utiliser un timbre commercial et suivez les instructions.
3. Placez les plaques de fond en verre 6 puits commercial sur un bain sec préchauffé à 75 ° C. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que la plaque est totalement chaude.
4. Versez une goutte (400 µL) de LMA préchauffé sur le fond de verre de chacun des puits de la plaque. Placez délicatement le timbre PDMS préchauffé sur la goutte de gel d’agarose. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 – 10 min pour la gélification et refroidissement préalable. Incuber à 4 ° C pendant 20 min atteindre la pleine d’agarose gélification. Ensuite, décollez délicatement le PDMS, laissant le gel d’agarose à motifs avec MCs.
   Remarque : Cette étape se faite simultanément dans tous les puits.
5. Placer la plaque en relief dans un système équipé de lampe ultraviolette (UV) à lumière et incuber pendant 3 min.
   Remarque : La plaque HMCA est maintenant UV stérilisé.
6. Remplir les puits-macro avec du PBS stérile pour s’assurer qu’ils sont maintenus humides, puis la plaque de recouvrement, l’envelopper avec du parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
7. Avant utilisation, vider les résidus de PBS de la plaque HMCA. Placez-le dans la hotte biologique.

2. chargement de cellules et la Formation sphéroïde

1. Recueillir les cellules comme suit : supprimer tout moyen d’une monocouche de cellules de plaque de culture 10 cm, laver deux fois avec 10 mL de PBS, afin de disposer des résidus de sérum, ajouter 5 mL de trypsine (préalablement chauffée à 37 ° C) et incuber pendant 3 min dans l’incubateur à 37 ° C. Ensuite, secouez la plaque doucement pour s’assurer que le détachement de la monocouche, ajouter 10 mL de milieu complet (préalablement chauffé à 37 ° C) et la pipette de haut en bas jusqu'à ce que la suspension cellulaire homogène est obtenue. Centrifuger et laver la suspension cellulaire avec 15 mL de milieu frais, puis, suspendre à des concentrations appropriées dans un milieu frais complet.
2. Charger doucement la suspension cellulaire (50 µL, 150-360 x 10³ cellules/mL dans le milieu, ~ 16 – 40 cellules par MC) sur le dessus de la HMCA et laisser les cellules à régler par gravité pendant 15 min.
3. Doucement, ajoutez 6 à 8 portions de 500 µL de milieu frais (total 3 à 4 mL) jusqu’au bord du puits de macro en plastique fond en dehors du ring et hydrogel tableau.
4. Incuber les cellules HeLa pendant 72 h et cellules MCF7 pendant 48 h à 37 ° C et 5 % de CO_2, dans une atmosphère humidifiée pour la formation des sphéroïdes.

3. viabilité détection par l’iodure de Propidium (PI) coloration

1. Préparer une solution de PI (500 µg de PI par 1 mL de PBS). Conserver à 4 ° C pour environ 6 mois. Fraîchement, préparer une dilution de 1:2,000 (0,25 µg/mL), par l’addition de 6 µL de stock à 12 mL de milieu complet sans rouge de phénol, de la plaque HMCA de 6 puits (2 mL / puits).
2. Transférer la plaque HMCA avec sphéroïdes de 48 à 72 heures, de l’incubateur à la hotte biologique. Supprimer tous les moyen du HMCA en vous penchant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique à côté de la baie d’hydrogel, laissant le réservoir tableau rempli de milieu.
3. Doucement ajouter 2 mL de la dilution de la PI d’étape 3.1 dans chaque puits, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique. Incuber la plaque HMCA pendant 1 h à 37 ° C et 5 % CO₂, dans une atmosphère humidifiée. Passez à l’étape 7.
   Remarque : Autres colorants peuvent être utilisés ici même, par exemple, Hoechst pour noyau la souillure, tétraméthylrhodamine méthylester (TMRM) pour le potentiel de membrane mitochondrial coloration, fluorescéine diacétate (FDA) pour la détection des cellules vivantes, Annexin V pour l’apoptose détection et autres.

4. préparation de mélange collagène

1. Préparez l’eau bidistillée stérile (DDW) en autoclave et un stock de 100 mL d’une solution stérilisée par filtration de NaOH 1 M. Maintenir les matériaux RT, et les conseils pour la préparation de mélange collagène congelée à-20 ° C, jusqu'à l’utilisation.
2. 10 – 20 min avant utilisation, placer tous les intermédiaires dont : stérile DDW, solution stérile de 1 M de NaOH, stérile 10 x PBS, du collagène type I de queue de rat (conservés à 4 ° C pendant 3-mois) et un tube stérile dans le bac à glaçons jusqu'à ce que totalement refroidi. Placez le bac à glaçons à l’intérieur de la hotte biologique.
3. Préparer 1 800 µL du mélange de collagène à une concentration finale de 3 mg/mL, plaque 6 puits HMCA invasion assay (300 µL / puits) comme suit. Ajouter les intermédiaires dans le tube de refroidissement dans l’ordre suivant : 515 µL de DDW, 24,8 µL de 1 NaOH M et 180 µL de PBS 10 x. Mélangez bien en vortex et place dans la glace. Enfin, ajouter 1080 µL de collagène dans le mélange, vortex à nouveau et remettre dans la glace.

5. HA et préparation de mélange collagène

1. Dissoudre 10 mg de HA dans 2 mL de DDW stérile. Incuber le mélange à ta pendant quelques minutes et vortex doucement jusqu'à ce que la poudre se dissout totalement. Stocker la solution-mère à 4 ° C jusqu'à deux ans.
2. Juste avant utilisation, placer la solution HA dans le bac à glaçons à l’intérieur de la hotte biologique.
3. Préparer un 3 mg/mL de mélange collagène tel que décrit à l’étape 4. Ajouter 36 µg (7,2 µL) d’HA dans 1 800 μL de prêt à l’emploi de mélange de collagène, pour une concentration finale de 20 µg/mL. Puis, vortex à nouveau brièvement et mettre de nouveau dans la glace.

6. ECM mélange ajout

1. La plaque HMCA, à sphéroïde de 48 à 72 h, de transfert de l’incubateur dans la hotte biologique et placez-le sur la glace. Incuber pendant 10 min jusqu'à ce que la plaque est refroidie. Préchauffer une solution de 1 % CGL à 37 ° C dans un bain d’eau.
2. Supprimer tous les moyen d’autour de la HMCA, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique à côté de la baie d’hydrogel. Puis, très soigneusement, enlever toutes les moyennes du réservoir tableau avec un fin pointe/gel chargement astuce, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du tableau, lentement et doucement sucer tous support sur.
   Remarque : Après avoir enlevé tous les moyen d’autour de la baie d’hydrogel, le réservoir tableau est toujours rempli de moyen. Ce support doit être retirée très doucement afin d’éviter la destruction de l’hydrogel MC et dislocation des sphéroïdes.
3. Prenez 150 µL du mélange collagène ou HA et le collagène (mélange de ECM) avec la pointe fine surgelée et ajouter dans le réservoir de tableau en joignant la pointe vers le bord du tableau. Communiqué le mélange lentement pour éviter la dislocation de l’ellipsoïde. Répétez cette étape avec une autre partie aliquote de 150 µL, pour un total de 300 µL / puits. Suivez la même procédure pour chaque puits jusqu'à ce que tous les puits sont remplis. Puis placer la plaque dans l’étuve pendant 1 h pour la gélification complet de l’ECM.
4. Après la gélification pleine d’ECM est parvenue, distribuer 400 µL de préchauffé 1 % LMA surface du gel de l’ECM. Couvrir la plaque avec son couvercle, incuber la plaque à RT pour 5 à 7 min, puis pendant 2 min à 4 ° C, pour la gélification de l’agarose. Enfin, doucement ajouter 2 mL de milieu complet en vous penchant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique.
   Remarque : La couche de gel d’agarose empêche le détachement de la matrice de collagène-gel de la HMCA.

7. analyse et Acquisition de dosage invasion

1. Charge la plaque de HMCA sur un moteur inversé des microscopes équipés d’un incubateur, réglé à 37 ° C, 5 % de CO₂ et atmosphère humidifiée.
2. Déterminez avant les positions pour l’acquisition d’images dans chaque bien afin de couvrir la zone de l’intégralité du tableau et utilisent 10 X ou 4 X objectifs (cette étape est requise pour le logiciel d’acquisition image utilisé ici, consultez la Table des matières ci-dessous pour plus de détails). Également utiliser n’importe quel logiciel d’acquisition image pour faciliter le balayage automatique de toute la zone requise, en choisissant la « Stich » option.
3. Acquérir des images de champ lumineux (BF) toutes les 2 à 4 h pour une durée totale de 24 à 72 h pour suivre l’invasion des cellules de l’organisme de sphéroïde dans l’ECM environnante.
4. Acquisition d’images fluorescentes pour la détection de PI en utilisant un cube fluorescent dédié (excitation filtre 530 – 550 nm, miroir dichroïque 565 nm long col et émission filtre 600-660 nm).
5. Exporter des images BF/fluorescent Time-lapse de logiciel d’acquisition de l’image et enregistrer au format de fichier étiqueté d’image (TIFF) dans un dossier dédié à l’aide de l’onglet « Base » dans la barre d’outils, puis sur le bouton « Exporter les fichiers d’enregistrement » .
   NOTE : Nous avons développé un code spécial analyse interne dans le logiciel MATLAB qui inclut une interface utilisateur graphique conçue (GUI) dans lequel invasion analyse pourrait être exécuté plus rapidement et plus facilement. Dans cette analyse de code, la segmentation des sphéroïdes et zone d’invasion se faite semi-automatique à l’aide de filtre de Sobel suivie par les opérateurs morphologiques, l’érosion et dilatation. Après la segmentation automatique des zones, corrections manuelles ont été faites au besoin pour une meilleure précision. Après l’achèvement de la segmentation, un ensemble de paramètres ont été automatiquement calculé par le logiciel et exporté vers un fichier excel pour autre manipulation. La liste des paramètres sont : aire de la section base de sphéroïde au moment = 0, zone d’invasion des cellules reliée au corps du sphéroïde = invasion principale, quartier des cellules séparées de la zone principale d’invasion, nombre de cellules séparée de la zone principale d’invasion, la distance moyenne de invasion de la base sphéroïde Centre de masse à la circonférence de la zone principale d’invasion, les cellules séparées et les paramètre de distance collective invasion = d (d = √ ((X₂ - X₁)² + (Y₂ - Y₁)²) de la Des coordonnées X et Y sphéroïde Centre de masse, avant (X₁, Y₁) et après (X₂, Y₂) processus d’invasion collective). Alternativement, analyse d’image pourrait être fait avec n’importe quel autre logiciel spécialisé.
6. Ouvrez l’interface utilisateur et appuyez sur le bouton « Load BF » . Une fois l’image ouverte, ajustez les paramètres de segmentation (taille minimale : > 1 et rayon à proximité : > 1) pour réaliser une segmentation précise de sphéroïde et sa zone d’invasion, puis, appuyez sur « Région de segmentation d’intérêt (ROI) » pour l’exécution et une bordure apparaît autour de chaque sphéroïde. Si la segmentation automatique est incorrecte, appuyez sur le bouton « Supprimer » ou « Ajouter » et apporter les correctifs requis manuellement. Répétez les mêmes étapes pour les images suivantes.
7. Appuyez sur le bouton « Tracking » de numéroter les sphéroïdes et le logiciel va attribuer le même numéro pour chaque ellipsoïde dans chacune des images de laps de temps. Puis, appuyez sur le bouton « Mesure » qui va générer une feuille de calcul avec tous les paramètres. Sauvegarder cette feuille de calcul dans un fichier excel pour une utilisation dans le traitement des résultats et statistiques dans excel logiciel.

Representative Results

L’unique HMCA plaque d’imagerie est utilisée pour le dosage de l’invasion des sphéroïdes tumeur 3D. L’analyse entière, commençant par la formation sphéroïde et finissant avec le processus d’invasion et les manipulations supplémentaires, est réalisée au sein de la même plaque. Pour la formation sphéroïde, cellules HeLa sont chargés dans le bassin de la baie et s’installer dans l’hydrogel MCs par gravité. L’hydrogel MCs, qui présentent des caractéristiques non adhérent/faible attachement, faciliter l’interaction cellule-cellule et la formation des sphéroïdes tumeur 3D. La figure 2 illustre les cellules se sont installés dans le MCs, suite à l’utilisation de 150 x 10³ cellules/mL de la solution de chargement (i.e., ~ 16 cellules par MC valeur calculée). Il est clair que le taux d’occupation des cellules par MC n’est pas également répartie à travers le tableau et la distribution de la moyenne statistique obtenue est 14,78 ± 3.60 cellules par MC. Le tableau Figure 2 b résume la distribution cellulaire par MC pour une plaque entière de HMCA. Le coefficient moyen de variation (CV) de la distribution de cellule dans une macro-puits est 43,33 %, alors qu’entre les macro-puits il est 24,37 %. Les différences dans l’occupation de la cellule sont cruciales et dictent directement la taille des sphéroïdes formés et leur homogénéité tout au long de la plaque. Afin de réduire ou de minimiser la variabilité créée par le nombre de cellules par MC, l’analyse des résultats est réalisée à élément simple résolution. Les parcelles en Figure 2-D illustrent la distribution des sphéroïdes de 3 jours (aire de la section). Elle est clairement illustrée en Figure 2D que le calcul du ratio de la croissance de chaque sphéroïde (aire de la section à 3/jour 2) a une répartition plus homogène que la distribution de la taille absolue (Figure 2), ce qui donne un CV de 15,48 % et 52,80 % respectivement. Distribution des diamètres sphéroïde des sphéroïdes 3 jours donne un CV de 24,52 % et le taux de croissance (diamètre à jour 3/jour 2) est de 7,45 %. Ces valeurs de CV sont similaires à¹⁷ ou plus élevé que les¹⁸ autres rapports pour atteindre cellule de chargement par gravité. Afin d’éliminer la variation du paramètre mesuré résultant de la variabilité du nombre de cellules ensemencées initial par MC, il est préférable de normaliser les paramètres sélectionnés pour le nombre de cellule initiale ou à tout autre paramètre mesuré ayant le même objet, telle que chaque ellipsoïde a son contrôle interne. Cette approche pourrait être appliquée facilement grâce au suivi de l’objet sur la plaque d’imagerie HMCA.

Le processus de formation sphéroïde et la croissance pourrait facilement être suivi sur le HMCA plaque d’imagerie. Figure 3 a-B montre une image BF d’une région sur la HMCA d’imagerie plaque contenant des agrégats de cellules HeLa 24h et l’image respective de mature, 5–journée multicellulaires objets 3D, qui sont de plus en plus sphérique et plus dense. Il est clairement démontré que la plupart des objets conservent leur position au cours de la période d’incubation de 5 jours. L’analyse de formes (sphéricité) et taille (aire de la section) au cours de la formation sphéroïde est présentée en Figure 3. Le diagramme montre les augmentations dans les deux paramètres du jour 1 au jour 5 ; 0.544 ±0.020 a.u. 0.684± a.u. 0,016 de sphéricité (p < 0,05) et 0.00356± 0,00013 mm² à 0.00538 ±² mm 0,00015 pour aire de la section (p < 0,05), respectivement. Alors que 24 h agrégats sont petites et ont forme non régulière, les sphéroïdes 5 jours respectifs sont plus grandes et acquièrent la forme sphérique.

La détection de la viabilité cellulaire sphéroïde est exécutée à l’aide de faible concentration PI pour la coloration des¹⁹ qui contourne la nécessité pour le lavage du colorant. PI pénètre la membrane cellulaire et ensuite s’intercale dans l’ADN des cellules non viables. Figure 4 a montre des sphéroïdes de HeLa 5 jours tachés de PI (en rouge). Analyse du pourcentage de la zone rouge (qui représente les cellules mortes) de chaque aire de la section sphéroïde est résumée dans la Figure 4 b. L’histogramme montre que 85 % de la population de sphéroïde dispose d’un espace de valeur maximale de 5 % de rouges colorée et la moyenne est de 3,01 ± 2,34 % (histogramme de gauche). Aire de la section des sphéroïdes (histogramme droite) montre une distribution normale avec une moyenne de 0.02447 ± 0,00487 mm².

Après avoir produit des sphéroïdes HeLa matures de 3 jours, l’analyse de l’invasion est réalisée au sein de la HMCA plaque d’imagerie. L’effet de variables, telles que la composition, les inhibiteurs et activateurs, ECM sur le processus d’invasion tumorale 3D sphéroïde ont pu être examiné. Pour les performances du test invasion, le support est doucement enlevé et remplacé avec la pipette de solution ECM sur les sphéroïdes dans le bassin de tableau MC. Après la gélification complète de la solution ECM, milieu complet est ajouté dans le puits de macro. (1) afin d’examiner l’influence des HA sur le processus d’invasion spontanée de sphéroïde HeLa, les sphéroïdes ont été recouvertes de collagène et de la solution de mélange HA (Figure 5 a) et comparés à ceux recouverts de la seule solution de collagène (Figure 5), et BF images ont été acquises après gélification ECM (t = 0 h). La cinétique des processus d’invasion a été suivie par les mêmes régions toutes les 5 h d’imagerie pendant 63 h. Après 50 h d’incubation, les sphéroïdes incorporé dans le collagène et HA (Figure 5 b) ont montré plus faible dispersion de cellule dans l’ECM avoisinante contre les sphéroïdes incorporé dans le collagène seulement (Figure 5). L’analyse de la zone d’invasion cinétique au fil du temps, pour 99 sphéroïdes à résolution de single-sphéroïde est résumée dans la Figure 5E. Figure 5E parcelles de la zone moyenne/moyenne invasion au fil du temps des deux groupes et démontre clairement que l’ajout de HA au collagène inhibe la dispersion de la cellule de l’ellipsoïde, aboutissant à des zones plus petites d’invasion. La moyenne des pentes résultant de courbes de régression linéaire ajustement pour chacun des sphéroïdes incorporés dans le collagène (0.001973 ± 0,000894 mm2/h) par rapport à la solution HA (0.001410 ± 0,000941 mm2/h) et de collagène sont significativement différents (p = 0,003, t-test : deux échantillons les variances égales). (2) afin d’examiner l’influence de la fisétine (un flavonoïde bioactif trouvés dans plusieurs fruits et légumes qui montre les activités cytostatiques et migrastatic en agissant sur plusieurs cibles moléculaires notamment la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / Akt/c-Jun N-terminal kinases (JNK) signalisation Wnt/β-caténine signalisation entraîne métalloprotéinases (MMP) et autres²⁰) sur le processus d’invasion spontanée de sphéroïde HeLa, augmentation des concentrations du médicament ont été ajoutées au milieu complet et BF images ont été acquises à t = 0 (Figure 6 a) et 24 h plus tard (Figure 6 b- C). Comme l’a démontré, 10 µM de fisétine (Figure 6) empêche la dispersion des cellules autour des sphéroïdes comparativement aux non traitées des sphéroïdes de HeLa (Figure 6 b). Analyse de la zone de l’invasion d’une expérience de réponse dose (Figure 6) exhibe une inhibition significative à 10-40 µM de fisétine (p < 0,003), réalisation de saturation à la concentration de 10 µM et plus. (3) il a été démontré que non, à un niveau de nano-molaire, contribue à un phénotype plus agressif de cancer du sein par stimulant tumeur extension et migration de¹⁶. Afin d’examiner l’influence des N° sur le processus d’invasion collective des sphéroïdes MCF7 incorporé dans le collagène, 1 µM de donneur d’oxyde nitrique/diéthylènetriamine (DETA/NO) a été ajouté au milieu de culture complet et BF images ont été acquises à t = 0 et t = 20 h. dramatique changements dans la morphologie et les emplacements des sphéroïdes 3D pendant l’exposition à aucun donneur sont évidents (Figure 7 a-B). Les sphéroïdes perdent leur sphéricité et devient plus allongées acquisition phénotype migrateur amiboïde. En même temps, renforcée translocation des sphéroïdes dans la matrice de collagène avoisinantes a été observée (Figure 7). La valeur de l’allongement moyen significativement augmentée de 1.305 ± 0,193 a.u. à 1.477 ± 0,298 a.u., (p < 0,0006). La distance de migration moyenne mesurée pour les sphéroïdes mêmes a été considérablement élargi, ± 0.0788 0,0575 mm et 0.3164 ± 0,3365 mm en l’absence et en présence de DETA/NO, respectivement (p < 4 x 10^-6).

Analyse d’images de l’invasion de sphéroïde fut réalisée par semi-automatique propre logiciel MATLAB. Les acquis des images de formation sphéroïde et invasion dans le HMCA se compose de nombreux sphéroïdes en une seule image (4-6 sphéroïdes à un grossissement de X 10 et 25-30 sphéroïdes à un grossissement de X 4). L’analyse de formation sphéroïde, la croissance et l’invasion s’est déroulée en même temps sur tous les sphéroïdes dans l’image. Les paramètres clés extraits pour l’invasion de l’ellipsoïde sont présentés dans la Figure 8 a, qui montre une segmentation de l’image représentative des 4 sphéroïdes à un seul moment (t = 16 h). La zone d’invasion principale définie par une bordure rouge, ainsi que les cellules séparées qui débrayé et dispersée autour d’elle (indiqué par des flèches noires), ont été suivis et numérotées pour chaque sphéroïde au fil du temps. Taille de sphéroïde avant invasion à t = 0 est défini par une bordure bleue. La distance de moyenne/moyenne invasion entre sphéroïde Centre de masse et la circonférence de zone d’invasion dont les cellules séparées est calculée à partir de la segmentation rouge encerclée et indiquée par les flèches jaunes. Les données extraites de cette expérience en Time-lapse sont résumées dans la Figure 8 b-D. Figure 8 b montre l’élévation de la distance moyenne invasion de chaque centre de sphéroïde au fil du temps. La figure 8 montre l’élévation de la zone d’invasion totale dans chacun des sphéroïdes au fil du temps (y compris la zone principale d’invasion et séparés/désengagé-cellule). Figure 8 _1-4 montre l’ampleur de la zone de cellules séparées par rapport à la zone d’invasion totale de chaque sphéroïde (au fil du temps). Le nombre total de cellules débrayage est de 33, 7, 4 et 5 pour les sphéroïdes #1, #2, #3 et #4, respectivement. L’analyse d’un nombre cumulatif de cellules désengagés sur une période de 20 h d’invasion provenant de 126 HeLa sphéroïdes incorporée dans le collagène est montré en Figure 8F. On démontre ici qu’il y a une vaste distribution du nombre de cellules désengagés dans la population étudiée et la valeur moyenne est de 12,3 ± 12,8 cellules.

Figure 1 : The HMCA plaque d’imagerie. (A) l’Image d’un macro-puits HMCA en relief. (B) une section transversale d’une MC dans la HMCA plaque d’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : homogénéité de la ratio de croissance cellulaire distribution et sphéroïde dans la HMCA plaque d’imagerie. (A) une superposition de BF et images fluorescentes de la HMCA équipé de cellules HeLa pré-teint avec Hoechst 33342 1 µg/mL (concentration 150 x 10³ cellules / mL de charge). Des images ont été acquises juste après le règlement de cellules dans le grossissement de l’Image MC. 4 X, section Echelle = 500 µm. (B) le tableau résume la répartition des cellules HeLa dans la plaque d’imagerie HMCA-6 puits. Les cellules ont été comptés jusqu'à 90 MC/macro-puits. Les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type (SD), CV (SD/mean100) est calculée au sein et entre les macro-puits. (C) histogramme de la Distribution de l’aire de la section des sphéroïdes de 3 jours, n = 418, déterminé à partir des images BF. (D) histogramme de la Distribution du rapport croissance sphéroïde (aire de la section à 3/jour 2). Taux de croissance est calculé à élément simple résolution pour chacun des 418 sphéroïdes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : suivi de formation sphéroïde dans le HMCA d’imagerie plaque. Image BF de cellules HeLa (concentration 120 x 10³ cellules / mL de charge) incubés dans la HMCA pour 1 jour (A) et 5 jours (B). Grossissement 4 X, la barre d’échelle d’image = 500 μm. Nuages de points (C) terrain de sphéricité objet 3D en fonction de son aire de la section, après 1 journée (diamants bleus) et 5 jours (carrés bruns) de chargement de cellule pour le poste d’incubation. Chaque marque représente l’ont analysé les données d’un sphéroïde unique, n = 83. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : détection de la viabilité cellulaire en sphéroïdes matures. Une superposition de BF et images fluorescentes des sphéroïdes de 5 jours (concentration 360 x 10³ cellules / mL de charge) colorent avec PI 0,25 µg/mL (A). Grossissement 4 X, la barre d’échelle d’image = 500 µm. (B) histogramme de répartition pour cent de la zone de PI par rapport à l’aire de la section de l’ellipsoïde (panneau de gauche) et histogramme de distribution de l’aire de la section (panneau de droite), n = 84. Pour cent de la superficie de PI est calculé à élément simple résolution pour chacun des 84 sphéroïdes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Influence de la composition de ECM sur le processus d’invasion de sphéroïde. Images BF des sphéroïdes HeLa 3 jour intégrées dans un mélange de collagène 3 mg/mL et 20 µg/mL HA (A) et 3 mg/mL de collagène (C), à t = 0 h et après 50 h d’incubation (B) et (D), respectivement. Image de grossissement 10 X, section Echelle = 200 µm. La HMCA plaque d’imagerie a été chargé sur la scène du microscope inversé équipé d’incubateur. Les images ont été acquises toutes les 5 h et l’analyse cinétique est présentée dans l’intrigue (E), n = 99. Chaque courbe représente la moyenne ± et d’augmentation de secteur d’invasion au fil du temps, de collagène et HA (diamants bleus) et de collagène seulement (carrés bruns). Courbe de régression linéaire moyenne et son équation et R² sont indiqués au-dessus des courbes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : fisétine inhibe l’invasion spontanée des sphéroïdes HeLa. Images BF des sphéroïdes de 3 jours de HeLa, intégrées dans un mélange de collagène de 3 mg/mL (A) à t = 0, puis, 24h après l’addition de 0 µM (B) et 10 µM fisétine (C) au milieu de culture complet. Grossissement 4 X, la barre d’échelle d’image = 500 µm. l’analyse de la zone d’invasion pour chaque sphéroïde au point final (t = 24 h) est présenté dans l’intrigue (D), n = 488. La courbe représente la moyenne ± écart-type de la zone d’invasion en fonction de 0 à 40 µM fisétine. Traitement fisétine entrave notablement l’invasion à 10 µM (P = 4,65 x 10^-6), 20 µM (P = 0,0021) et 40 µM (P = 4,86 x 10^-8), à l’aide de t-test : deux échantillons les variances égales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : NO induit une invasion collective en sphéroïdes de cancer du sein MCF-7. Images BF de 2 jour MCF-7 du sein sphéroïdes cancer, incorporés dans le collagène (A) à (t = 0) et (B) après 20 h d’exposition à 1 µM DETA/no. Segmentation du ROI sphéroïde est définie par une bordure rouge, superposée et numérotée en rouge sur les images BF A et B. ROIs définie par une bordure bleue, superposée sur BF image B représentent sphéroïde taille et l’emplacement à t = 0. Grossissement 4 X, échelle = 500 µm. (C) un scatter emplacement de la corrélation entre la distance de facteur et de la migration élongation des sphéroïdes du cancer du sein individuels par l’exposition à 1 µM DETA/aucun (carrés bruns) que par rapport au témoin (diamants bleus) à t = 20 h, n = 54. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : analyse d’images de cellules HeLa invasion spontanée. Images BF des sphéroïdes de HeLa 3 jours, 16 heures après l’incorporation dans le collagène (A). Grossissement 10 X. Zone d’invasion sphéroïde et désengagée des cellules sont définies par bordure rouge, taille de sphéroïde à t = 0 est défini par la bordure bleue, invasion moyenne distance entre sphéroïde Centre de masse est indiqué par les flèches jaunes et débrayage de cellules sont indiquées par des flèches noires. Tracer l’augmentation au fil du temps de la distance moyenne invasion du sphéroïde Centre de masse (B) et de la zone de l’invasion totale (C). Les courbes représentent sphéroïde #1 (diamants bleus), sphéroïde #2 (carrés bruns), sphéroïde #3 (triangles verts) et sphéroïde #4 (Xs violet). (D) la barre graphique des principaux (bleu) et séparés d’augmentation de secteur d’invasion cellulaire (brun) au fil du temps. (E) histogramme de la Distribution du nombre cumulatif de cellules séparées par sphéroïde au cours de 20 h de processus d’invasion, n = 126. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Il est bien documenté que les organismes vivants, caractérisés par leur organisme multicellulaire 3D complexe sont tout à fait distinctes des cellules utilisées monocouche 2D cultivée, en insistant sur la nécessité cruciale d’utiliser des modèles cellulaires qui mieux imitent les fonctions et les processus de l’organisme vivant pour médicament dépistage. Récemment, les sphéroïdes multicellulaires, culture organotypique, organoïdes et organes-on-a-chip ont été introduites⁸ pour l’utilisation dans la découverte de médicaments standardisé. Cependant, grande complexité du modèle 3D multicellulaires compromet considérablement sa robustesse, la parallélisation et l’analyse des données qui sont cruciales pour l’efficacité du test.

Évaluation quantitative de la capacité d’invasion des mesures généralement le mouvement des cellules à travers les matériaux hydrogel. Afin de mesurer l’invasion tumorale à l’aide de plaques de micro-puits traditionnels, un grand nombre de cellules cancéreuses est ensemencé en rond plaques de fond et forcé à s’agréger par centrifugation^21,22. Ces plaques restreint l’interaction cellulaire/sphéroïde adjacents des puits, alors que le fond rond entrave la qualité optique et complique l’acquisition d’images. Dans d’autres méthodes, cellules individuelles encapsulé au hasard au sein de l’hydrogel, croître et fonctionner dans un environnement 3D mais ne développent pas nécessairement en sphéroïdes matures^23,24. En outre, des procédures complexes pour le positionnement de la cellule au sein de l’hydrogel sont tenues, comme base de force magnétique cell patterning²⁵ ou irradiation biphotonique laser des hydrogels bioactifs²⁶.

La technologie HMCA présentée ici s’avère avantageuse par rapport aux méthodes ci-dessus : agrégation de positionnement, spontanée de cellules et de création des sphéroïdes de cellules dispersées quelques peut être facilement réalisée, permettant l’utilisation de précieux cellulaire limité échantillon (e.g., cellules souches du cancer ou cellules primaires provenant des échantillons de patient). Le système a le contrôle sur la nature des cellules qui composent les sphéroïdes ainsi que sur leur emplacement exact dans l’espace au cours d’expériences à long terme. En outre, le fond plat du MC facilite la génération des sphéroïdes nombreuses sur le même plan focal, acquisition rapide d’illumination et de l’image des grandes surfaces par un microscope à champ large est donc possible, éliminant le besoin pour compliqué microscopie confocale chronophage. Le système est facile à manipuler et son caractère pratique possible. En appliquant les procédures opérationnelles simples, nous avons atteint le fort taux d’occupation des populations de sphéroïde dans lequel environ 50 % des sphéroïdes ont des dimensions comparables et une analyse fiable de la capacité d’invasion des cellules du cancer. En outre, l’effet des drogues sur la capacité d’invasion peut être analysé simultanément avec leurs effets cytostatiques ou cytotoxiques en utilisant haute teneur analyse approche avec dispositif HMCA cultivé avec nombreux sphéroïdes. En outre, dans le HMCA, tous les éléments cellulaires partagent le même espace et moyen, ce qui permet d’étudier l’interaction sphéroïde-sphéroïde qui est véhiculée habituellement par les cytokines sécrétées à la cellule, les chimiokines, les hormones et l' ECM²⁷. Cette diaphonie facilite la survie et la fonction des agrégats cellulaires cellules individuelles/petite macro-puits volume.

Une étape cruciale dans l’exécution du protocole est l’addition d’ECM mélange sur le dessus les sphéroïdes et valider sa polymérisation correcte. Les sphéroïdes n’affichera pas de comportement migrateur même si elles sont intégrées au sein de l’ECM, à moins que l’Assemblée et la réticulation se produisent, et les fibres de collagène appropriées sont formés. Les fibres de collagène peuvent être observées par l’illumination de BF, et nous vous conseillons de vérifier la plaque sous microscope pour confirmer la création de fibres de collagène à la fin de cette phase. Puisque le nombre des sphéroïdes est dépend de la concentration cellulaire initial et le pourcentage d’occupé MCs, le tableau doit être vérifié après le chargement de la cellule initiale et si l’occupation de la cellule n’est pas optimale, le réensemencement du même tableau peut être effectué. En effet, la taille et la géométrie de la HMCA décrit ci-après ont été conçus pour accueillir des groupes relativement petites cellules (jusqu'à 150 µm de diamètre). Cela pourrait être considéré comme une limitation étant donné que la conception d’un nouveau type de tableau sera nécessaire pour l’analyse de la migration cellulaire de plus grandes structures de la cellule.

La plateforme actuelle utilise le nombre minimal de cellules et le réactif petit volume, tout en apportant un grand échantillon (en milliers de sphéroïdes par plaque). Afin d’analyser les 12 différents composés pour l’activité anti-métastatique, 2 plaques HMCA basé 6 puits unique serait nécessaires, ce qui donne les résultats d’environ 5 000 sphéroïdes, alors qu’au moins cinquante plaques de 96 puits seraient nécessaires pour atteindre les mêmes résultats. La capacité d’analyser les migrations à résolution d’individu-objet dans le HMCA fournit un niveau élevé de statistique robustesse et précision, permettant l’étude de l’hétérogénéité structurelle et fonctionnelle invasion nombreux sphéroïdes.

Cette étude illustre particulièrement bien l’invasion collective des populations de sphéroïde cancer du sein par l’exposition à DETA/no Les grappes de cellules des cellules MCF7 montrent amiboïde phénotype migrateur, et des changements quantitatifs dans la morphologie et l’emplacement de chaque ellipsoïde peuvent être obtenus automatiquement. Au meilleur de notre connaissance, c’est le premier système qui facilite la surveillance et l’analyse du collective invasion dans les nombreuses structures 3D. En analysant les indications relatives et la distance d’invasion pour chaque sphéroïde, il est possible d’étudier l’interaction mutuelle entre sphéroïde au sein de la population. En outre, l’influence établie des facteurs extracellulaires microenvironnement le cancer cell comportement²⁸ est illustrée ici. Parmi ces facteurs, la rigidité et la composition du microenvironnement s’est avéré fortement influencer la migration cellulaire. La technologie HMCA offre un défini, biomimétique, in vitro plate-forme, où ces propriétés de l’ECM sont facilement accessibles et contrôlées. La rigidité de pure collagène de type I hydrogel à la concentration de 3 mg/mL, ce qui a été utilisé dans cette étude, est signalé à être environ 50-600 Pa^29,30,31 et l’ajout de HA (20 µg/mL ; 0,4 % en poids) n’a pas changé la rigidité de l’hydrogel significativement^32,33. Ainsi, l’effet suppresseur de poids moléculaire moyen (MMW)-HA sur l’invasion des sphéroïdes de HeLa 3D qui a été montrée ici n’est pas en raison des changements de rigidité. Ces résultats sont en accord avec les études précédentes qui ont montré un effet bimodal de HA sur l’invasion des cellules du cancer avec grande dépendance sur HA poids moléculaire^34,35,36,37.

Les applications futures des méthodes incluent juxtaposés multi cellulaire type cultivant de la tumeur et les cellules du stroma dans différentes régions dans le puits de macro et la récupération des sphéroïdes spécifiques pour l’analyse moléculaire en aval.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics