Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Summary

Eine HMCA-basierte Speicherfolie wird für Invasion Testleistung vorgestellt. Diese Platte erleichtert die Bildung von dreidimensionalen (3D) Tumor Sphäroide und die Messung der Krebs Zelle eindringen in die extrazelluläre Matrix (ECM). Die Invasion-Assay-Quantifizierung wird durch halbautomatische Analyse erreicht.

Abstract

Krebsmetastasen ist bekannt, 90 % der Letalität Krebs verursachen. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, der mit der Durchdringung/Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe initiiert. Somit ist Invasion ein entscheidender Schritt in Metastasen, machen die Invasion Prozessforschung und Entwicklung von Anti-metastatischen Drogen hochsignifikant. Um diese Nachfrage zu begegnen, besteht die Notwendigkeit, 3D in-vitro- Modelle zu entwickeln, die die Architektur von soliden Tumoren zu imitieren und ihrer Mikroumgebung am ehesten zu in Vivo Staat auf der einen Seite, aber zur gleichen Zeit werden reproduzierbar, robust und geeignet für hohe Ergiebigkeit und hohe Content Messungen. Derzeit, lehnen die meisten Invasion Assays auf anspruchsvolle mikrofluidischen Technologien, die ausreichend sind für die Forschung aber nicht für hochvolumige Drogen-Screening. Andere Tests mit Platte-basierten Geräten mit isolierten einzelnen Sphäroide in jede Vertiefung sind Material verbrauchen und geringen Stichprobengröße pro Zustand haben. Das aktuelle Protokoll soll eine einfache und reproduzierbare biomimetische zellbasierte 3D-System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide schaffen. Wir entwickelten ein 3D-Modell für Invasion Assay anhand HMCA Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Wirkstoffforschung. Dieses Gerät ermöglicht die Produktion von zahlreichen einheitliche Sphäroide pro Bohrloch (hohe Stichprobengröße pro Zustand) umgeben von ECM-Komponenten, während gleichzeitig und kontinuierlich beobachten und messen die Sphäroide bei einem Element Auflösung für mittlere Durchsatz-Screening von Anti-metastatischen Drogen. Diese Plattform wird hier durch die Produktion von HeLa und MCF7 Sphäroide zur Veranschaulichung einzelne Zelle und kollektive Invasion vorgestellt. Wir vergleichen den Einfluss der ECM-Komponente-Hyaluronsäure (HA) auf die invasive Kapazität von Kollagen um HeLa Sphäroide. Schließlich stellen wir Fisetin (Invasion Hemmer) HeLa Sphäroide und Stickstoffmonoxid (NO) (Invasion Aktivator), MCF7 Sphäroide. Die Ergebnisse werden von Inhouse-Software analysiert die halbautomatische, einfache und schnelle Analyse ermöglicht die Multi-Parameter-Prüfung erleichtert.

Introduction

Krebstod ist vor allem auf die Verbreitung von metastasierenden Zellen an weit entfernten Orten zurückzuführen. Viele Bemühungen in der Krebsbehandlung auf targeting oder verhindern die Bildung von Metastasen Kolonien und das Fortschreiten der systemische Metastasen¹konzentrieren. Krebs Zelle Migration ist ein entscheidender Schritt in der Tumor-Metastasen-Prozess, also die Erforschung von Krebs Invasion Kaskade ist sehr wichtig und eine Voraussetzung zur Suche nach Anti-metastatischen Therapeutika.

Die Verwendung von Tiermodellen als Hilfsmittel für das Studium metastasierten Erkrankung wurde sehr teuer und nicht immer repräsentativ für den Tumor beim Menschen festgestellt. Darüber hinaus beeinflussen die extrazelluläre Mikroumgebung Topologie, die Mechanik und die Zusammensetzung stark Krebs Zelle Verhalten². Da in Vivo Modellen von Natur aus nicht in der Lage zu trennen und so spezifische Parameter, die zu Krebs Invasion und Metastasierung beitragen zu kontrollieren, gibt es eine Notwendigkeit für steuerbare biomimetische in-vitro- Modelle.

Um auf entfernte Organe metastasieren, müssen Krebszellen wandernden und invasive phänotypische Merkmale aufweisen, die für die Therapie ausgerichtet werden können. Da die meisten in-vitro- Krebs Modelle nicht die tatsächlichen Eigenschaften von soliden Tumoren³imitieren, ist es jedoch sehr schwierig, physiologisch relevante Phänotypen erkennen. Darüber hinaus bestimmt die phänotypische Heterogenität, die in den Tumor, besteht die Notwendigkeit für die Analyse von Tumor-Migration bei einem Element Auflösung um Phänotyp gerichtete Therapien, zum Beispiel zu entdecken, indem Sie auf die Metastasen initiieren Zelle Bevölkerung in heterogenen Tumoren⁴.

Die Studie der Zelle Motilität und kollektiven Migration ist in erster Linie in Monolayer-Kulturen der Epithelzellen auf homogene planaren Flächen. Diese konventionellen Zellmodellen für Krebs Zellwanderung basieren auf die Bevölkerung Analyse einzelner Zellen eindringen durch die Membranen und ECM Komponenten⁵, aber in einem solchen System können nicht die Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen werden studierte. Erzeugung von 3D Sphäroide oder über Gerüste Gerüst-freie Mikrostrukturen gilt als eine überlegene bedeutet, den Tumor zu studieren Zelle Wachstum und Krebs Invasion^6,7,8. Jedoch die meisten 3D-Systeme eignen sich nicht zur Hochdurchsatz-Formate und Inter Sphäroid Interaktion kann nicht in der Regel erreicht werden, da in jedes Mikro-gut⁹isoliert einzelne Sphäroide erzeugt werden. Jüngste Studien mit der Krebs-Migration basieren auf mikrofluidischen Geräten^3,10,11,12, jedoch diese anspruchsvolle mikrofluidischen Werkzeuge sind schwer zu produzieren und kann nicht Hochdurchsatz-screening (HTS) von Anti-invasive Drogen verwendet werden.

Zwei wichtigsten Phänotypen, kollektive und individuelle Zellwanderung, die eine Rolle in Tumorzellen die ECM-Barriere zu überwinden und benachbarte Gewebe eindringen wurden nachgewiesene^13,14, jede Anzeige unterschiedliche morphologische Eigenschaften, biochemischen, molekularen und genetischen Mechanismen. Darüber hinaus werden zwei Formen der Migration von Tumorzellen, Fibroblasten-Like und amöboiden, in jeder Phänotyp beobachtet. Da beide Invasion Phänotypen und Migration-Modi, zeichnen sich vor allem durch morphologische Eigenschaften, gibt es eine Notwendigkeit für zelluläre Modelle dieser aktivieren Imaging-basierte Erkennung und Untersuchung aller Formen von Tumorinvasion und Migration-Zellen.

Das übergeordnete Ziel der aktuellen Methode ist eine einfache und reproduzierbare biomimetische 3D in-vitro- Zelle-basiertes System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide zur Verfügung zu stellen. Hier stellen wir die HMCA-basierte 6-Well Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Therapie. Die Technologie ermöglicht die Bildung einer großen Zahl von einheitlichen 3D Tumor Sphäroide (450 pro Well) in einem Hydrogel Mikro-Kammern (MC) Struktur. Die Sphäroid Array ermöglichen das Eindringen der Zellen in der Umgebung sind verschiedene ECM-Komponenten hinzugefügt. Invasion-Prozess wird kontinuierlich überwacht, durch kurz- und langfristige Beobachtung der gleichen Sphäroide/Invasion der einzelnen Zellen und erleichtert Morphologische Charakterisierung, fluoreszierende Färbung und Abruf von spezifischen Sphäroide an jedem beliebigen Punkt. Da zahlreiche Sphäroide Raum und Medium teilen, ist die Interaktion über lösliche Moleküle zwischen einzelnen Sphäroide und deren Auswirkungen auf den anderen möglich. Semi-automatische Bildanalyse erfolgt über hauseigene MATLAB-Code schneller und effizienter Sammlung von großen Datenmengen ermöglicht. Die Plattform ermöglicht präzise, gleichzeitige Messung von zahlreichen Sphäroide/eindringenden Zellen Zeit effizient zu nutzen, so dass mittleren Durchsatz Screening von Anti-Invasion Drogen.

Protocol

(1) HMCA Platte Prägung

Hinweis: Der komplette Prozess für die Konstruktion und Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel und HMCA Speicherfolie verwendet in diesem Protokoll wird im Detail in unserem vorherigen Artikel^15,16beschrieben. PDMS-Stempel (Negativform) wird verwendet, um die HMCA (positive Form) prägen besteht aus rund 450 MCs pro Bohrloch (Abbildung 1A). Wie in Abbildung 1 bgezeigt, die MCs jeweils eine Form einer abgeschnittenen Kopf quadratische Pyramide (Höhe: 190 µm, kleine Grundfläche: 90 µm X 90 µm und große Grundfläche: 370 µm X 370 µm). Die HMCA-Platte ist für die Vorbereitung und Kultivierung von 3D Tumor Sphäroide und danach für Invasion Assay verwendet. Alternativ könnte ein kommerzielle Stempel für HMCA Produktion verwendet werden.

1. Bereiten Sie eine Lösung von 6 % niedrig schmelzende Agarose (LMA). Legen Sie die LMA Pulver und sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (0,6 g LMA pro 10 mL PBS) in einer Glasflasche mit einem Magnetrührer. Stellen Sie die Flasche auf eine Heizplatte und rühren Sie die Lösung beim Erwärmen auf 80 ° C für ein paar Stunden, bis eine einheitliche Lösung erreicht wird. Halten Sie die Lösung bei 70 ° C bis zur Verwendung.
2. Vorheizen des PDMS-Stempels auf 70 ° C in den Ofen. Halten Sie warm bis zur Verwendung. Alternativ verwenden Sie einen kommerziellen Stempel und folgen Sie den Anweisungen.
3. Legen Sie die kommerzielle Glasboden 6-Well-Platten auf ein trockenes Bad auf 75 ° c vorgewärmt Warten Sie einige Minuten, bis die Platte ganz warm ist.
4. Geben Sie einen Tropfen (400 µL) des vorgewärmten LMA auf den Glasboden eines jeden von den Brunnen in der Platte. Sanft lege den vorgewärmten PDMS-Stempel über die Agarose-Tropfen. Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 5 – 10 min für Pre-Gelier- und Vorkühlen. Inkubieren Sie bei 4 ° C für 20 min, volle Agarose Gelierung zu erreichen. Dann ziehen Sie vorsichtig die PDMS, verlassen das Agarosegel mit MCs gemustert ab.
   Hinweis: Dieser Schritt erfolgt gleichzeitig in den Brunnen.
5. Die geprägte Platte in eine lichthärtende System mit ultravioletten (UV) Lampe, und 3 min inkubieren.
   Hinweis: Jetzt ist die HMCA Platte UV-sterilisiert.
6. Füllen Sie die Makro-Brunnen mit sterilen PBS um sicherzustellen, dass sie feucht gehalten werden dann die Abdeckplatte, wickeln Sie es mit Parafilm und bis zur Verwendung bei 4 ° C lagern.
7. Vor dem Gebrauch leeren Sie PBS Residuen aus der HMCA-Platte. Legen Sie es in der biologischen Haube.

2. Laden Zellen und Sphäroid Bildung

1. Sammeln die Zellen wie folgt vor: Entfernen Sie alle Mittel aus einer 10 cm Kultur Platte Zelle Monolage, waschen zweimal mit 10 mL PBS Serum Residuen entsorgen, 5 mL Trypsin (vorgewärmt auf 37 ° C) hinzufügen und 3 min. im Inkubator bei 37 ° c inkubieren Dann schütteln Sie die Platte vorsichtig Monolage Loslösung zu gewährleisten, fügen Sie 10 mL des kompletten Medium (vorgewärmt auf 37 ° C) und Pipette rauf und runter, bis homogene Zellsuspension erreicht wird. Zentrifugieren Sie und waschen Sie die Zellsuspension mit 15 mL frisches Medium, dann in entsprechenden Konzentrationen in frischen kompletten Medium aussetzen.
2. Laden Sie sanft die Zellsuspension (50 µL, 150 – 360 x 10³ Zellen/mL in Medium ~ 16 – 40 Zellen pro MC) auf die HMCA und lassen die Zellen durch die Schwerkraft für 15 min zu begleichen.
3. Fügen Sie sanft 6 – 8 Aliquote von 500 µL frisches Medium (insgesamt 3 – 4 mL) bis zum Rand des Makro-Brunnen Kunststoffboden außerhalb der Ring und Hydrogel-Array.
4. Inkubieren Sie HeLa-Zellen für 72 h und Zellen MCF7 für 48 h bei 37 ° C und 5 % CO_2, in eine feuchte Atmosphäre für die Bildung der Sphäroide.

(3) Lebensfähigkeit Erkennung durch Propidium Jodid (PI) Färbung

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von PI (500 µg PI pro 1 mL PBS). Halten Sie es bei 4 ° C für ca. 6 Monate. Frisch zubereiten einer Verwässerung des 1:2,000 (0,25 µg/mL), durch die Zugabe von 6 µL von Material, das komplette Medium ohne Phenol rot, 12 mL für 6-Well-HMCA-Platte (2 mL pro Well).
2. Die HMCA Platte mit 48-72 h Sphäroide aus dem Inkubator, der biologische Haube zu übertragen. Entfernen Sie alle Mittel aus der HMCA durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoff unten neben das Hydrogel-Array, verlassen die Array-Tank mit Medium gefüllt.
3. Fügen Sie sanft 2 mL PI Verdünnung aus Schritt 3.1 in jede Vertiefung durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoffboden. Inkubieren Sie die HMCA-Platte für 1 h bei 37 ° C und 5 % CO₂, in eine feuchte Atmosphäre. Fahren Sie mit Schritt 7.
   Hinweis: Andere Farbstoffe genutzt werden hier auch, z. B. Hoechst zum Kern Beizen, Tetramethylrhodamine Methylester (TMRM) für Mitochondrien-Membran-Potential Färbung, Fluorescein Diacetat (FDA) für die lebenden Zellen Erkennung von Annexin V für die Apoptose Erkennung und andere.

(4) Kollagen Gemischbildung

1. Steriles doppeltes destilliertes Wasser (DDW) von Autoklaven und einen Bestand von 100 mL 1 M NaOH Filter sterilisiert Lösung vorbereiten. Pflegen Sie die Materialien bei RT und die Tipps zur Gemischaufbereitung Kollagen bis zur Verwendung bei-20 ° C eingefroren.
2. 10 – 20 Minuten vor dem Gebrauch legen Sie alle Mischtypen einschließlich: sterile DDW, 1 M NaOH sterile Lösung, steril 10 x PBS, Typ I Kollagen aus Rattenschwanz (bei 4 ° C für 3-Monate gelagert) und ein steriles Röhrchen in den Eiskübel bis völlig abgekühlt. Legen Sie den Eiskübel in der biologischen Kapuze.
3. 6-Well HMCA Invasion Assay Platte (300 µL pro Well) 1.800 µL Kollagen Mischung an eine Endkonzentration von 3 mg/mL, wie folgt vorbereiten. Hinzufügen der Mischtypen in den gekühlten Rohr in folgender Reihenfolge: 515 µL DDW, 24,8 µL 1 M NaOH und 180 µL 10 X PBS. Mischung gut durch Strudel und Platz zurück ins Eis. Zu guter Letzt fügen Sie 1080 µL des Kollagens in der Mischung, Wirbel wieder und wieder in Eis.

(5) HA und Kollagen Gemischbildung

1. 10 mg in 2 mL sterile DDW HA auflösen. Inkubieren Sie die Mischung bei RT für ein paar Minuten und Wirbel sanft, bis das Pulver vollständig aufgelöst ist. Speichern Sie die Stammlösung bei 4 ° C für bis zu zwei Jahren.
2. Legen Sie direkt vor dem Gebrauch HA-Stammlösung in den Eiskübel in der biologischen Kapuze.
3. Bereiten Sie eine 3 mg/mL Kollagen Mischung wie in Schritt 4 beschrieben. Fügen Sie 36 µg (7.2 µL) ha in 1.800 μL der Kollagen-Mischung für eine Endkonzentration von 20 µg/mL gebrauchsfertig. Dann, Wirbel wieder kurz und zurück ins Eis.

(6) ECM Mischung zusätzlich

1. Übertragen Sie die HMCA Platte mit 48 – 72 h Sphäroide aus dem Inkubator in die biologische Haube zu und legen Sie es auf dem Eis. 10 min inkubieren Sie, bis die Platte abgekühlt ist. Eine Lösung von 1 % vorheizen LMA auf 37 ° C in einem Wasserbad.
2. Entfernen Sie alle Mittel aus rund um die HMCA indem Sie lehnen das Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoff unten neben das Hydrogel-Array. Dann entfernen Sie sehr sorgfältig alle Mittel aus dem Array-Tank mit einem feinen Spitze/Gel laden Spitze, indem Sie das Spitze Ende am Rande Array, langsam und vorsichtig saugen alle Medium heraus lehnen.
   Hinweis: Nach dem entfernen alle Mittel aus um das Hydrogel-Array, Array-Tank noch mit Medium gefüllt. Dieses Medium hat sehr sanft entfernt werden, um Zerstörung von Hydrogel MC und Dislokation der Sphäroide zu vermeiden.
3. Die Pre-gefrorene feine Spitze 150 µL des Kollagen-Mischung oder HA-Kollagen-Gemisch (ECM-Gemisch) mitnehmen und in den Array-Tank durch das Anbringen der Spitze an den Rand des Array hinzufügen. Lassen Sie die Mischung langsam um Sphäroid Luxation zu vermeiden. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem anderen aliquoten von 150 µL für eine insgesamt 300 µL pro Bohrloch. Folgen Sie den gleichen Vorgang für jedes gut, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Dann legen Sie die Platte in den Brutkasten für 1 h für den vollständigen Gelierung des ECM.
4. Nachdem die vollständigen Gelierung der ECM erzielt worden ist, pipette 400 µL vorgewärmten 1 % LMA auf dem ECM-Gel. Die Platte mit dem Deckel abdecken, die Platte bei RT für 5 – 7 min. und dann für 2 min bei 4 ° C für Agarose Gelierung inkubieren. Schließlich fügen Sie sanft 2 mL des kompletten Medium durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoffboden.
   Hinweis: Die Agarose-Schicht verhindert das Ablösen der Kollagen-Gel-Matrix aus der HMCA.

7. Invasion Assay Erfassung und Analyse

1. Last die HMCA Platte auf einem motorisierten invertiert Mikroskoptisch mit Brutkasten, voreingestellt auf 37 ° C, 5 % CO₂ und feuchte Atmosphäre ausgestattet.
2. Bestimmen der Positionen für die Bildaufnahme in jedem gut um den ganzen Array-Bereich abdecken und 10 X oder 4 X Objektive verwenden (dieser Schritt ist erforderlich für die Bild-Datenerfassungs-Software hier verwendet, siehe Materialtabelle unten für Details). Alternativ können Sie alle Bild-Datenerfassungs-Software um automatische Scan des gesamten Gebietes erforderlich, durch die Wahl zu erleichtern die "Stich" Option.
3. Erwerben Sie, Hellfeld (BF) Bilder alle 2 – 4 Std. für einen Zeitraum von 24-72 h insgesamt um die Invasion von Zellen aus dem Körper Sphäroid in die umliegenden ECM folgen.
4. Fluoreszierende Bilder für PI-Erkennung mithilfe eines dedizierten fluoreszierenden Cubes (Erregung Filter 530-550 nm, dichroitischen Spiegel 565 nm langen Pass und Emission Filter 600-660 nm) zu erwerben.
5. Exportieren Sie Time-Lapse BF/fluoreszierend-Bilder aus der Bild-Datenerfassungs-Software und speichern Sie sie im tagged Image Format (TIFF) in einen speziellen Ordner mithilfe der Registerkarte "Datenbank" in der Symbolleiste und dann die Schaltfläche "Export Dateien eintragen" .
   Hinweis: Wir entwickelten eine spezielle Inhouse Analysecode in MATLAB Software, die eine gestaltete grafische Benutzeroberfläche (GUI) enthält die Invasion Analyse schneller und einfacher ausgeführt werden konnte. In diesem Analysecode erfolgt halbautomatisch mit Sobel Filter, gefolgt von den morphologischen Operatoren Erosion und Dilatation der Segmentierung der Sphäroide und Invasion. Nach automatische Segmentierung der Bereiche wurden manuelle Korrekturen vorgenommen, gegebenenfalls für eine höhere Genauigkeit. Nach der Fertigstellung der Segmentierung waren eine Reihe von Parametern automatisch von der Software berechnet und in eine Excel-Datei zur weiteren Bearbeitung exportiert. Die Liste der Parameter sind: grundlegende Sphäroid Querschnittsfläche zur Zeit = 0, Invasion Bereich von Zellen mit Sphäroid Körper verbunden = Haupt Invasion Bereich von Zellen, die vom Haupt-Invasion, getrennt vom wichtigsten Invasion, durchschnittliche Entfernung von Anzahl der Zellen getrennt Invasion von der grundlegenden Sphäroid Mitte der Masse an den Umfang der wichtigsten Invasion Bereich und getrennten Zellen und kollektive Invasion Parameter "Entfernung" = d (d = √ ((X₂ - X₁₎² + (Y₂ - Y₁)²) von der X und Y Sphäroid Massenmittelpunkt koordiniert vor (X₁, Y-₁) und nach (X₂, Y₂) kollektive Invasion Prozess). Alternativ könnte Bildanalyse mit anderen spezialisierten Software erfolgen.
6. Öffnen Sie die GUI und drücken Sie die Taste "Last BF" . Nachdem das Bild geöffnet ist, passen Sie die Segmentierung Parameter (Mindestgröße: > 1 und Radius schließen: > 1) um eine genaue Segmentierung der Sphäroid und seine Invasion Fläche zu erreichen, dann drücken Sie "Region of Interest (ROI) Segmentierung" für die Ausführung und eine Grenze wird um jedes Sphäroid angezeigt. Wenn die automatische Segmentierung nicht korrekt ist, drücken Sie die Taste "Löschen" oder "Hinzufügen" und führen Sie die gewünschten Korrekturen manuell. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für die nachfolgenden Bilder.
7. Drücken Sie die "Tracking" -Taste, um die Sphäroide Nummer und die Software wird die gleiche Anzahl für jeden Sphäroid in jedem der Zeit verfallen Bilder zuweisen. Drücken Sie die "Messung" -Schaltfläche, die eine Tabelle mit allen Parametern generieren wird. Speichern Sie diese Tabelle als Excel-Datei zur weiteren Verwendung in Ergebnisse Verarbeitung und Statistiken in Excel Software.

Representative Results

Die einzigartige HMCA imaging-Platte wird für die Invasion-Assay von 3D Tumor Sphäroide verwendet. Der gesamte Test, mit der Sphäroid Bildung beginnend und endend mit der Invasion und zusätzliche Manipulationen erfolgt innerhalb der gleichen Platte. Für die Bildung der Sphäroid HeLa-Zellen werden in das Array Becken geladen und siedeln in der Hydrogel MCs durch die Schwerkraft. Das Hydrogel MCs, die Anhänger/niedrige Anlage Eigenschaften haben, erleichtern die Zell-Zell-Interaktion und die Bildung von 3D Tumor Sphäroide. Abbildung 2A zeigt die Zellen ließen sich in der MCs, nach dem Einsatz von 150 x 10³ Zellen/mL Lösung werden geladen (i.e., ~ 16 Zellen pro MC berechneter Wert). Es ist klar, dass die Belegung der Zellen pro MC ist durch das Array nicht gleichmäßig verteilt, und die gewonnenen statistischen Mittelwert Verteilung 14,78 ± 3,60 Zellen pro MC. Die Tabelle in Abbildung 2 b fasst die Zelle Verteilung pro MC für die ganze HMCA-Platte. Die durchschnittliche Variationskoeffizienten (CV) der Zelle Verteilung innerhalb einer Makro-Brunnen ist 43,33 %, während zwischen den Makro-Wells es 24,37 % ist. Die Unterschiede in der Zelle Belegung sind von entscheidender Bedeutung und die Größe der Sphäroide gebildet und ihre Homogenität über die Platte direkt diktieren. Um zu reduzieren/die Variabilität durch die Anzahl der Zellen pro MC erstellt zu minimieren, wird die Analyse der Ergebnisse in einem Element Auflösung durchgeführt. Die Grundstücke in Abbildung 2-D zu veranschaulichen (Querschnittsfläche) Größenverteilung der 3-tägigen Sphäroide. Es zeigt eindeutig in Abb. 2D Berechnung das Wachstum-Verhältnis der einzelnen Sphäroid (Querschnittsfläche am 2. Tag 3/Tag) hat eine homogenere Verteilung als die absolute Größenverteilung (Abbildung 2), einen Lebenslauf von 15,48 % und 52.80 % nachgeben, bzw.. Sphäroid Durchmesser Verteilung der 3-tägigen Sphäroide ergibt einen Lebenslauf von 24.52 % und das Wachstum Verhältnis (Durchmesser am Tag3/day2) 7,45 %. Diese CV-Werte sind ähnlich wie bei¹⁷ oder höher als¹⁸ anderen erlangen Zelle laden durch die Schwerkraft berichtet. Um die gemessenen Parameter Abweichung infolge der Variabilität in der anfänglichen ausgesät Zellzahl pro MC zu beseitigen, ist es vorzuziehen, die gewählten Parametern der ersten Zelle Nummer oder einen anderen gemessenen Parameter des gleichen Objekts zu normalisieren solche dass jeder Sphäroid seine interne Kontrolle hat. Dieser Ansatz könnte leicht durch die Verfolgung des Objekts auf die Speicherfolie HMCA angewendet werden.

Der Prozess der Sphäroid Bildung und das Wachstum könnte leicht auf der imaging-Platte HMCA verfolgt werden. Abbildung 3A-B zeigt ein BF-Bild einer Region auf der HMCA imaging-Platte mit 24 h HeLa-Zelle Aggregate und das entsprechende Bild der Reifen, 5–Tag mehrzelligen 3D-Objekte, die sphärische und Dichter werden. Es wird deutlich, dass die meisten Objekte ihre Position während der 5 Tage Inkubationszeit behalten. Die Analyse der Form (Sphärizität) und Größe (Querschnittsfläche) während der Sphäroid-Bildung ist in Abbildung 3dargestellt. Das Streudiagramm zeigt die Zunahme der beiden Parameter von Tag 1 bis Tag 5; 0.544 ±0.020 a.u 0.684± 0,016 a.u für Sphärizität (p < 0,05) und 0.00356± 0,00013 mm² 0.00538 ± 0,00015 mm² für Querschnittsfläche (p < 0,05), beziehungsweise. Während 24-h-Aggregate klein sind und unregelmäßig Form haben, die jeweiligen 5-Tage-Sphäroide sind größer und Kugelform zu erwerben.

Die Erkennung der Sphäroid Zellviabilität erfolgt mit geringer Konzentration PI für Färbung¹⁹ , die die Notwendigkeit der Farbstoff waschen umgeht. PI dringt in die Zellmembran und dann in die DNA der nicht lebensfähige Zellen Plasmamembrane. Abbildung 4A zeigt 5-Tages HeLa Sphäroide gebeizt mit PI (in rot). Analyse des Prozentsatzes der rote Bereich (für abgestorbene Zellen) aus jeder Sphäroid Querschnittsfläche wird in Abbildung 4 bzusammengefasst. Das Histogramm zeigt, dass 85 % der Sphäroid Bevölkerung eine maximale Höhe von 5 % rot gefärbt hat und der Durchschnitt liegt bei 3.01 ± 2,34 % (linke Histogramm). Querschnittsfläche der Sphäroide (richtige Histogramm) zeigt eine Normalverteilung mit Mittelwert der 0.02447 ± 0,00487 mm².

Nach der Herstellung 3-Tage Reifen HeLa Sphäroide, erfolgt die Invasion Assay innerhalb der imaging-Platte HMCA. Die Wirkung der Variablen, z. B. Zusammensetzung, Inhibitoren und Aktivatoren, ECM auf der 3D Tumor Sphäroid Invasion Prozess könnte geprüft werden. Für Invasion Testleistung das Medium leicht entfernt und ersetzt mit ECM Lösung Pipette über die Sphäroide in der MC-Array-Becken. Nach der vollständigen Gelierung der ECM-Lösung ist vollständig Medium in den Makro-Brunnen hinzugefügt. (1), den Einfluss von HA auf den HeLa Sphäroid spontane Invasion Prozess zu untersuchen, wurden die Sphäroide mit Kollagen und HA-Mischung-Lösung (Abb. 5A) bedeckt und im Vergleich zu denen mit Kollagen einzige Lösung (Abbildung 5), bedeckt und BF-Bilder direkt nach ECM Gelierung erworben wurden (t = 0 h). Die kinetische Invasion Prozess folgte imaging die gleichen Regionen alle 5 h für einen Zeitraum von 63 h. Nach 50 h Inkubation die Sphäroide eingebettet in Kollagen und HA (Abb. 5 b) zeigte untere Zelle Streuung in das umliegende ECM im Vergleich zu der Sphäroide eingebettet in Kollagen nur (Abbildung 5). Die Analyse des Bereichs "Invasion" kinetische im Laufe der Zeit für 99 Sphäroide bei Single-Sphäroid Auflösung wird in Abbildung 5Ezusammengefasst. Abbildung 5E Parzellen Bereich Mittelwert/Durchschnitt Invasion im Laufe der Zeit der beiden Gruppen und zeigt deutlich, dass die Zugabe von HA zu Kollagen hemmt die Zelle Dispersion aus den Sphäroid, was zu kleineren Invasion Flächen. Der Durchschnitt der Pisten durch lineare Regression Anpassung Kurven für jeden der die Sphäroide eingebettet in Kollagen (0.001973 ± 0,000894 mm2/h) im Vergleich zu Kollagen und HA-Lösung (0.001410 ± 0,000941 mm²h) sind deutlich verschiedene (p = 0,003, t-Test: zwei Stichproben unter der Annahme gleicher Varianzen). (2) um den Einfluss der Fisetin untersuchen (ein bioaktiver Flavonoid gefunden in einigen Obst und Gemüse die Zytostatika und Migrastatic Aktivitäten durch Einwirkung auf verschiedene molekulare Ziele einschließlich Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) zeigt/Akt/c-Jun N-Terminal Kinasen (JNK) Signalisierung und Wnt/β-Catenin Signalisierung herunterreguliert Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und andere²⁰) auf HeLa Sphäroid spontane Invasion Prozess, steigende Konzentrationen des Medikaments wurden hinzugefügt, um das komplette Medium und BF Bilder erworben wurden, bei t = 0 (Abb. 6A) und 24 h später (Abb. 6 b-C). Wie gezeigt, hemmt 10 µM Fisetin (Abbildung 6) die Streuung der Zellen um die Sphäroide im Vergleich zu unbehandelten HeLa Sphäroide (Abb. 6 b). Die Invasion-Einzugsgebiet-Analyse einer Dosis-Antwort-Experiment (Abbildung 6) weist deutliche Hemmung bei 10-40 µM der Fisetin (p < 0,003), Sättigung bei der Konzentration von 10 µM und höher erreichen. (3) es hat sich gezeigt, dass, Nein, auf Nano-molaren Ebene beiträgt, ein aggressiver Brustkrebs Krebs Phänotyp durch anregende Tumor Erweiterung und Migration¹⁶. Um den Einfluss von NO auf den kollektiven Invasion MCF7 Sphäroide eingebettet in Kollagen, 1 µM Diethylenetriamine/Stickstoffmonoxid Spender zu untersuchen (DETA/NO) wurde hinzugefügt, die komplette Kulturmedium und BF Bilder erworben wurden, bei t = 0 und t = 20 h. Dramatic Änderungen in der Morphologie und Standorte der 3D Sphäroide während der Exposition gegenüber kein Spender sind erkennbar (Abbildung 7A-B). Die Sphäroide verlieren ihre Kugelgestalt und werden mehr länglich amöboiden wandernden Phänotyp zu erwerben. Begleitend wurde verstärkte Translokation der Sphäroide innerhalb der umgebenden Kollagenmatrix (Abbildung 7) beobachtet. Der durchschnittliche Dehnung Wert von 1.305 ± 0,193 a.u 1.477 ± 0,298 a.u, (p < 0,0006) deutlich erhöht. Der durchschnittliche Migration Abstand für die gleichen Sphäroide gemessen wurde erheblich erweitert, 0.0788 ± 0,0575 mm und 0.3164 ± 0,3365 mm in Abwesenheit und in der Gegenwart von DETA/Nein, bzw. (p < 4 x 10^-6).

Bildanalyse der Sphäroid Invasion wurde durch halbautomatische Inhouse MATLAB Software erreicht. Die erworbenen Zeit Zeitraffer Bilder der Sphäroid Bildung und Invasion in die HMCA besteht aus zahlreichen Sphäroide in einem Bild (4-6 Sphäroide bei 10facher Vergrößerung und 25-30 Sphäroide bei 4 X Vergrößerung). Die Analyse der Sphäroid Bildung, Wachstum und Invasion wurde damit auch auf alle Sphäroide im Bild durchgeführt. Die Schlüsselparameter für Sphäroid Invasion extrahiert werden dargestellt in Abbildung 8A, die eine repräsentatives Bild Segmentierung der 4 Sphäroide zu einem einzigen Zeitpunkt zeigt (t = 16 h). Den wichtigsten Invasion durch einen roten Rahmen, sowie die getrennten Zellen die ausgekuppelt und verstreut herum (gekennzeichnet durch schwarze Pfeile), wurden verfolgt und nummeriert für jedes Sphäroid im Laufe der Zeit definierten Bereich. Sphäroid Größe vor Invasion bei t = 0 ist definiert durch einen blauen Rahmen. Der Mittelwert/Durchschnitt Invasion Entfernung Sphäroid Mitte der Masse der Invasion Bereich Umfang einschließlich getrennte Zellen berechnet aus den eingekreisten roten Segmentierung und durch gelbe Pfeile angedeutet. Daten aus diesem Zeitraffer-Experiment ist in Abbildung 8 b-Dzusammengefasst. Abbildung 8 zeigt die Höhe der mittleren Invasion Entfernung von jedem Sphäroid Zentrum im Laufe der Zeit. Abbildung 8 zeigt die Höhe des Bereichs insgesamt Invasion in jedem der Sphäroide im Laufe der Zeit (einschließlich der wichtigsten Invasion und getrennt/ausgerückt-Zelle Bereich). Abbildung 8 _1-4 zeigt das Ausmaß der getrennt-Zelle Bereich im Vergleich zum Bereich total Invasion der einzelnen Sphäroid (zeitlich). Die kumulative Anzahl der ausgekuppelte Zellen ist 33, 7, 4 und 5 für Sphäroide #1, #2, #3 und #4, beziehungsweise. Die Analyse der kumulierten Anzahl ausgekuppelten Zellen über 20 h Invasion von 126 HeLa Sphäroide erhalten in Kollagen eingebettet ist in Abbildung 8Egezeigt. Es wird hier gezeigt, dass es eine große Verteilung der Zahl der ausgekuppelte Zellen in der untersuchten Population und der Durchschnittswert 12,3 ± 12,8 Zellen ist.

Abbildung 1: The imaging-Platte HMCA. (A) Bild von einem Makro-Brunnen mit HMCA geprägt. (B) einen Querschnitt von einem MC in der imaging-Platte HMCA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Homogenität der Zelle Verteilung und Sphäroid Wachstum-Verhältnis in der imaging-Platte HMCA. (A) eine Überlagerung der BF und fluoreszierende Bilder von der HMCA geladen mit HeLa-Zellen bereits gefärbt mit Hoechst 33342 1 µg/mL (Laden von Konzentration 150 x 10³ Zellen pro mL). Bilder wurden direkt nach der Zelle-Siedlung in der MC. Bildvergrößerung 4 X, Maßstabsleiste erworben = 500 µm. (B) die Tabelle fasst die Verteilung von HeLa-Zellen innerhalb der HMCA-6-Well Bildplatte. Die Zellen wurden von bis zu 90 MC/Makro-Well gezählt. Die Ergebnisse werden als bedeutet, dass innerhalb von ± Standardabweichung (SD), CV (SD/mean100) berechnet wird und zwischen der Makro-Brunnen. (C) Verteilung Histogramm der Querschnittsfläche des 3-tägigen Sphäroide, n = 418, aus BF Bilder bestimmt. (D) Verteilung Histogramm der Sphäroid Wachstum Ratio (Querschnittsfläche am 2. Tag 3/Tag). Wachstum-Verhältnis ist bei einem Element Auflösung für jeden 418 Sphäroide berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Tracking-Sphäroid Bildung in der imaging-Platte HMCA. BF-Bild von HeLa-Zellen (Laden von Konzentration 120 x 10³ Zellen pro mL) in den HMCA für 1 Tag (A) und (B) 5 Tage inkubiert. Bild-Vergrößerung 4 X, Maßstabsleiste = 500 μm. (C) Scatter plot des 3D-Objekts Sphärizität in Abhängigkeit von der Querschnittsfläche, nach 1 Tag (blaue Diamanten) und 5 Tage (braune Quadrate) Inkubation Post Zelle laden. Jeder Marker stellt die analysierten Daten von einem einzigen Sphäroid, n = 83. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Erkennung der Zellviabilität in Reife Sphäroide. Eine Überlagerung der BF und fluoreszierende Bilder des 5-tägigen Sphäroide (Laden von Konzentration 360 x 10³ Zellen pro mL) gefärbt mit PI 0,25 µg/mL (A). Bild-Vergrößerung 4 X, Maßstabsleiste = 500 µm. (B) Vertrieb Histogramm der Prozent der PI-Bereich bezogen auf die Querschnittsfläche der Sphäroid (links) und Verteilung Histogramm der Querschnittsfläche (rechte Abbildung), n = 84. Prozent der PI-Bereich ist mit einem Element Auflösung für jeden 84 Sphäroide berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Einfluss der ECM-Komposition auf Sphäroid Invasion Prozess. BF-Bilder der 3-tägige HeLa Sphäroide eingebettet in einer Mischung von 3 mg/mL Kollagen und 20 µg/mL HA (A) und 3 mg/mL Kollagen (C) bei t = 0 h und nach 50 h Inkubation (B) und (D), beziehungsweise. Vergrößerung 10 X, Maßstabsleiste Bild = 200 µm. Die HMCA imaging-Platte wurde auf die Bühne der inversen Mikroskop ausgestattet mit Inkubator geladen. Bilder alle 5 h erworben wurden und die kinetische Analyse stellt sich in Handlung (E), n = 99. Jede Kurve stellt den Mittelwert ± SD Invasion Bereich Anstieg im Laufe der Zeit für Kollagen und HA (blaue Diamanten) und Kollagen nur (braune Quadrate). Die Kurven sind durchschnittliche lineare Regression Kurve und seine Gleichung und Bestimmtheitsmaß erwähnt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: Fisetin hemmt spontane Invasion von HeLa Sphäroide. BF-Bilder der 3-tägige HeLa Sphäroide, eingebettet in eine Mischung von 3 mg/mL Kollagen (A) bei t = 0 und dann 24 h nach Zugabe von 0 µM (B) und 10 µM Fisetin (C) um das komplette Kulturmedium. Bild-Vergrößerung 4 X, Maßstabsleiste = 500 µm. Analyse der Invasion Bereich für jedes Sphäroid am Endpunkt (t = 24 h) präsentiert sich in Grundstück (D), n = 488. Die Kurve repräsentiert Mittelwert ± SD Invasion Fläche als Funktion von 0-40 µM Fisetin. Fisetin Behandlung signifikant hemmt die Invasion bei 10 µM (P = 4,65 x 10^-6), 20 µM (P = 0.0021) und 40 µM (P = 4,86 x 10^-8), mit t-Test: unter der Annahme gleicher Varianzen zwei-Stichproben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7: NO induziert kollektive Invasion im MCF-7 Brust Krebs Sphäroide. BF-Bilder der 2-tägigen MCF-7 Brust Krebs Sphäroide, eingebettet in Kollagen (A) bei (t = 0) und (B) nach 20 h Exposition bis 1 µM DETA/Nr. Sphäroid ROI Segmentierung ist definiert durch roten Rahmen, überlagert und nummeriert in rot auf BF Bilder A und B. ROIs definiert durch blauen Rahmen, überlagert, BF B repräsentieren Sphäroid Bildgröße und Position bei t = 0. Vergrößerung 4 X, Maßstabsleiste = 500 µm. (C) A Streudiagramm der Korrelation zwischen Dehnung Faktor und Migration Abstand der einzelnen Brust Krebs Sphäroide auf die Exposition gegenüber 1 µM DETA/keine (braune Quadrate) als im Vergleich zur Kontrolle (blaue Diamanten) bei t = 20 h, n = 54. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8: HeLa-Zelle spontan Invasion Bildanalyse. BF-Bilder der 3-tägige HeLa Sphäroide, 16 h nach dem Einbetten in Kollagen (A). Vergrößerung 10 X. Sphäroid Invasion Bereich und ausgekuppelten Zellen zeichnen sich durch rot umrandet, Sphäroid Größe bei t = 0 ist definiert durch blauen Rahmen, mittlere Invasion Entfernung Sphäroid Mitte der Masse ist durch gelbe Pfeile angedeutet und ausgekuppelte Zellen sind durch schwarze Pfeile angedeutet. Der Anstieg im Laufe der Zeit der mittleren Invasion Entfernung von Sphäroid Massenmittelpunkt (B) und total Invasion Bereich (C) Grundstück. Die Kurven zeigen Sphäroid #1 (blaue Diamanten), Sphäroid #2 (braune Quadrate), Sphäroid #3 (grüne Dreiecke) und Sphäroid #4 (lila Xs). (D) Bar-Chart des Mains (blau) und Zelle (braun) Invasion Bereich Anstieg im Laufe der Zeit getrennt. (E) Verteilung Histogramm die kumulative Anzahl von getrennten Zellen pro Sphäroid während 20 h Invasion Prozesses, n = 126. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Es ist gut dokumentiert, dass lebende Organismen, zeichnet sich durch ihre komplexe 3D mehrzelligen Organisation ziemlich eindeutig aus den gängigen 2D Monolage kultivierten Zellen sind, entscheidende betonend, zelluläre Modelle verwenden die Funktionen besser imitieren und Prozesse des lebenden Organismus für Drug screening. Vor kurzem wurden mehrzelligen Sphäroide, organotypischen Kulturen, Organellen und Organe-on-a-Chip eingeführt⁸ für den Einsatz in standardisierten Wirkstoffforschung. Allerdings gefährdet das 3D-Modell für mehrzelligen großer Komplexität deutlich seine Robustheit, Parallelisierung und Datenanalyse, die für Assay Effizienz entscheidend sind.

Quantitative Bewertung der Invasion Kapazität misst in der Regel die Bewegung der Zellen durch Hydrogel Materialien. Um den Tumorinvasion mit traditionellen Mikro-Well-Platten messen, große Anzahl von Krebszellen Runde Bodenplatten ausgesät und gezwungen zu Aggregat durch Zentrifugation^21,22. Diese Platten beschränken Zelle/Sphäroid Interaktion in angrenzenden Brunnen, während die Rundboden die optische Qualität behindert und Bildaufnahme erschwert. In anderen Methoden Einzelzellen gekapselt zufällig innerhalb der Hydrogel, wachsen und funktionieren in einer 3D-Umgebung, aber entwickeln sich nicht unbedingt in Reife Sphäroide^23,24. Darüber hinaus sind komplizierte Verfahren für die Zelle Positionierung innerhalb Hydrogel erforderlich, wie magnetische Kraft-basierte Zelle Musterung²⁵ oder zwei-Photonen Laserbestrahlung von bioaktiven Hydrogele²⁶.

Die HMCA-Technologie präsentiert hierin erweist sich als vorteilhaft über die oben genannten Methoden: Zell-Positionierung, spontane Aggregation und Schaffung von Sphäroide aus einigen verstreuten Zellen leicht erreicht werden, ermöglicht die Verwendung von wertvollen begrenzt Mobilfunk Probe (zB., Stamm-wie Krebszellen oder Primärzellen von Patientenproben abgeleitet). Das System hat Kontrolle über sowohl die Art der Zellen, aus denen die Sphäroide sowie über ihre genaue räumliche Lage während der langfristigen Experimente. Darüber hinaus der flache Boden des MC ermöglicht die Generierung von zahlreichen Sphäroide auf dem gleichen fokalen Plan, daher schnelle Beleuchtung und Bild Erfassung von großen Flächen über ein weites Feld-Mikroskop ist möglich, wodurch die Notwendigkeit für komplizierte zeitraubende konfokalen Mikroskopie. Das System ist einfach zu handhaben und seine Praxistauglichkeit machbar. Durch einfache operative Verfahren anwenden, haben wir hohe Auslastung der Sphäroid Populationen, in denen etwa 50 % der Sphäroide vergleichbaren Größe haben, und eine zuverlässige Analyse von Krebs Zelle Invasion Kapazität erreicht. Darüber hinaus kann die Wirkung von Medikamenten auf Invasion Kapazität gleichzeitig mit ihrer zytostatischen und/oder zytotoxische Wirkung analysiert werden, mit High-Content-Analyseansatz zusammen mit HMCA Gerät mit zahlreichen Sphäroide kultiviert. Darüber hinaus teilen alle zellulären Elemente in den HMCA, den Raum und die Mittel, die es ermöglichen, Sphäroid-Sphäroid Interaktion zu untersuchen, die in der Regel über Zelle sezerniert Zytokine, Chemokine, Hormone und der ECM-²⁷vermittelt wird. Dieses Übersprechen erleichtert das Überleben und die Funktion der einzelnen Zellen/kleine Zellcluster im Makro-gut Volumen.

Ein entscheidender Schritt bei der Durchführung des Protokolls ist die Zugabe von ECM-Mischung auf die Sphäroide und überprüfen die korrekte Polymerisation. Die Sphäroide werden Wanderungsverhalten nicht angezeigt, auch wenn sie innerhalb von ECM, eingebettet sind, es sei denn, Montage und Vernetzung auftreten und entsprechenden Kollagenfasern gebildet. Die Kollagenfasern durch BF Beleuchtung beobachtet werden, und wir raten, Überprüfung der Platte unter dem Mikroskop, die Schaffung von Kollagenfasern am Ende dieser Phase zu bestätigen. Da die Anzahl der Sphäroide ist abhängig von der anfänglichen Zellkonzentration und den Prozentsatz der besetzten MCs, das Array sollte geprüft werden, nach dem ersten Zelle laden, und wenn Zelle Belegung nicht optimal ist, erneute Aussaat von dasselbe Array kann durchgeführt werden. In der Tat wurden Größe und Geometrie von den hierin beschriebenen HMCA entwickelt, um relativ kleine Zellcluster (bis zu 150 µm im Durchmesser) unterzubringen. Dies könnte eine Einschränkung bezeichnet werden, da entwerfen eine neue Art von Array für die Analyse der Zellwanderung aus größeren Zellstrukturen nötig sein wird.

Die aktuelle Plattform nutzt minimale Zellzahl und kleine Reagenz Volumen, während gleichzeitig eine große Stichprobe-Größe (Tausende von Sphäroide pro Platte). Um 12 verschiedene Verbindungen für anti-metastatischen Aktivitäten zu analysieren, wären 2 6-Well HMCA basierte Einzelplatten erforderlich, die Ergebnisse von etwa 5.000 Sphäroide nachgeben, während mindestens 50 96-Well-Platten nötig wäre, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen. Die Möglichkeit die Migration bei einzelnen Objektauflösung in die HMCA zu analysieren bietet ein hohes Maß an statistische Robustheit und Genauigkeit, so dass die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Invasion Heterogenität in zahlreichen Sphäroide.

Die Studie zeigt eindeutig die kollektive Invasion der Brust Krebs Sphäroid Bevölkerungen auf die Exposition gegenüber DETA/Nr. Zellcluster MCF7 Zellen zeigen amöbenartige wandernden Phänotyp und quantitative Veränderungen in der Morphologie und Lage der einzelnen Sphäroid automatisch erreicht werden können. Nach bestem Wissen und gewissen ist dies das erste angeordneten System, das Überwachung und Analyse der kollektiven Invasion in zahlreichen 3D-Strukturen erleichtert. Durch die Analyse der relativen Richtungen und die Invasion Distanz für jede Sphäroid, ist es möglich, die gegenseitige Wechselwirkung zwischen Sphäroide innerhalb der Bevölkerung zu untersuchen. Darüber hinaus wird die etablierten Beeinflussung der extrazellulären Mikroumgebung Faktoren Krebs Zelle Verhalten²⁸ hier dargestellt. Zu diesen Faktoren die Steifigkeit und die Zusammensetzung der Mikroumgebung Zellwanderung beeinflussen gezeigt. HMCA-Technologie bietet eine definierte, Biomimetic, in-vitro- Plattform, in denen diese Eigenschaften des ECM leicht zugänglich und gesteuert werden können. Die Steifigkeit des reinen Kollagen Typ I Hydrogel auf die Konzentration von 3 mg/mL, die in dieser Studie verwendet wurde wird berichtet, dass etwa 50 bis 600 Pa^29,30,31 und die Zugabe von HA (20 µg/mL; 0,4 Gew.-%) hat sich nicht verändert die Steifigkeit der Hydrogel deutlich^32,33. So, die unterdrückende Wirkung der mittleren Molmasse (MMW)-HA auf die Invasion von 3D HeLa Sphäroide, zeigte hier ist nicht wegen Steifigkeitsänderungen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit früheren Studien, die eine bimodale Wirkung von HA auf Krebs Zellinvasion mit hoher Abhängigkeit von HA Molekulargewicht^34,35,36,37zeigte.

Zukünftige Anwendungen der Methoden gehören nebeneinander Multi Zelle Art Kultivierung von Tumor und Stromazellen Zellen in verschiedenen Regionen innerhalb der Makro-Brunnen und Abruf von spezifischen Sphäroide für nachgeschaltete molekulare Analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics