Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Analyse av kreft cellen invasjon og anti-metastatisk narkotikarelaterte Screening bruker Hydrogel mikro-kammer Array (HMCA)-baserte plater

doi: 10.3791/58359 Published: October 25, 2018

Summary

En HMCA-basert bildebehandling plate er presentert for invasjonen analysen ytelse. Denne platen forenkler dannelsen av tredimensjonale (3D) svulst spheroids og måling av kreft cellen invasjonen i den ekstracellulære matrisen (EFM). Invasjonen analysen kvantifiseringen oppnås ved halvautomatisk analyse.

Abstract

Kreft metastasering er kjent at 90% av kreft dødelighet. Metastasering er en flertrinns prosess som starter med penetrasjon/invasjonen av svulst cellene i nærliggende vev. Dermed er invasjonen et viktig skritt i metastasering, gjør invasjonen prosess forskning og utvikling av anti-metastatisk narkotika, stor betydning. For å møte denne etterspørselen, det er behov for å utvikle 3D i vitro modeller som imiterer arkitektur solide svulster og deres microenvironment nærmest til i vivo tilstand på den ene siden, men samtidig være reproduserbare, robust og egnet for høy kapasitet og høy innhold målinger. Foreløpig mest invasjonen analyser lene på sofistikerte microfluidic teknologi som er tilstrekkelig for forskning, men ikke for høyt volum narkotikarelaterte screening. Andre analyser plate-baserte enheter med isolerte individuelle spheroids i hver brønn er materiale forbruker og har lav utvalgsstørrelsen per betingelse. Målet med gjeldende protokollen er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Vi utviklet en 3D-modell for invasjonen analysen basert på HMCA tenkelig plate til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk medisiner. Denne enheten kan mange uniform spheroids per brønn (høy utvalgsstørrelsen per betingelse) omgitt av ECM komponenter, mens kontinuerlig og samtidig observere og måle spheroids på ett element oppløsning for middels gjennomstrømming screening av anti-metastatisk narkotika. Denne plattformen er presentert her av produksjonen av HeLa og MCF7 spheroids for exemplifying enkelt celle og kollektive invasjonen. Vi sammenligne påvirkning av ECM komponent hyaluronic syre (HA) på invasiv kapasiteten av kollagen rundt HeLa spheroids. Til slutt, vi introdusere Fisetin (invasjonen hemmer) HeLa spheroids og nitrogenoksid (ingen) (invasjonen Aktivator) til MCF7 spheroids. Resultatene analyseres av Husets programvare som gjør halvautomatisk, enkel og rask analyse som gjør flere parameter eksamen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Døden skyldes hovedsakelig til formidling av metastatisk celler til fjerntliggende steder. Mange anstrengelser i kreftbehandling fokusere på målretting eller hindre dannelsen av metastatisk kolonier og progresjon av systemisk metastaser1. Kreft celle migrasjon er et viktig skritt i svulst metastasering prosessen, dermed forskning kreft invasjonen cascade er svært viktig og en forutsetning for å finne anti-metastatisk therapeutics.

Bruk av dyr modeller som verktøy for å studere metastatisk sykdom har blitt funnet for å være svært dyrt og ikke alltid representative for svulst i mennesker. Videre er påvirke den ekstracellulære microenvironment topologi, mekanikk og komposisjon sterkt kreft cellen oppførsel2. Siden i vivo modeller iboende mangel evnen å skille og kontrollere slike spesifikke parametere som bidrar til kreft invasjon og metastasering, er det behov for kontrollerbar biomimetic i vitro modeller.

For å kunne metastase å fjerne organer, må kreftceller utstilling vandrende og invasive fenotypiske trekk som kan målrettes for terapi. Men siden de fleste i vitro kreft modeller ikke etterligne faktiske funksjonene i solide svulster3, er det svært utfordrende å oppdage fysiologisk relevante fenotyper. I tillegg dikterer til fenotypiske heterogene som finnes i svulsten, behovet for å analysere svulst overføring på ett element oppløsning for å oppdage fenotypen rettet behandlinger, for eksempel ved å målrette metastasering-starte cellen befolkningen i heterogene svulster4.

Studiet av cellen motilitet og kollektiv migrasjon gjennomføres hovedsakelig monolayer kulturer av epitelceller på homogen Plane overflater. Disse konvensjonelle mobilnettet modeller for kreft celle migrasjon er basert på befolkningen analyse av enkeltceller invadere gjennom membraner og ECM komponenter5, men i slike systemer, iboende forskjellene mellom individuelle celler ikke studerte. Genererer 3D spheroids via stillaser eller stillaset uten mikro-strukturer er regnet som en overlegen betyr å studere svulst celle vekst og kreft invasjonen6,7,8. Men mest 3D systemer er ikke egnet til høy gjennomstrømning formater, og mellom spheroid interaksjon vanligvis oppnås ikke siden isolerte individuelle spheroids genereres i hver mikro-og9. Studier med kreft overføringen er basert på microfluidic enheter3,10,11,12, men disse sofistikerte microfluidic verktøy er vanskelig å produsere og ikke kan brukes for høy gjennomstrømning screening (HTS) av anti-invasiv narkotika.

To viktigste fenotyper, kollektive og individuelle celle migrasjon, som spiller en rolle i kreftceller overvinne ECM barrieren og invadere nærliggende vev, har blitt demonstrert13,14, hver viser atskilte morfologiske egenskaper, biokjemiske, molekylære og genetiske mekanismer. I tillegg er to former for overføring kreftceller, fibroblast-like og amoeboid, observert i hver fenotypen. Siden både invasjonen fenotyper og migrasjon moduser, defineres hovedsakelig av morfologiske egenskaper, det er behov for mobilnettet modeller som aktiverer imaging-basert oppdagelsen og undersøkelse av alle former for svulst invasjon og migrere celler.

Det overordnede målet med det aktuelle metoden er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D i vitro cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Her introduserer vi HMCA-baserte 6-og bildebehandling platen til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk terapi. Teknologien gjør det mulig for dannelsen av et stort antall uniform 3D svulst spheroids (450 per brønn) i en hydrogel mikro-kammer (MC) struktur. Ulike ECM-komponenter er lagt til spheroid matrisen aktivere invasjonen av cellene i omgivelsene. Invasjonen er kontinuerlig overvåket av kort - og langsiktige observasjon av samme personlige spheroids/invadere celler og muliggjør morfologiske karakterisering, fluorescerende flekker og gjenfinning av bestemt spheroids når som helst. Siden mange spheroids deler plassen og medium, er kommunikasjon via løselige molekyler mellom individuelle spheroids og deres innvirkning på hverandre mulig. Halvautomatisk bildeanalyser utføres ved hjelp av interne MATLAB kode som gjør det raskere og mer effektiv samling av store mengder data. Plattformen forenkler nøyaktig, samtidig måling av mange spheroids/invadere celler på en tidkrevende måte, slik at medium gjennomstrømming screening av anti-invasjonen narkotika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. HMCA Plate relieff

Merk: Hele prosessen for design og fabrikasjon av polydimethylsiloxane (PDMS) stempel og HMCA tenkelig platen brukes i denne protokollen er beskrevet i detalj i våre tidligere artikler15,16. PDMS stempelet (negativ shape) brukes til å skrive HMCA (positiv figur) som består av ca 450 MCs per brønn (figur 1A). Som vist i figur 1B, hver av MCs har en form av en avkortet oppned firkantet pyramide (høyde: 190 µm, lite base område: 90 µm x 90 µm og stort base område: 370 µm x 370 µm). HMCA platen brukes for utarbeidelse og dyrking av 3D svulst spheroids og deretter invasjonen analysen. Kommersielle stempel kan også brukes til HMCA produksjon.

  1. Forberede en løsning av 6% lavt Smeltepunkt agarose (LMA). Sett inn LMA pulver og sterile fosfat bufret saltvann (PBS) (0,6 g av LMA per 10 mL PBS) i en glassflaske med en magnetisk rørestang. Plasser flasken på en oppvarming plate og rør løsningen mens oppvarming til 80 ° C for et par timer til en enhetlig løsning er oppnådd. Hold løsningen på 70 ° C før bruk.
  2. Forvarm PDMS stempelet til 70 ° C i ovnen. Holde den varm før bruk. Alternativt bruke en kommersiell stempel og følg instruksjonene.
  3. Plass kommersielle 6-vel glass bunn plater på en tørr bad forvarmet til 75 ° C. Vent noen minutter til platen er helt varm.
  4. Hell en dråpe (400 µL) forvarmet LMA på glass nederst hver og en av brønnene i platen. Forsiktig plassere forvarmet PDMS stempelet over agarose fall. Inkuber ved romtemperatur (RT) for 5-10 minutter for pre gelling og pre kjøling. Ruge på 4 ° C for 20 min å oppnå full agarose gelation. Deretter forsiktig løsner PDMS, forlater agarose gel mønstret med MCs.
    Merk: Dette trinnet utføres samtidig i alle brønnene.
  5. Plasser relieff platen i et lys herding system utstyrt med ultrafiolett (UV)-lampen, og ruge i 3 minutter.
    Merk: Nå HMCA platen er UV sterilitet.
  6. Fyll makro-brønnene med sterilt PBS slik at de holdes fuktig, da dekke platen, vikle den med parafilm og lagre den på 4 ° C før bruk.
  7. Tømme PBS rester fra HMCA platen før bruk. Legge den i biologiske panseret.

2. lasting celler og formet formasjon

  1. Samle cellene som følger: Fjern alle medium fra en 10 cm kultur plate celle monolayer, vaske to ganger med 10 mL PBS avhende serum rest, legge til 5 mL av trypsin (pre oppvarmet til 37 ° C) og ruge for 3 min i kuvøse på 37 ° C. Deretter riste platen forsiktig å sikre monolayer avdeling, tilsett 10 mL av komplett medium (pre oppvarmet til 37 ° C) og pipette opp og ned til homogen celle suspensjon er oppnådd. Sentrifuge og vask celle suspensjon med 15 mL av fersk medium, deretter hvilemodus på riktig konsentrasjoner i frisk komplett medium.
  2. Forsiktig laste celle suspensjon (50 µL, 150-360 x 103 celler/mL i medium, ~ 16-40 cellene per MC) på HMCA og at cellene å slå av tyngdekraften på 15 min.
  3. Forsiktig legge 6 – 8 dele 500 µL frisk medium (totalt 3-4 mL) til kanten av makro-og plast nederst utenfor ringen og hydrogel matrisen.
  4. Inkuber HeLa cellene 72 h og MCF7 48 h 37 ° C og 5% CO2, i en fuktet atmosfære for dannelsen av spheroids.

3. levedyktighet gjenkjenning av Propidium Iodide (PI) flekker

  1. Forberede en lagerløsning PI (500 µg PI per 1 mL av PBS). Hold det på 4 ° C i ca 6 måneder. Fersk forberede en fortynning av 1:2,000 (0,25 µg/mL), med tillegg av 6 µL av lager til 12 mL av komplett medium uten fenol rød, 6-vel HMCA platen (2 mL per brønn).
  2. Overføre HMCA platen med 48-72 h spheroids, fra inkubator til biologiske panseret. Fjerne alle medium fra HMCA ved å lene tips slutten på kanten av makro-og plast nederst ved hydrogel matrisen, forlate matrise tanken fylt med medium.
  3. Forsiktig legge 2 mL PI fortynning fra trinn 3.1 i hver brønn ved å lene tips slutten på kanten av makro-og plast nederst. Inkuber HMCA platen 1t på 37 ° C og 5% CO2, i en fuktet atmosfære. Fortsett til trinn 7.
    Merk: Andre fargestoffer kan brukes her også, for eksempel Hoechst for kjernen flekker, tetramethylrhodamine metyl ester (TMRM) for mitokondrie membran potensialet flekker, fluorescein diacetate (FDA) for lever celler deteksjon, Annexin V for apoptose oppdagelse og andre.

4. kollagen blanding forberedelse

  1. Forbered sterilt dobbel destillert vann (DDW) ved autoklav og et lager av 100 mL 1 M NaOH filter-steriliseres løsning. Opprettholde materialer til RT, og tips brukes for kollagen blanding forberedelse frosset ved 20 ° C, før bruk.
  2. 10-20 min. før bruk, plassere alle intergrades inkludert: sterile DDW, 1 M NaOH sterile løsning, sterile 10 x PBS, skriver jeg kollagen fra rotte hale (lagret på 4 ° C for 3-måneder) og et sterilt rør inn is bøtte før helt avkjølt. Place is bøtte inne biologiske panseret.
  3. Forberede 1800 µL av kollagen blandingen i en siste konsentrasjon av 3 mg/mL, 6-vel HMCA invasjon analysen plate (300 µL per brønn) som følger. Legge til intergrades i avkjølt røret i følgende rekkefølge: 515 µL av DDW, 24.8 µL av 1 M NaOH og 180 µL av 10 x PBS. Bland godt av vortex og sted tilbake i isen. Endelig legge til 1080 µL av kollagen i blandingen, vortex igjen og satt tilbake i isen.

5. HA og kollagen blanding forberedelse

  1. Oppløse 10 mg av HA i 2 mL steril DDW. Inkuber blandingen på RT i noen minutter og vortex forsiktig til pulveret er fullstendig oppløst. Lagre lager løsningen på 4 ° C i opptil to år.
  2. Rett før bruk, sett HA lager løsningen i isen bøtte inne biologiske panseret.
  3. Forbered en 3 mg/mL kollagen blanding som beskrevet i trinn 4. Legge til 36 µg (7,2 µL) av HA i 1800 μL klar til bruk kollagen blanding, for en siste konsentrasjon på 20 µg/mL. Deretter vortex igjen kort og satt tilbake i isen.

6. ECM blanding tillegg

  1. Overføre HMCA platen, med 48-72 h spheroids, settefiskanlegg i biologiske panseret og plassere den på isen. Inkuber i 10 min til platen er avkjølt. Forvarm en løsning av 1% LMA 37 ° c i et vannbad.
  2. Fjern alle medium fra rundt HMCA, ved å lene tips slutten på kanten av makro-og plast nederst ved hydrogel matrisen. Deretter fjerne nøye, alle medium fra matrisen tanken med en fint tips/gel lasting tips, ved å lene tips slutten på matrisen kanten, sakte og forsiktig suger alle medium ut.
    Merk: Etter fjerner alle medium fra rundt hydrogel matrisen, matrise tanken er fremdeles fylt med medium. Dette mediet har å bli fjernet svært forsiktig for å unngå ødeleggelse av hydrogel MC og forvridning av spheroids.
  3. Ta 150 µL av kollagen blanding eller HA og kollagen blanding (ECM blanding) pre frosne fine spissen og legge i matrisen tanken ved spissen matrise kanten. Utgivelsen blandingen langsomt å unngå spheroid forvridning. Gjenta dette trinnet med en annen aliquot av 150 µL, for en total 300 µL per brønn. Følg samme fremgangsmåte for hver brønn til alle wells er fylt. Plass platen i inkubator 1t for full gelation av ECM.
  4. Når den fulle gelation av ECM er oppnådd, Pipetter 400 µL av forvarmes 1% LMA på ECM gel. Dekkramme med sin lokk, ruge platen på RT for 5-7 min og deretter 2 min på 4 ° C, agarose gelation. Til slutt Legg forsiktig 2 mL komplett medium ved å lene tips slutten på kanten av makro-og plast nederst.
    Merk: Agarose laget hindrer brøkdel av kollagen-gel matrix fra HMCA.

7. invasjonen analysen oppkjøp og analyse

  1. Last HMCA platen på motoriserte invertert mikroskop scenen utstyrt med en inkubator, pre justert til 37 ° C, 5% CO2 og fuktet atmosfære.
  2. Pre-bestemme stillinger for bildeopptak i hver frisk for å dekke hele matrisen området, og bruke 10 X eller 4 X mål (dette trinnet er nødvendig for bilde oppkjøpet programvaren som brukes her, se Materialer tabellen under for detaljer). Alternativt bruke bilde oppkjøpet programvare for å lette automatisk skanning av hele nødvendig området, ved å velge det «Stich» alternativet.
  3. Hente lysende felt (BF) bilder hver 2-4 h for en total periode av 24-72 timer for å kunne følge invasjonen av celler fra formet kroppen i omkringliggende ECM.
  4. Hente fluorescerende bilder for PI gjenkjenning ved hjelp av en dedikert fluorescerende kube (eksitasjon filter 530-550 nm, dichroic speil 565 nm lang pass og utslipp filter 600-660 nm).
  5. Eksportere time-lapse BF/fluorescerende bilder fra bildet oppkjøpet programvaren og lagre dem i merket image arkiv formatter (TIFF) til en egen mappe ved hjelp av kategorien "Database" i verktøylinjen, og deretter på "Export Registrer filer" -knappen.
    Merk: Vi utviklet en spesiell in-house analyse kode i MATLAB programvare som inkluderer en designet grafisk bruker grenseflate (GUI) i hvilke invasjon analyse kan utføres raskere og enklere. I denne analysen koden gjøres oppdeling av det spheroids og invasjonen halvautomatisk bruker Sobelrelieff-filteret etterfulgt av morfologiske operatørene erosjon og dilatasjon. Etter automatisk segmentering av områder, ble det gjort manuelle endringer der det er behov for bedre nøyaktighet. Etter segmentering er fullført, et sett med parametere ble automatisk beregnet av programmet og eksporteres til en excel-fil for ytterligere manipulasjon. Parameterene er: grunnleggende spheroid tverrsnitt område samtidig = 0, invasjon celleområde koblet til formet kroppen = viktigste invasjonen området av celler som er atskilt fra main invasjonen området, antall celler atskilt fra viktigste invasjonen området, gjennomsnittsavstand på invasjon fra grunnleggende spheroid senteret av massen til omkretsen av viktigste invasjonen området og atskilt celler og kollektive invasjonen avstand parameteren = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) av den X- og Y-formet senteret av massen koordinatene, før (X1, Y1) og etter (X2, Y2) kollektive invasjonen prosessen). Alternativt kan bildeanalyser gjøres med noen andre spesialisert programvare.
  6. Åpne GUI og trykk på knappen "Last BF" . Når bildet er åpnet, justere parameterne segmentering (minimum størrelse: > 1 og radius: > 1) for å oppnå en presis segmentering av formet og sin invasjon, deretter trykker "Region av interesse (ROI) segmentering" -knappen for kjøring og en ramme vises rundt hver formet. Hvis den automatiske segmenteringen er feil, trykk "Slett" eller "Legg til" og korrigere de forespurte manuelt. Gjenta de samme trinnene for påfølgende bilder.
  7. Trykk "Tracking" til å nummerere spheroids, og programvaren vil tildele samme tall for hver spheroid i hver tid lapse bilder. Deretter trykk knappen "Mål" , som vil generere et regneark med alle parametere. Lagre dette regnearket som en excel-fil for videre bruk i resultatene behandling og statistikk i excel programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den unike HMCA imaging platen brukes for invasjonen analysen av 3D svulst spheroids. Hele analysen, begynner med spheroid dannelse og slutter med invasjonen prosessen og flere manipulasjoner, utføres innen samme plate. For formet formasjon, HeLa celler er lastet inn i matrisen bassenget og bosette seg i hydrogel MCs av tyngdekraften. Hydrogel MCs, som har ikke-tilhenger/lav vedlegg egenskaper, lette celle-celle samspillet og dannelse av 3D svulst spheroids. Figur 2A illustrerer cellene i MCs, etter bruk av 150 x 103 celler/mL laste løsning (dvs., ~ 16 celler per MC beregnet verdi). Det er klart at belegget av celler per MC distribueres ikke jevnt gjennom matrisen, og den gjennomsnittlige innhentet flygninger fordelingen er 14.78 ± 3,60 celler per MC. Tabellen i figur 2B oppsummerer celle distribusjonen per MC for hele HMCA platen. Den gjennomsnittlige variasjonskoeffisienten (CV) fordelingens celle i en makro-brønnen er 43.33%, mens mellom makro-brønnene er det 24.37%. Forskjellene i cellen innkvartering er avgjørende og direkte diktere størrelsen på spheroids dannet og deres homogenitet hele platen. For å redusere/minimere variasjon opprettet av antall celler per MC, utføres analyse av resultatene på ett element oppløsning. Tomter i figur 2CD illustrerer (tverrsnitt område) størrelsesDistribusjon av 3-dagers spheroids. Det er tydelig eksemplifisert i figur 2D at beregne vekst forholdet mellom hver spheroid (tverrsnitt område på dag 3/dag 2) har en mer homogen distribusjon enn absolutt størrelsesDistribusjon (figur 2C), gir en CV av 15.48% til 52.80% henholdsvis. Spheroid diameter distribusjon av 3-dagers spheroids gir en CV på 24.52% vekst forholdet (diameter på day3/day2) er 7.45%. Disse CV-verdiene er lik17 eller høyere enn18 andre rapporter oppnå celle lasting av tyngdekraften. For å eliminere målt parameteren avviket skyldes variasjon i første seeded celle nummer per MC, er det best å normalisere de valgte parameterne til første celle nummer eller alle andre målte parametere av samme objekt, slik at hver spheroid har sin internkontroll. Denne tilnærmingen kan brukes enkelt ved å spore objektet på HMCA tenkelig tallerkenen.

Formet formasjon og vekst kan lett følges på HMCA imaging plate. Figur 3A-B viser en BF bilde av en region på HMCA imaging plate inneholder 24 h HeLa celle aggregater og respektive bildet av modne, 5-dag 3D flercellet objekter blir mer sfærisk og tettere. Det er tydelig vist at de fleste objektene beholder sin plassering under 5 dagers inkubasjonstid. Analyse av form (sphericity) og størrelse (tverrsnitt område) under spheroid dannelsen vises i Figur 3 c. Spredningsdiagram demonstrerer øker i begge parameterne fra dag 1 dag 5; 0.544 ±0.020 a.u. 0.684± 0.016 a.u. for sphericity (p < 0,05) og 0.00356± 0.00013 mm2 til 0.00538 ± 0.00015 mm2 for tverrsnitt område (p < 0,05), henholdsvis. Mens 24-h aggregater er små og ikke-vanlig form, de respektive 5 dagers spheroids er større og erverve sfærisk form.

Gjenkjenning av spheroid celle levedyktighet utføres ved hjelp av lav konsentrasjon PI til farging19 som omgår behovet for fargestoff vask. PI trenger cellemembranen, og deretter setter tiden inn i DNA av ikke-levedyktige celler. Figur 4A viser 5 dagers HeLa spheroids farget med PI (i rødt). Analyse av andelen røde området (representerer døde celler) ut av hver seksjon spheroid-området beregnes i figur 4B. Histogrammet viser at 85% av spheroid befolkningen har en maksimal verdi på 5% røde flekker og gjennomsnittet er 3.01 ± 2,34% (venstre histogram). Tverrsnitt område av spheroids (høyre histogram) viser en normalfordeling med gjennomsnittlig 0.02447 ± 0.00487 mm2.

Etter å produsere 3-dagers modne HeLa spheroids, utføres invasjon analysen innen HMCA imaging plate. Effekten av variabler, for eksempel ECM komposisjon, hemmere og aktivator, på 3D svulst spheroid invasjonen prosessen kan undersøkes. Invasjonen analysen ytelse, er mediet forsiktig fjernet og erstattet med ECM løsning pipette over spheroids i MC matrise bassenget. Etter den fulle gelation ECM løsningen, er komplett medium lagt i makro-brønnen. (1) for å undersøke påvirkning av HA på HeLa spheroid spontan invasjonen prosessen, spheroids var dekket med kollagen og HA blanding løsning (figur 5A) og sammenlignet med de dekket med kollagen eneste løsningen (figur 5C), og BF bildene ble anskaffet rett etter ECM gelation (t = 0 h). Den kinetiske invasjonen prosessen ble etterfulgt av imaging de samme områdene hver 5 h for en periode på 63 h. Etter 50 h med inkubering, spheroids innebygd i kollagen og HA (figur 5B) viste lavere celle spredning i omkringliggende ECM sammenlignet med spheroids i kollagen bare (figur 5 d). Analyse av invasjonen området kinetic over tid, for 99 spheroids med singel-formet oppløsning summeres i figur 5E. Figur 5E tomter mener/gjennomsnittlig invasjonen området over tid to gruppene, og tydelig viser at tillegg av HA til kollagen hemmer celle spredning av spheroid, resulterer i mindre invasjonen områder. Gjennomsnittet av bakken som følge av lineær regresjon justering kurver for hver av spheroids i kollagen (0.001973 ± 0.000894 mm2h) sammenlignet med kollagen og HA løsning (0.001410 ± 0.000941 mm2h) er betydelig forskjellige (p = 0.003, t-test: to utvalg med antatt like varianser). (2) for å undersøke påvirkning av Fisetin (et bioaktive flavonoid finnes i flere frukt og grønnsaker som viser cytostatic og migrastatic ved å handle på flere molekylære mål inkludert phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / Akt/c-juni N-Terminal kinaser (JNK) signalering og Wnt/β-catenin signalnettverk downregulates matrise metalloproteinases (MMPs) og andre20) på HeLa spheroid spontan invasjonen prosessen, økende konsentrasjoner av stoffet ble lagt til fullstendig mediet og BF bildene ble anskaffet på t = 0 (figur 6A) og 24 timer senere (figur 6BC). Som vist, hemmer 10 µM av Fisetin (figur 6C) spredning av celler rundt spheroids i forhold til ikke-behandlet HeLa spheroids (figur 6B). Invasjonen området analyse av en dose svar eksperiment (figur 6D) viser betydelig hemming på 10-40 µM av Fisetin (p < 0.003), å oppnå metning på konsentrasjonen av 10 µM og høyere. (3) det har vært vist som nei, på en nano-molar nivå, bidrar til en mer aggressiv bryst kreft fenotypen av stimulerende svulst ekspansjon og migrasjon16. Undersøke påvirkning av nei på kollektiv invasjonen prosessen med MCF7 spheroids i kollagen, 1 µM av diethylenetriamine/nitrat oksid donor (DETA/NO) ble lagt til fullstendig kultur medium og BF bildene ble anskaffet på t = 0 og t = 20 h. Dramatiska endringer i morfologi og plasseringen av 3D spheroids ved eksponering for ingen donor er tydelig (figur 7A-B). Spheroids mister deres sphericity og blir mer avlange å anskaffe amoeboid trekkfugler fenotypen. Samtidig, ble forbedret translokasjon av spheroids innenfor omkringliggende kollagen matrix observert (figur 7C). Gjennomsnittlig forlengelse verdien betydelig økt fra 1.305 ± 0.193 a.u. til 1.477 ± 0.298 a.u., (p < 0.0006). Gjennomsnittlig overføring avstanden for de samme spheroids betydelig utvidet, 0.0788 ± 0.0575 mm og 0.3164 ± 0.3365 mm i fravær og tilstedeværelsen av DETA/nei, henholdsvis (p < 4 x 10-6).

Bildeanalyse av spheroid invasjonen ble oppnådd ved halvautomatisk in-house MATLAB programvare. Ervervet tid lapse bilder av formet formasjon og invasjonen i HMCA består av mange spheroids i ett bilde (4-6 spheroids på 10 X forstørrelse og 25-30 spheroids på 4 X forstørrelse). Analyse av formet formasjon, vekst og invasjonen ble samtidig utført på alle spheroids i bildet. Nøkkelparameterne utdraget for spheroid invasjon presenteres i figur 8A, som viser et representativt bildesegmentering av 4 spheroids på et enkelt punkt (t = 16 h). Viktigste invasjonen området var definert av en rød kantlinje, samt atskilt cellene som fri og spredt rundt det (angitt med svarte piler), spores og nummerert for hver spheroid over tid. Spheroid størrelse før invasjonen på t = 0 er definert av en kantlinje. Mener/gjennomsnittlig invasjonen avstanden fra spheroid senteret av massen til invasjonen området omkretsen inkludert atskilt celler beregnes fra den omsluttede røde segmenteringen og angitt av gule piler. Utvunnet fra dette time-lapse eksperimentet summeres i figur 8B-D. Figur 8B utstillinger høyden mener invasjonen avstanden fra hver spheroid center over tid. Figur 8 c viser høyden av det totale området i hver av spheroids over tid (inkludert den viktigste invasjonen og skilt/frakoblet-celle). Figur 8D 1-4 viser omfanget av atskilt celle området i forhold til det totale området hver spheroid (over tid). Kumulativt antall fri celler er 33, 7, 4 og 5 for spheroids #1, #2, #3 og #4, henholdsvis. Analyse av kumulativ antall fri celler over 20 h invasjon fra 126 HeLa spheroids innebygd i kollagen er vist i figur 8E. Det er vist her at det er en stor distribusjon av fri celler i befolkningen undersøkt og gjennomsnittsverdien er 12.3 ± 12,8 celler.

Figure 1
Figur 1: The HMCA imaging plate. (A) bilde av en makro-vel preget med HMCA. (B) et tverrsnitt av en MC innen HMCA imaging plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: homogenitet av cellen distribusjon og formet vekst forhold i HMCA imaging plate. (A) en overlapping av BF og fluorescerende bilder av HMCA lastet med HeLa celler pre beiset med Hoechst 33342 1 µg/mL (lasting konsentrasjon 150 x 103 celler per mL). Bildene ble anskaffet rett etter den celle bosetningen i MC bildet forstørrelsen 4 X, skala bar = 500 µm. (B) tabellen oppsummerer fordelingen av HeLa celler innenfor HMCA-6-godt tenkelig platen. Cellene ble regnet fra 90 MC/makro-godt. Resultatene presenteres som betyr ± standardavviket (SD), CV (SD/mean100) beregnes i og mellom makro-brønnene. (C) fordeling histogram av seksjon 3 dagers spheroids, n = 418, bestemmes av BF bilder. (D) distribusjon histogram av spheroid vekst forhold (tverrsnitt område på dag 3/dag 2). Vekst forholdet beregnes på ett element oppløsning for hver av de 418 spheroids. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: spore formet formasjon i HMCA imaging plate. BF bilde av HeLa celler (lasting konsentrasjon 120 x 103 celler per mL) ruges i HMCA for 1 dag (A) og 5 dager (B). Bilde forstørrelse 4 X, skala bar = 500 μm. (C) Scatter handlingen i 3D-objektet sphericity som en funksjon av dens tverrsnitt område, etter 1 dag (blå ruter) og 5 dager (brun firkanter) inkubasjon innlegget celle lasting. Hver representerer analysert dataene fra en enkelt spheroid, n = 83. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: oppdagelsen av cellen levedyktighet i eldre spheroids. En overlapping av BF og fluorescerende bilder av 5 dagers spheroids (lasting konsentrasjon 360 x 103 celler per mL) farget med PI 0,25 µg/mL (A). Bilde forstørrelse 4 X, skala bar = 500 µm. (B) distribusjon histogram for prosent av PI området i forhold til seksjon området spheroid (venstre panel) og distribusjon histogram for tverrsnitt område (høyre panel), n = 84. Prosent av PI beregnet på ett element oppløsning for hver av de 84 spheroids. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: påvirkning av ECM komposisjon spheroid invasjonen forarbeide. BF bilder av 3 dagers HeLa spheroids innebygd i en blanding av 3 mg/mL kollagen og 20 µg/mL HA (A) og 3 mg/mL kollagen (C), ved t = 0 h og etter 50 h med inkubering (B) og (D), henholdsvis. Bilde forstørrelse 10 X, skala bar = 200 µm. HMCA imaging platen ble lastet inn på scenen av invertert mikroskopet utstyrt med inkubator. Bildene ble anskaffet hver 5 h og kinetisk analyse er presentert i handlingen (E), n = 99. Hver kurve representerer den gjennomsnittlig ± SD av invasjonen området øker over tid, for kollagen og HA (blå ruter) og kollagen bare (brun ruter). Gjennomsnittlig lineære regresjons-kurven og formel og R-kvadrert verdi er oppgitt over kurvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Fisetin hemmer spontan invasjonen av HeLa spheroids. BF bilder av 3 dagers HeLa spheroids, innebygd i en blanding av 3 mg/mL kollagen (A) på t = 0 og deretter 24 timer etter 0 µM (B) og 10 µM Fisetin (C) til fullstendig kultur medium. Bilde forstørrelse 4 X, skala bar = 500 µm. analyse av invasjonen område for hver spheroid på endepunktet (t = 24 h) vises i plottet (D), n = 488. Kurven representerer gjennomsnittlig ± SD invasjonen området som en funksjon av 0-40 µM Fisetin. Fisetin behandling betydelig hemmer invasjonen i 10 µM (P = 4.65 x 10-6), 20 µM (P = 0.0021) og 40 µM (P = 4.86 x 10-8), bruk av t-test: to utvalg med antatt like varianser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: ingen induserer kollektive invasjonen i MCF-7 bryst kreft spheroids. BF bilder av 2 day MCF-7 bryst kreft spheroids, innebygd i kollagen (A) ved (t = 0) og (B) etter 20 h eksponering for 1 µM DETA/nei. Spheroid ROI segmentering er definert av rød kantlinje, kledde og nummerert i rødt på BF bilder A og B. ROIs definert av kantlinjen, kledde på BF bilde B representerer spheroid størrelse og beliggenhet ved t = 0. Forstørrelse 4 X, skala bar = 500 µm. (C) A spredningsdiagram av sammenhengen mellom forlengelse faktor og migrasjon fra personlige bryst kreft spheroids ved eksponering 1 µM DETA/ingen (brun firkanter) i forhold til kontroll (blå diamanter) på t = 20 h, n = 54. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: HeLa celle spontan invasjonen bildeanalyser. BF bilder av 3 dagers HeLa spheroids, 16 h etter innebygging i kollagen (A). Forstørrelse 10 X. Spheroid invasjonen området og fri celler er definert av rød kantlinje, formet størrelsen på t = 0 er definert av kantlinjen, mener invasjonen avstand fra spheroid senteret av massen angis av gule piler og fri cellene angis med svarte piler. Tegne økningen over tid betyr invasjonen avstanden fra spheroid senteret av massen (B) og totale området (C). Kurvene representerer spheroid #1 (blå diamanter), formet #2 (brun ruter), formet #3 (grønne trekanter) og formet #4 (lilla Xs). (D) Bar diagram av (blå) og atskilt celle (brun) invasjonen området øker over tid. (E) distribusjon histogram for Kumulativt antall atskilt celler per spheroid under 20t med invasjonen prosessen, n = 126. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er godt dokumentert at levende organismer, preget av komplekse 3D flercellet organisasjonen er ganske forskjellige fra de vanlige 2D monolayer kultivert cellene, understreker avgjørende måtte bruke mobilnettet modeller som bedre etterligner funksjonene og prosesser av den levende organismen for narkotika screening. Nylig har flercellet spheroids, organotypic kulturer, organoids og organer på-chip vært introdusert8 for bruk i standardiserte medisiner. Men truer 3D flercellet modellens stor kompleksitet betydelig sin robusthet, parallelization og dataanalyse som er avgjørende for analysen effektivitet.

Kvantitativ vurdering av invasjonen kapasitet måler vanligvis bevegelsen av celler gjennom hydrogel materialer. For å måle svulst invasjonen med tradisjonell mikro-og plater, er mange kreftceller seeded i runde bunnplater og tvunget til samlet av sentrifugering21,22. Disse platene begrenser celle/spheroid samhandling i tilstøtende brønner, mens rundt bunnen hindrer den optiske kvaliteten og kompliserer bildeopptak. I andre metoder, enkeltceller tilfeldig omgitt av hydrogel, vokse og fungere i et 3D-miljø, men ikke nødvendigvis utvikle i eldre spheroids23,24. Videre er kompliserte prosedyrer for cellen plassering i hydrogel nødvendig, som magnetisk kraft-baserte celle mønster25 eller to-fotonet laser irradiation bioaktive hydrogels26.

HMCA-baserte teknologien presentert her viser seg for å være en fordel over metodene ovenfor: celle posisjonering, spontane aggregering og etablering av spheroids fra noen spredte celler kan lett oppnås, bruk av verdifulle begrenset mobilnettet eksempel (f.eks., stilk-lignende kreftceller eller primære celler avledet fra pasienten eksemplarer). Systemet har kontroll over både på innholdet i cellene som utgjør spheroids og nøyaktige romlige plassering under langsiktige eksperimenter. I tillegg den flate bunnen av MC muliggjør generering av mange spheroids på samme fokal plan, dermed raske belysning og bilde oppkjøp av store områder via et bredt felt mikroskop er mulig, eliminerer behovet for komplisert tidkrevende AC confocal mikroskopi. Systemet er lett å håndtere og praktiske sin gjennomførbart. Ved å bruke enkle operative prosedyrer, oppnådd vi high belegg spheroid befolkninger der ca 50% av spheroids har sammenlignbare størrelse og en pålitelig analyse av kreft cellen invasjonen kapasitet. I tillegg kan effekten av legemidler på invasjonen kapasitet analyseres samtidig med sin cytostatic og/eller cytotoksiske effekter ved hjelp av høyt innhold analyse tilnærming med HMCA enheten kultivert med mange spheroids. Videre i HMCA deler alle Mobiltlf elementer samme plass og medium, gjør det mulig å undersøke spheroid-formet interaksjon som er vanligvis formidlet via cellen-utskilles cytokiner, chemokines, hormoner og ECM27. Dette cross-talk forenkler overlevelse og funksjonen til individuelle celler/liten celle klynger i makro-og volum.

En avgjørende skritt i gjennomføringen av protokollen er tillegg av ECM blandingen på toppen av spheroids og validere sin riktig polymerisasjon. Spheroids vises ikke vandrende problemet selv om de er innebygd i ECM, montering og cross-linking oppstår, og aktuelle kollagen fibrene er dannet. Kollagen fibrene kan observeres av BF belysning, og vi anbefaler sjekker platen under et mikroskop til opprettelsen av kollagen fibrene på slutten av denne fasen. Siden spheroids er avhengig av første celle konsentrasjon og prosent av okkuperte MCs, matrisen skal kontrolleres etter første celle lasting, og hvis cellen personer ikke er optimal, re-såing av samme matrise kan utføres. Faktisk var størrelse og geometrien for HMCA beskrevet her tilpasset relativt liten celle klynger (opptil 150 µm i diameter). Dette kan anses en begrensning siden designe nye typer matrisen vil være nødvendig for å analysere celle migrasjon fra større celle strukturer.

Gjeldende plattform benytter minimal celle nummer og små reagensvolum, samtidig gir en stor utvalgsstørrelsen (tusenvis av spheroids per plate). For å analysere 12 ulike forbindelser for anti-metastatisk aktivitet være 2 enkelt 6-og HMCA basert plater nødvendig, gir resultatene fra ca 5000 spheroids, mens minst 50 96-brønns plater ville være nødvendig for å oppnå samme utfall. Muligheten til å analysere overføringen på individ-objekt oppløsning i HMCA gir en høy grad av statistisk robusthet og nøyaktighet, muliggjør studiet av strukturelle og funksjonelle invasjonen heterogene i mange spheroids.

Denne studien viser unikt kollektive invasjonen av bryst kreft spheroid bestander på eksponering DETA/nei. I celle klynger av MCF7 celler viser amoeboid trekkfugler fenotype, og kvantitative endringer i morfologi og plasseringen av hver spheroid automatisk kan oppnås. Til best av vår kunnskap er dette første plassert systemet som forenkler overvåkning og analyse av kollektive invasjonen i flere 3D-bygninger. Ved å analysere de relative retningene og invasjonen avstanden for hver spheroid, er det mulig å studere gjensidig samspillet mellom spheroids i befolkningen. I tillegg er etablerte påvirker ekstracellulære microenvironment faktorer kreft cellen atferd28 illustrert her. Blant disse faktorene har stivheten og sammensetningen av microenvironment vist å sterkt påvirke celle migrasjon. HMCA-teknologi gir en definert, biomimetic, i vitro plattform, der disse egenskapene av ECM kan enkelt åpnes og kontrolleres. Stivhet av rent collagen type I-hydrogel på konsentrasjonen av 3 mg/mL som ble brukt i denne studien er rapportert å være ca 50-600 Pa29,30,31 og tillegg av HA (20 µg/mL, 0.4 wt %) ikke endre stivhet av hydrogel betydelig32,33. Dermed undertrykkende effekten av middels molekylvekt (MMW)-HA på invasjonen av 3D HeLa spheroids som ble demonstrert her er ikke på grunn av stivhet endringer. Disse resultatene er med tidligere studier som viste en bimodale effekt av HA på kreft cellen invasjonen med høy avhengighet av HA molekylvekt34,35,36,37.

Fremtidige anvendelser av metodene omfatter sidestilt multi celle type dyrking av svulsten og stromal celler i forskjellige regioner i makro-brønnen, og henting av bestemte spheroids for nedstrøms molekylær analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av testamentere Moshe Shimon og Judith Weisbrodt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5, (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16, (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, (1), 33 (2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8, (12), e82811 (2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7, (1), 10784 (2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6, (1), 35544 (2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9, (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7, (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139, (2), 21005 (2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16, (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8, (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6, (1), 31063 (2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6, (1), 14114 (2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12, (23), 5007 (2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19, (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10, (1), 15001 (2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5, (2), 29 (2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18, (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9, (7), e103502 (2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29, (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20, (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6, (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9, (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6, (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5, (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28, (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375, (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29, (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9, (1), 91-92 (2015).
Analyse av kreft cellen invasjon og anti-metastatisk narkotikarelaterte Screening bruker Hydrogel mikro-kammer Array (HMCA)-baserte plater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).More

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter