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Developmental Biology

प्रौढ़ छल्ली के माध्यम से टयूब Drosophila लेग मोटर न्यूरॉन Axons

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58365
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, ENS de Lyon, CNRS, 2Departments of Biochemistry and Molecular Biophysics, and Neuroscience, Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Columbia University, 3Neuroscience Program, NYU School of Medicine

Summary

यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए निर्धारण, बढ़ते, इमेजिंग, और बाद इमेजिंग कदम से Drosophila के वयस्क पैरों में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लक्ष्यीकरण axonal कल्पना ।

Abstract

ंयूरॉन विनिर्देशन पर काम के बहुमत इस तरह सीके रूप में आनुवंशिक रूप से और शारीरिक रूप से परितंत्रीय मॉडल में किया गया है एलिगेंस, Drosophila लार्वा, और मछली, जो सभी undulatory आंदोलनों में संलग्न है (जैसे रेंगने या तैराकी) गतिवान के अपने प्राथमिक मोड के रूप में । हालांकि, व्यक्तिगत मोटर ंयूरॉन (MN) विनिर्देश के एक और अधिक परिष्कृत समझ-कम से कम रोग चिकित्सा सूचना के संदर्भ में-एक समान रूप से परितंत्रीय प्रणाली की मांग है कि बेहतर मॉडल जटिल संलग्न-आधारित गतिवान योजनाओं की रीढ़. चलने के आरोप में वयस्क Drosophila हरकत प्रणाली आसानी से इन मानदंडों के सभी मिलता है, इस मॉडल में आसानी से विशिष्ट पैर mns की एक छोटी संख्या के विनिर्देशन का अध्ययन करने के लिए संभव है (लगभग ५० mns प्रति पैर) दोनों एक विशाल का उपयोग शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों की सरणी, और एक संलग्न के शारीरिक संदर्भ में आधारित गतिवान योजना । यहाँ हम एक वयस्क मक्खी में पैर की मांसपेशी इन्नेर्वतिओन कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

Introduction

हड्डीवाला अंग की तरह, Drosophila वयस्क पैर क्षेत्रों में आयोजित किया जाता है । प्रत्येक मक्खी पैर में 14 मांसपेशियों, जिनमें से प्रत्येक कई मांसपेशी फाइबर1,2शामिल हैं । वयस्क पैर MNs के सेल निकायों T1 (वक्ष), टी 2 (mesothoracic), और T3 (metathoracic) गैंग्लिया ventral तंत्रिका कॉर्ड (VNC), एक संरचनात्मक हड्डीवाला रीढ़ की हड्डी (चित्रा 1) के अनुरूप के प्रत्येक पक्ष पर स्थित हैं । प्रत्येक गैंग्लिया में लगभग ५० MNs हैं, जो ipsilateral लेग (coxa, trochanter, फीमर, और टिबिया) (चित्रा 1)3के चार खंडों में मांसपेशियों को लक्षित करते हैं । महत्वपूर्ण बात, प्रत्येक व्यक्ति वयस्क लेग MN एक अद्वितीय रूपात्मक पहचान है कि अत्यधिक3,4जानवरों के बीच तोडऩे की है । ये सभी अनूठे अजेंडे 11 स्टेम सेल से प्राप्त हुए हैं, जिन्हें neuroblasts (NBs) लार्वा चरण3,4के दौरान लेग मनसे का उत्पादन कहा जाता है । लार्वा चरणों के अंत में सभी अपरिपक्व postmitotic मनसे उनके विशिष्ट वृक्ष arbors और axonal टर्मिनल लक्ष्य है कि उनके अद्वितीय आकृति विज्ञान3,4को परिभाषित प्राप्त करने के लिए कायापलट के दौरान अंतर । पहले हम परिकल्पना का परीक्षण किया है कि एक मिश्रित कोड प्रतिलेखन कारकों (TFs) प्रत्येक Drosophila वयस्क लेग MN5की अद्वितीय आकृति विज्ञान निर्दिष्ट करता है । एक मॉडल के रूप में, हम वंश बी, 11 नायब वंश जो सात अजेंडे से बाहर पैदा करता है और प्रदर्शन किया है कि postmitotic वयस्क पैर MNs में व्यक्त की TFs के एक मिश्रित कोड का इस्तेमाल उनके व्यक्तिगत morphologies हुक्म । एमएनएस के TF कोड को फिर से प्रोग्राम करके हम मार्लोन morphologies को पूर्वानुमानित तरीके से स्विच करने में सफल रहे हैं । हम इन tfs: mTFs (रूपात्मक tfs)5कहते हैं ।

वयस्क MNs के रूपात्मक विश्लेषण के सबसे चुनौतीपूर्ण भागों में से एक उच्च संकल्प के साथ एक मोटी और ऑटो फ्लोरोसेंट छल्ली के माध्यम से axons कल्पना है । हम आमतौर पर एक झिल्ली-टैग GFP है कि एक द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ MNs में व्यक्त की है के साथ axons लेबल, जैसे DVglut-Gal4/यूएएस-mCD8:: GFP या DVglut-QF/QUAS mCD8:: GFP, जहां DVglut में व्यक्त एक मजबूत चालक है motoneurons6. इस तरह के एक repressible मार्कर (MARCM)7, सीआईएस-MARCM8, या MARCMbow5के साथ मोज़ेक विश्लेषण के रूप में अन्य क्लोनिक तकनीकों के साथ इन उपकरणों के संयोजन से, हम GFP विश्लेषण कर एमएनएस के उपजनसंख्याों को phenotypic अभिव्यक्ति सीमित कर सकते हैं की axons आसान है । हम एक प्रोटोकॉल उत्पंन करने के लिए लेग MN axonal आकृति विज्ञान के लिए बरकरार रखने के लिए इमेजिंग और विशिष्ट मुद्दों को संबोधित द्वारा बाद में 3 डी पुनर्निर्माण इस तरह के रूप में वयस्क Drosophila पैर को आंतरिक (1) वयस्क पैर की आंतरिक संरचनाओं के निर्धारण axon आकृति विज्ञान, अंतर्जात फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति को प्रभावित किए बिना, और पैर पेशियां, (2) पैर के बढ़ते एक coverslip के तहत समग्र संरचना को बनाए रखने के लिए और इमेजिंग के लिए उपयुक्त अभिविंयास में, और (3) छवि प्रसंस्करण छल्ली प्राप्त करने के लिए पृष्ठभूमि के रूप में अच्छी तरह से axonal फ्लोरोसेंट संकेत । हालांकि इस प्रोटोकॉल MN axons में फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विस्तृत किया गया है, यह arthropods में पैर neuromusculature के अंय घटकों कल्पना लागू किया जा सकता है ।

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Protocol

1. लेग विच्छेदन और निर्धारण

  1. एक गिलास बहु अच्छी तरह से थाली ले लो और ७०% इथेनॉल के साथ कुओं की उचित संख्या में भरें । जोड़ें 15-20 CO2-anesthetized मक्खियों (या तो सेक्स और किसी भी उंर के) के लिए एक अच्छी तरह से और एक ब्रश का उपयोग करके, धीरे से मक्खियों को इथेनॉल समाधान में मक्खियों को पूरी तरह से जलमग्न हैं ।
    नोट: यह चरण छल्ली के hydrophobicity को दूर करने के लिए है । अधिक से अधिक 1 मिनट के लिए नहीं धो, क्योंकि यह छल्ली के ऑटो प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है ।
  2. ०.३% ईओण surfactant डिटर्जेंट समाधान 1x फास्फेट में खारा (पंजाब) के साथ मक्खियों 3 बार कुल्ला । इस समाधान में मक्खियों को कम से कम 10 मिनट के लिए रखें ।
    नोट: पैर बेहतर जब डिटर्जेंट, जो पैर के अंदर निर्धारण की पैठ बढ़ाने की संभावना है सहित तय कर रहे हैं ।
  3. 4% paraformaldehyde (पीएफए) की एक ट्यूब के साथ साथ बर्फ पर एक बहु-कुआं प्लेट रखें ।
    नोट: एक 16% पीएफए इथेनॉल मुक्त स्टॉक समाधान से ताजा 4% पीएफए की तैयारी महत्वपूर्ण है ।
  4. वक्ष खंड या पैरों को क्षति पहुंचाए बिना मक्खियों के सिर और पेट को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें ।
    नोट: पेट को निकालने से मक्खी पकड़ना आसान हो जाता है और पैरों को काटना है ।
  5. पैरों को वक्ष खंड से संदंश के साथ काटना और पैरों को 4% पीएफए युक्त कुएँ में रखें । इस के लिए, धीरे लेकिन दृढ़ता से धक्का coxa-छाती जंक्शन पर ठीक संदंश की नोक का उपयोग करते हुए पैर अलग ।
  6. 4 में 4% पीएफए रात भर में पैर ठीक डिग्री सेल्सियस (लगभग 20 एच कुल) ।
  7. ०.३% ईओण surfactant डिटर्जेंट समाधान 1x पंजाबियों, 5x 20 मिनट प्रत्येक के लिए के साथ पैर धो लो ।
  8. बढ़ते माध्यम के साथ वाशिंग बफर बदलें । बढ़ते माध्यम में पैर रखने के लिए कम से एक दिन पहले के लिए पैर में अपनी पूरी पैठ के लिए अनुमति बढ़ते रहते हैं ।
    नोट: यदि बढ़ते माध्यम अत्यधिक चिपचिपा है, बढ़ते मध्यम को 1x पंजाबियों के साथ ८०% पतला क्योंकि चिपचिपापन में अचानक परिवर्तन छल्ली के पतन और पैर की समग्र संरचना को नुकसान का कारण बन सकता है । Gal4 चालक के आधार पर, मक्खियों बढ़ते मीडिया में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 3 सप्ताह के लिए संरक्षित किया जा सकता है ।

2. लेग बढ़ते

  1. एक खुर्दबीन स्लाइड के बाएं हाथ की ओर ७०% ग्लिसरॉल के लगभग 20 µ एल प्लेस और एक वर्ग 22 x 22 मिमी2 coverslip (चित्रा 2a, बी) के साथ कवर । पिपेट के बारे में 10 µ एल के समानांतर एक लाइन के साथ और इस coverslip के दाहिने किनारे से एक छोटी सी दूरी पर बढ़ते मध्यम । बढ़ते मध्यम के एक और 30 µ एल जोड़ें स्लाइड के दाईं ओर (चित्रा 2c).
    नोट: जब पैरों पर एक coverslip आवेदन (नीचे देखें) बढ़ते मध्यम धीरे coverslip के नीचे और पैर के चारों ओर उंहें बिना जगह फैल जाएगा ।
  2. ठीक संदंश का उपयोग समाधान से पैर उठा और धीरे से यह बाईं coverslip के पास बढ़ते माध्यम पर डाल दिया । प्रत्येक पैर के लिए एक ही है और उंहें ऊपर से नीचे (चित्रा 2d) संरेखित करें ।
    1. लिफ्ट और संदंश के दोनों युक्तियों के बीच आयोजित माध्यम की एक बूंद में पैर हस्तांतरण । ओरिएंट दो मायनों में पैर: बाहरी पक्ष ऊपर या नीचे ।
  3. एक बार सभी पैरों को (6-8 पैर माउंट किया जा सकता है) ठीक से गठबंधन कर रहे हैं, पैरों पर एक दूसरे coverslip डाल ऐसी है कि इस coverslip पहले रखा coverslip (चित्रा 2E) पर थोड़ा आराम करने के लिए coverslip और ऊतक के बीच अंतरिक्ष के लिए अनुमति पैरों को क्षतिग्रस्त होने से रोकें (चित्रा 2g).
    नोट: वैकल्पिक रूप से, coverslip और स्लाइड के बीच स्थान बनाने के लिए स्टीकर वेल्स या orthodontic वैक्स का उपयोग करें.
  4. प्रत्येक कोने में coverslips की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए एक नेल पॉलिश का प्रयोग करें (चित्रा 2F).
    नोट: ऊतक अब छवि के लिए तैयार है ।

3. इमेजिंग

  1. दोनों GFP प्रतिदीप्ति और छल्ली ऑटो प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए एक साथ ४८८ एनएम लेजर और दो डिटेक्टरों का उपयोग कर एक एकल ट्रैक सेट करें । सीमा नियंत्रण या सॉफ्टवेयर के प्रकाश पथ खिड़की के वर्णक्रमीय खिड़की में स्लाइडर प्रदर्शन का उपयोग करना, एक डिटेक्टर की पहचान रेंज 498-535 एनएम के बीच (डिटेक्टर 1) सेट और एक दूसरे के 566-652 एनएम के बीच (वेक्षक 2) ।
    नोट: आमतौर पर, 1 डिटेक्टर एक GaAsP डिटेक्टर और डिटेक्टर 2 एक photomultiplier ट्यूब होना चाहिए । 498-535 चैनल इष्टतम GFP संकेत का पता लगाता है, लेकिन यह भी छल्ली से ऑटो प्रतिदीप्ति का पता लगाता है । हालांकि, 566-652 चैनल छल्ली (चित्रा 3ए) से केवल ऑटो प्रतिदीप्ति का पता लगाता है ।
  2. एक 20X या 25X तेल विसर्जन उद्देश्य, १०२४ x १०२४ पिक्सल संकल्प, 12 बिट गहराई का उपयोग करें, और Z रिक्ति सेट के रूप में 1 µm. सेट पिक्सेल लगभग १.५८ µs के रूप में समय, और औसत 2 फ्रेम/ उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ उद्देश्यों का प्रयोग करें ।
  3. सभी अंय सेटिंग्स सेट, फोकल माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है ।
    1. 566 से एक उज्जवल छल्ली संकेत प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें – 652 डिटेक्टर के बजाय से 498-535 डिटेक्टर. ऐसा करने के लिए, दोनों डिटेक्टरों के लिए ४८८-लेजर के एक ही लेजर शक्ति का उपयोग करें । संतृप्ति मार्कर का प्रयोग, पहले एक उज्ज्वल पर्याप्त GFP संकेत प्राप्त करने के लिए 1 डिटेक्टर के लाभ को समायोजित (चित्र 3 बी, डी). फिर 2 डिटेक्टर के लाभ को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि उच्च छल्ली संकेत के साथ कुछ क्षेत्रों (पैरों के किनारों, जोड़ों) इस डिटेक्टर (चित्रा 3सी, ई) में एक संतृप्त संकेत का उत्पादन.
    2. यदि पैर बढ़ाया है और बहुत बड़े एक एकल फ्रेम में imaged हो, माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर से टाइल या स्थिति विकल्प का उपयोग करें ।
  4. अंतिम छवियों का पुनर्निर्माण या तो मालिकाना माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर या ImageJ/फिजी फ्रीवेयर का उपयोग कर (नीचे देखें) ।

4. पोस्ट इमेजिंग प्रसंस्करण

  1. ImageJ/फिजी में फोकल स्टैक खोलें ।
    1. का प्रयोग करें-स्वरूपों प्लगइन (Plugins । जैव प्रारूपों । फिजी में जैव प्रारूपों आयातक) छवियां है कि अंदर नहीं है खोलने के लिए । स्वामित्व इमेजिंग सॉफ्टवेयर संकुल9से TIF प्रारूप ।
  2. छवि का चयन करके चैनल भाजित । रंग | चैनल विभाजितकरें ।
    नोट: कई पदों से चित्र बनाया गया है और संयुक्त होना चाहिए थे, तो (Plugins > सिलाई > pairwise सिलाई)10,11से फिजी में pairwise सिलाई प्लगइन का उपयोग करें ।
  3. GFP संकेत से छल्ली संकेत घटाना, छवि कैलकुलेटर खुला (प्रक्रिया | छवि कैलक्यूलेटर): 1 डिटेक्टर 1 छवि के रूप में से ढेर का चयन करें (GFP + छल्ली) (चित्रा 4a), ऑपरेशन विंडो पर घटानाचुनें, और 2 2 छवि (छल्ली) (चित्रा 4B) के रूप में डिटेक्टर से ढेर का चयन करें. नतीजतन, केवल अंतर्जात GFP संकेत (GFP) प्राप्त की है (चित्रा 4c) ।
    1. वापस विलय इस ढेर (GFP) के साथ ' छल्ली-केवल ' ढेर 2 वेक्षक से प्राप्त (चित्रा 4B छवि । रंग | चैनल विलय) एक आरजीबी छवि ऊतक विशिष्ट GFP संकेत के साथ ही छल्ली संकेत है, जो पैर क्षेत्रों (चित्रा 4d) के भीतर axon arbors की पहचान करने में मदद करता है के शामिल प्राप्त करने के लिए ।
    2. प्रत्येक छवि की कंट्रास्ट और चमक समायोजित करें (छवि । समायोजित करें । चमक/कंट्रास्ट) और फिर एक एकल RGB छवि उत्पंन (छवि । प्रकार | आरजीबी रंग) ।
      नोट: Z-स्टैक की अधिकतम प्रोजेक्शन जनरेट करने के लिए (छवि । पोट | जेड परियोजना...), GFP संकेत और छल्ली, जो तब चमक के लिए दो चैनलों विलय करने से पहले समायोजित किया जा सकता है के लिए औसत तीव्रता के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करें ।
  4. वैकल्पिक रूप से, स्वचालित घटाव और ImageJ/फिजी में छवियों के प्रसंस्करण के लिए एक मैक्रो का उपयोग करें । मैक्रो संपादक में पूरक फ़ाइल 1 में पाठ की प्रतिलिपि बनाएं (प्लगइंस । नये | मैक्रो), मैक्रो को Plugins फ़ोल्डर में सहेजें, और मैक्रो का उपयोग करने में सक्षम होने के लिए एक बार ImageJ/फिजी पुनरारंभ करें ।
    1. मैक्रो का उपयोग करने के लिए, फोकल स्टैक खोलें, और चमक/कंट्रास्ट विंडो खोलें (छवि । समायोजित करें । चमक कंट्रास्ट/ तो मैक्रो भागो (प्लगइन । स्थूल | भागो) और निर्देशों का पालन करें ।
    2. जब कार्रवाई (छवि कैलकुलेटर विंडो) को निर्दिष्ट करने के लिए कहा, स्टैक 1 (GFP), छवि 2 के रूप में स्टैक 2 (छल्ली), और घटानाछवि 1 का चयन करें ।
      नोट: मैक्रो प्रोसेस्ड GFP सिग्नल (MAX_Result of stack1), छल्ली (AVG_stack2) का औसत प्रोजेक्शन, substraction स्टैक से छल्ली स्टैक के GFP का परिणाम (stack1 का परिणाम), और अनप्रोसेस्ड की एक अधिकतम प्रोजेक्शन छवि जनरेट करता है. छल्ली पोट (stack2).
    3. जब इसके विपरीत समायोजित करने के लिए कहा, चमक में नियंत्रण का उपयोग करें/GFP की अधिक से अधिक प्रक्षेपण छवि की चमक/कंट्रास्ट समायोजित करने के लिए, और छल्ली के औसत प्रक्षेपण के, दोनों संकेतों की एक आरजीबी विलय छवि उत्पंन करने के लिए GFP में दिखा हरे और भूरे रंग में छल्ली । stack1 के परिणाम मर्ज, और stack2, इसी तरह एक संयुक्त GFP और छल्ली स्टैक है कि अगले चरण में इस्तेमाल किया जा सकता उत्पंन करने के लिए ।
  5. तीन आयामों में पैर कल्पना, नव जनित ढेर (चित्रा 4E) के साथ विशेष 3 डी सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।
    1. 3 डी सॉफ्टवेयर के साथ आरजीबी स्टैक खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें). पॉप-अप संवाद विंडो में, मोड रूपांतरण अनुभाग में सभी चैनलों का चयन करें और एक voxel (पिक्सेल की मात्रा) का आकार दर्ज करें.
      नोट: सभी आवश्यक जानकारी जो भी मालिकाना माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर इस्तेमाल किया जा रहा से छवि फ़ाइलों में निहित है ।
    2. चैनल पर 2 मॉड्यूल (GFP संकेत), राइट-क्लिक करें और का चयन करें प्रदर्शन । volren। उसके बाद, volren मॉड्यूलपर बाएँ क्लिक करें । गुण अनुभाग में (स्क्रीन के नीचे बाएं) संपादित करें पर बाईं ओर क्लिक करे और volrengreen. कर्नलका चयन करें । चैनल पर 1 मॉड्यूल (छल्ली संकेत) राइट-क्लिक करें और का चयन करें प्रदर्शन । volren। उसके बाद, volren मॉड्यूलपर बाएँ क्लिक करें । गुण अनुभाग बाएँ- उन्नत पर क्लिक करें और ddr (एक पारदर्शी रेडियोग्राफ़-जैसे प्रदर्शन) का चयन करें, फिर छल्ली पृष्ठभूमि (चित्र 4E) को देखने के लिए गामा मान को समायोजित ।
    3. एक 3d घुमाव जनरेट करने के लिए, प्रोजेक्ट स्टैक मॉड्यूल पर राइट-क्लिक करें । फिर चेतनका चयन करें । घुमाएं । घुमाएँ मॉड्यूल पर बाएँ क्लिक करें.
    4. गुण अनुभाग में उपयोग bbox केंद्रपर क्लिक करें । घुमाएँ मॉड्यूल पर राइट-क्लिक करें और का चयन करें गणना । मूवी मेकर। मूवी मेकर मॉड्यूल पर बाईं माउस बटन क्लिक करें । गुण अनुभाग में बाएं-बाएं क्लिक करें (गुण अनुभाग के ऊपर दाईं ओर) उंनत पर ।
    5. फ़ाइल का नाम फ़ील्ड में चलचित्र घुमाव का नाम भरें । गुणवत्ता के क्षेत्र में 1 (अधिकतम गुणवत्ता) लिखें । २०० पर फ्रेम छोड़ अगर एक ८.३ एस रोटेशन वांछित है (इस संख्या में कमी या रोटेशन की गति को संशोधित करने के लिए बढ़ सकता है) । फिर लागू करें (हरे बटन, गुण अनुभाग के नीचे छोड़ दिया प्रेस ( वीडियो 1देखें)) ।

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Representative Results

के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, यह प्रक्रिया GFP के उत्कृष्ट इमेजिंग-वयस्क Drosophila पैर में axons लेबल की अनुमति देता है, एक साथ अपने टर्मिनल arbors के साथ । महत्वपूर्ण बात यह एक स्वच्छ GFP संकेत पैर छल्ली द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति से किसी भी संक्रमण के बिना प्राप्त की है । छल्ली से संकेत तो GFP संकेत के साथ जोड़ा जा सकता है पैरों में axons की स्थिति की पहचान (चित्रा 4E, चित्रा 1, और वीडियो 1) । गंभीर रूप से, यह अच्छी तरह से तय पैर प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । चित्रा 5 एक अच्छी तरह से तय (चित्रा5) और एक बुरी तरह से तय पैर (चित्रा 5B) के उदाहरण से पता चलता है । पूर्व मामले में पैरों के अंदर आंतरिक संरचनाएं एक समान रंग की होती हैं और tracheas, जो अँधेरे होते हैं, दिखाई देते हैं. एक मुख्य सांस ट्यूब प्रत्येक पैर खंड के केंद्र में चलाता है (मुख्य तंत्रिका ट्रंक के निकट) और कई पतले असर भी दिखाई दे रहे हैं । उत्तरार्द्ध में, अंधेरे सामग्री टैसास और टिबिया में मौजूद है और सांस प्रणाली फीमर और coxa में स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं है: ऐसे मामलों में यह हमेशा देखा है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन से संकेत कम तीव्रता या अनुपस्थित पूरी तरह से नीचा किया जा रहा है । दूसरा, पैरों के सावधान विच्छेदन सभी पैर क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है (coxa से टिबिया) और पैरों को यांत्रिक सदमे से बचने के लिए । तीसरा, पैर बढ़ते मध्यम में लंबे समय के लिए यह पैरों के अंदर घुसना करने के लिए पर्याप्त छोड़ दिया जाना चाहिए । कई बार लेग सेगमेंट, विशेष रूप से फीमर, संक्षिप्त दिखाई देते हैं — यह निर्धारण और/या बढ़ते माध्यम के प्रवेश की कमी के कारण हो सकता है । अंत में, एक उच्च गुणवत्ता माइक्रोस्कोप उद्देश्यों का उपयोग करना चाहिए, क्षेत्र के संकुचन के लिए सही और विशेष रूप से प्रतिदीप्ति और/apochromatic के लिए बनाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क Drosophila पैर मोटर प्रणाली के स्कीमा । वयस्क लेग एमएनएस (ग्रीन) के कोशिका निकायों को VNC के वक्ष नाड़ीग्रंथि के प्रांतस्था (ग्रेन) में स्थानीयकृत कर रहे हैं । एमएनएस ने लेग neuropil (ब्लू) में अपने dendrites को arborize और उनके axons को लेग में 14 लेग मांसपेशियों (red) में से एक अंदर आना के लिए भेज दें । ध्यान दें कि केवल T1 पैर schematized हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रक्रिया माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पैरों को माउंट करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: इमेजिंग प्रक्रिया । (क) GFP और लेग छल्ली के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ४८८ एनएम आर्गन लेजर उत्तेजना का उपयोग कर, GFP और Drosophila के पैरों की है कि क्रमशः व्यक्त नहीं GFP के पैर व्यक्त की वर्णक्रमीय इमेजिंग का उपयोग कर प्राप्त की । ध्यान दें कि प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्यीकृत नहीं किया गया है, जैसे, कच्चे डेटा से कर रहे है एक ही मापदंडों का उपयोग (उद्देश्य, बढ़ते मध्यम, लेजर शक्ति, फोकल एपर्चर, लाभ, ऑफसेट) लेग इमेजिंग प्रक्रिया के लिए के रूप में । यह भी दिखाया गया है डिटेक्टर खिड़कियों इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया GFP + छल्ली प्रतिदीप्ति (डिटेक्टर 1: ग्रीन) और छल्ली (वेक्षक 2: गुलाबी), GFP बनाम छल्ली पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रा पर आधारित है । (ख, ग) mCD8 के साथ लेबल पैरों की फोकल धारा:: डी VGlut के नियंत्रण के तहत GFP-1 डिटेक्टर से प्राप्तGal4 (ख) और 2 डिटेक्टर (सी). (डी, ई) (बी, सी) क्रमशः छवि के लिए प्रयुक्त संतृप्ति मार्कर सेटिंग्स (स्पष्टीकरण के लिए पाठ देखें): नीला नहीं संकेत, लाल संतृप्ति. 1 डिटेक्टर पर मुख्य तंत्रिका पटरियों संतृप्त कर रहे हैं कि ध्यान दें, 2 डिटेक्टर पर जबकि छल्ली के कुछ क्षेत्रों संतृप्त कर रहे हैं (तीर देखें). स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ImageJ/फिजी का उपयोग कर छवियों का प्रसंस्करण । (A) 498-535 एनएम डिटेक्टर से प्राप्त फोकल स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण । (ख) 566-652 एनएम डिटेक्टर से प्राप्त फोकल स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण । (ग) केवल GFP संकेत के साथ छवि (ए) से (ख) से घटाकर प्राप्त की. (घ) (ख) और (ग) की छवियों का विलय । (ङ) 3-डी का पुनर्निर्माण (ग) । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: विच्छेदित पैरों की कम शक्ति देखने के उदाहरण अच्छा (क) और बुरा (ख) निर्धारण दिखा । स्केल बार = २०० µm। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video
वीडियो 1: GFP की मूवी-लेबल axons (हरा) एक पैर के छल्ली (ग्रे) के साथ एक साथ । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

वयस्क Drosophila के छल्ली और अंय arthropods, जो कई काले pigments शामिल हैं, उनके शरीर के अंदर संरचनाओं को देखने के लिए एक बड़ी बाधा है । इसके अलावा, यह दृढ़ता से ऑटो फ्लोरोसेंट जो खराब निर्धारण के द्वारा किया जाता है । इन दो सुविधाओं फ्लोरोसेंट रंजक या एक exoskeleton के साथ पशुओं के शरीर के अंदर अणुओं की टिप्पणियों के लिए बहुत समस्याग्रस्त हैं ।

प्रक्रिया है कि हम और वर्णन किया है कि हम नियमित रूप से प्रयोगशाला में उपयोग axon पथ और वयस्क Drosophila पैरों में अपने टर्मिनल अंत के स्वच्छ और विस्तृत छवियों की पैदावार । महत्वपूर्ण बात यह एक स्वच्छ GFP संकेत पैर छल्ली द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति से किसी भी संक्रमण के बिना प्राप्त की है । इस सुविधा के क्रम में करने के लिए कल्पना और axon arbors 3d इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग कर के तीन आयामी सुविधाओं quantitate करने में सक्षम होना अनिवार्य है । इस तरह से कई पैरों से प्राप्त आंकड़ों में तुलना की जा सकती है । प्रक्रिया आसानी से अंय फ्लोरोसेंट प्रोटीन से संकेत देख के लिए अनुकूलित है और आसानी से अंय वयस्क arthropods में axons छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

प्रक्रिया के दो महत्वपूर्ण पहलुओं मैं कर रहे हैं) एक मजबूत GFP संकेत प्राप्त करने के लिए, और द्वितीय) पैरों का उचित निर्धारण । बाद के लिए हम नियमित रूप से अच्छे निर्धारण प्राप्त करते हैं, फिर भी कुछ पैरों को कभी ठीक से तय नहीं कर रहे हैं । इसलिए, प्रक्रिया में सुधार किया जाना चाहिए, शायद एजेंटों कि (जैसे dimethylsulfoxide के रूप में), या निर्धारण के अंय साधन (माइक्रोवेव निर्धारण, अगर यह GFP प्रतिदीप्ति को बरकरार रखता है) के प्रवेश को बढ़ावा देने के जोड़कर, लेकिन हम इस संभावना का पता लगाया नहीं है ट्राइटन युक्त पंजाब में एक समय निर्धारण कदम का उपयोग करने के अलावा (जो काफी सुधार) । आदेश में एक अच्छा GFP संकेत पाने के लिए हम एक मजबूत घVglut-Gal4 चालक (भी कहा जाता OK371-Gal4) का उपयोग करें । यह भी एक अच्छा रिपोर्टर का उपयोग करने के लिए आवश्यक है-हम mCD8-GFP का उपयोग करें और भी cytoplasmic GFP या mCherry के साथ अच्छा संकेत प्राप्त किया है । बावजूद, हम रिपोर्टर का उपयोग करते हैं जिनमें प्राथमिक रिपोर्टर (hexameric) की कई प्रतियां और LexO या यूएएस साइट्स की कई प्रतिलिपियाँ होती हैं.

इस प्रक्रिया की एक सीमा है कि यह केवल तय ऊतक के लिए लागू होता है । वर्तमान में हम vivo टिप्पणियों में के लिए प्रक्रियाओं को विकसित कर रहे हैं और विभिन्न विकल्पों का परीक्षण कर रहे हैं (बढ़ते और सूक्ष्मदर्शी). फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक सीमा है कि यह पूरे पैर के माध्यम से देखने के लिए मुश्किल है: यह है क्योंकि गहरे झूठ बोल क्षेत्रों से संकेत के लिए GFP से सिग्नल बिखरा हुआ ऊतक के माध्यम से फैले हुए है । एकांतर से एक biphoton माइक्रोस्कोप पूरे पैर की मोटाई के माध्यम से इमेजिंग की अनुमति देता है ।

अंत में, अंय तरीकों के बढ़ते और निर्धारण4,12के विभिंन प्रकार का उपयोग करें । महत्व और हमारी प्रक्रिया की शक्ति है कि एक घटाव अंय (मुख्य रूप से cuticular) संकेतों से सच GFP संकेत अलग कदम उत्कृष्ट 3 आयामी पुनर्निर्माण और axons और उनके टर्मिनल arbors के दृश्य की अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मक्खी खाद्य माध्यम की तैयारी के लिए रॉबर्ट Renard धंयवाद । यह काम ALS एसोसिएशन (#256), FRM (#AJE20170537445) और ातिप-Avenir कार्यक्रम से J.E. करने के लिए R.S.M. और वित्त पोषण के लिए एक NIH अनुदान NS070644 द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol absolute Fisher E/6550DF/17 Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent Sigma-Aldrich T8787 Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps Sigma-Aldrich F6521 Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate Electron Microscopy Sciences 71563-01 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA Thermofisher 28908 Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol Fisher BioReagents BP 229-1 Glycerol (Molecular Biology)
Spacers Sun Jin Lab Co IS006 iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips Fisher Scientific FIS#12-541-B No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope Carl Zeiss LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat
25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/
silicon/glycerol/water
immersion) (420852-9871-000)
imaging software Carl Zeiss ZEN 2011
3D-Image software ThermoFisher Scientific Amira 6.4
ImageJ National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ ImageJ/FIJI

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १४० Drosophila लेग मोटर न्यूरॉन्स फोकल माइक्रोस्कोपी axons इमेजिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) छल्ली
प्रौढ़ छल्ली के माध्यम से टयूब <em>Drosophila</em> लेग मोटर न्यूरॉन Axons
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Guan, W., Venkatasubramanian, L.,… More

Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. J. Vis. Exp. (140), e58365, doi:10.3791/58365 (2018).

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