Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera axonal inriktning med ett fluorescerande protein i vuxen ben av Drosophila av fixering, montering, imaging och efter imaging steg.
Abstract
Merparten av arbetet på specifikationen neuronala har utförts i genetiskt och fysiologiskt eftertraktansvärda modeller såsom C. elegans, Drosophila larver och fisk, som alla bedriver undulatory rörelser (som kryper eller simning) som sin primära läge för förflyttning. Dock en mer sofistikerad förståelse av enskilda motorneuron (MN) specifikationen — åtminstone när det gäller att informera sjukdom terapier – kräver ett lika lätthanterlig system som bättre modeller komplexa bihang-baserade locomotion systemen i ryggradsdjur. Adult Drosophila rörelseapparaten som ansvarar för promenader uppfyller alla dessa kriterier med lätthet, eftersom i denna modell är det möjligt att studera specifikationen av ett litet antal lätt urskiljas ben MNs (cirka 50 MNs per ben) båda med en stor utbud av kraftfulla genetiska verktyg, och i fysiologiska samband med ett bihang-baserade locomotion system. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera den ben muskler innervationen i en vuxen fluga.
Introduction
Som ryggradsdjur extremiteten, är Drosophila vuxen benet indelad i segment. Varje flyga ben innehåller 14 muskler, som består av flera muskelfibrer1,2. För de vuxna ben MNs cell organ ligger i T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) och T3 (metathoracic) ganglierna på varje sida av den ventrala nerv sladden (VNC), en strukturell analog med ryggradsdjur ryggmärgen (figur 1). Det finns cirka 50 MNs i varje ganglier, som riktar muskler i fyra segment av ipsilaterala benet (coxa, trochanter, lårbenet och skenbenet) (figur 1)3. Viktigt, har varje enskild vuxen ben MN en unik morfologisk identitet som är mycket stereotypa mellan djur3,4. Alla dessa unika MNs härleds från 11 stamceller, kallas neuroblasts (NBs) producerar ben MNs under det larval arrangerar3,4. I slutet av larval arrangerar alla skilja de omogna postmitotic MNs under metamorfos att förvärva sina specifika dendritiska arbors och axonal terminal mål som definierar deras unika morfologi3,4. Tidigare testat vi hypotesen att en kombinatorisk kod av transkriptionsfaktorer (TFs) specificerar av varje Drosophila vuxen ben MN5unika morfologi. Som modell använde vi härstamning B, en av de 11 NB härstamningar som producerar sju av MNs och visat att en kombinatorisk kod av TFs uttryckt i postmitotic vuxen ben MNs dikterar deras individuella morfologier. Av reprograming TF koden för MNs har vi kunna växla MN morfologier på ett förutsägbart sätt. Vi kallar dessa TFs: MTF-plattformar (morfologiska TFs)5.
En av de mest utmanande delarna av de morfologiska analyserna av vuxen MNs är att visualisera axoner genom en tjock och auto-fluorescerande nagelband med hög upplösning. Vi brukar märka axoner med en membran-taggade GFP som uttrycks i MNs med ett binärt uttryck system, såsom DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP eller DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, där DVglut är en stark drivkraft som uttrycks i motoneurons6. Vi kan begränsa GFP uttrycket till subpopulations av MNs att göra fenotypiska analysen genom att kombinera dessa verktyg med andra klonal tekniker såsom mosaic analys med en repressible markör (MARCM)7, cis-MARCM8eller MARCMbow5, av axoner lättare. Vi har genererat ett protokoll för att hålla benet MN axonal morfologi intakt för bildhantering och efterföljande 3D rekonstruktion av specifika frågor inneboende till vuxen Drosophila ben såsom (1) fixering av det inre strukturerar av vuxen ben utan att det påverkar axon morfologi, endogena fluorescerande uttryck och lägga benen på ryggenmuskulaturn, (2) montering av benet att bevara den övergripande strukturen under ett täckglas och i lämplig riktning för bildhantering, och (3) bildbehandling för att erhålla nagelbanden bakgrund samt axonal fluorescerande signal. Medan detta protokoll har varit detaljerade för detektion av fluorescerande uttryck i MN axoner, kan det användas för att visualisera andra komponenter i ben neuromusculature i leddjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ben dissektion och fixering
- Ta en glas flera tallrik och fyll lämpligt antal brunnar med 70% etanol. Lägg till 15 – 20 CO2-sövda flugor (av antingen kön och alla åldrar) till varje brunn och med hjälp av en borste, Dabba försiktigt flugorna i etanol lösningen tills flugor är helt nedsänkt.
Obs: Detta steg är att ta bort den vattenavvisande egenskaper av nagelband. Tvätta inte för mer än 1 min, eftersom detta ökar auto-fluorescens av nagelband. - Skölj flugor 3 gånger med 0,3% icke-jonaktivt ytaktivt ämne rengöringslösning 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Hålla flugorna i denna lösning i minst 10 min.
Obs: Ben är bättre fast när inklusive tvättmedel, vilket sannolikt ökar genomträngningen av fixeringsvätskan inuti benet. - Placera en flera platta på isen tillsammans med en tub av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
Obs: Beredning av färsk 4% PFA från en 16% PFA etanol gratis stamlösning är kritisk. - Använda pincett för att ta bort huvudet och buken Flugornas utan att skada segmentet bröstkorg eller ben.
Obs: Ta bort buken gör det lättare att hålla flugan och dissekera benen. - Dissekera benen från segmentet bröstkorg med pincett och placera benen i brunnarna som innehåller 4% PFA. För detta, tryck försiktigt men bestämt vid coxa-thorax korsningen med spetsen på fina peang tills benet lossnar.
- Fixa benen i 4% PFA övernattning på 4 ° C (cirka 20 timmar totalt).
- Tvätta benen med 0,3% icke-jonaktivt ytaktivt ämne rengöringslösning i 1 x PBS, 5 x 20 minuter varje.
- Ersätta tvätt bufferten med monteringsmedium. Håll benet i monteringsmedium för minst en dag före montering att möjliggöra dess komplett penetration in i benet.
Obs: Om monteringsmedium är mycket trögflytande, späd monteringsmedium till 80% med 1 x PBS eftersom plötslig förändring i viskositet kan orsaka nagelbanden att kollapsa och skada den övergripande strukturen av benet. Beroende på Gal4 föraren, kan flugor bevaras för 1 till 3 veckor vid 4 ° C i montering media till montering.
2. sträcka montering
- Placera ca 20 µL av 70% glycerol på vänster sida av ett objektglas och täck med ett täckglas för fyrkant 22 x 22 mm2 (figur 2A, B). Pipettera 10 µL av monteringsmedium längs en linje parallellt med och på ett litet avstånd från den högra kanten av detta täckglas. Lägga till en annan 30 µL av monteringsmedium ytterligare på höger sida av bilden (figur 2 c).
Obs: När tillämpa ett täckglas över benen (se nedan) monteringsmedium kommer försiktigt sprids under täckglaset och runt benen utan undantränger dem. - Med fin pincett lyft benet från lösningen och försiktigt lägga den på monteringsmedium nära det vänstra täckglaset. Gör samma sak för varje ben och justera dem från topp till botten (figur 2D).
- Lyft och flytta benen i en droppe av medium som hölls mellan båda tips av tången. Orientera benen på två sätt: externa sidan uppåt eller nedåt.
- När alla benen (upp till 6 – 8 benen kan monteras) är korrekt justerade, sätta ett andra täckglas över benen så att denna täckglas vilar något på det tidigare placerade täckglaset (figur 2E) att möjliggöra utrymme mellan täckglaset och vävnaden och att förhindra att benen från att få skadade (figur 2 g).
Obs: Alternativt använda klistermärke brunnar eller tandreglering vax för att skapa utrymme mellan täckglaset och bilden. - Använd ett nagellack för att säkra positionen för coverslips i varje hörn (figur 2F).
Obs: Vävnaden är nu redo att bild.
3. imaging
- Ställa in ett enda spår med 488 nm laser och två detektorer samtidigt för att få både god Jordbrukarsed fluorescens och nagelband auto-fluorescens. Med kontrollen utbud eller skjutreglaget displayen i fönstret ljusstrålen av programvaran spektrala fönster, ställa detektionsområdet av en detektor (detektor 1) mellan 498 – 535 nm och den andra en (detektor 2) mellan 566-652 nm.
Obs: Vanligtvis detektorn 1 bör en GaAsP detektor och detektorn 2 ett fotomultiplikatorn röret. 498-535 kanalen upptäcker optimalt GFP signal men också upptäcker auto fluorescens från nagelbanden. 566 – 652 kanalen identifieras emellertid endast auto fluorescensen från nagelbanden (figur 3A). - Använd en 20 X eller 25 X olja nedsänkning mål, 1024 x 1024 pixlar upplösning, 12-bitars djup, och Z avstånd såsom 1 µm. Ställ in pixel dwell tid som ca 1.58 µs och genomsnittlig 2 ramar/bild. Använda mål med hög numeriska bländaröppningen.
- Ställ in alla andra inställningar, beroende på confocal mikroskopet och bildbehandling programvara som används.
- Se till att få en ljusare nagelband signal från 566 – 652 detektorn snarare än från 498 – 535 detektorn. För att göra detta, Använd samma laser kraften av 488-laser för både detektorer. Med mättnad märkpennor först justera förstärkningen av detektor 1 att få en tillräckligt ljust GFP-signal (figur 3B, D). Sedan justera förstärkningen av detektor 2 att se till att vissa områden med hög nagelband signal (kanter av ben, lederna) producerar en mättad signal i denna detektor (figur 3 c, E).
- Om benet är utökad och för stor för att avbildas i en enda bildruta, Använd alternativet kakel eller Position från Mikroskop avbildningsprogrammet.
- Rekonstruera de slutliga bilder antingen använda egenutvecklade mikroskopet bildhanteringsprogram eller använda ImageJ/FIJI freeware (se nedan).
4. inlägg som tänkbar bearbetning
- Öppna de confocal stacken i ImageJ/FIJI.
- Använda Bioformats plugin (Plugins | Bio-format | Bio-formats importör) i FIJI att öppna bilder som inte är i. TIF-format från proprietary imaging programvara paket9.
- Dela upp kanalerna genom att välja bild | Färg | Split-kanaler.
Obs: Om bilder från flera befattningar var gjorda och måste vara rekombinerat, använda den parvisa sömmar plugin i FIJI från (Plugins > sy > Pairwise sömmar)10,11. - För att subtrahera nagelband signalen från GFP signalen, öppna bild räknaren (Process | Bild kalkylator): Välj stacken från detektor 1 som bild 1 (GFP + nagelband) (figur 4A), Välj subtraherai åtgärd-fönstret och välj stacken från detektor 2 som bild 2 (nagelband) (figur 4B). Som ett resultat erhålls endast den endogena GFP-signalen (GFP) (figur 4 c).
- Koppla tillbaka denna stack (GFP) med 'nagelband-bara' stacken erhållits från detektorn 2 (figur 4B bild | Färg | Lägg samman kanaler) att få en RGB-bild bestående av vävnadsspecifika GFP signalen samt nagelband signalera, som hjälper till att identifiera de axon arbors inom segmenten benet (figur 4 d).
- Justera kontrast och ljusstyrka för varje bild (bild | Justera | Brightness/Contrast) och sedan generera en RGB-bild (bild | Typ | RGB-färg).
Obs: Att generera en maximal projektion av Z-stacken (bild | Stackar | Z-projektet...), använda maximal intensitet projektion för god Jordbrukarsed signal och genomsnittliga intensitet för nagelbanden, som sedan kan justeras för ljusstyrka innan sammanslagning av de två kanalerna.
- Alternativt kan du använda ett makro för automatisk subtraktion och bearbetning av bilder i ImageJ/FIJI. Kopiera texten i kompletterande fil 1 i makroredigeraren (Plugins | Nya | Makro), spara makrot i Plugins mappen och starta om ImageJ/FIJI en gång för att kunna använda makrot.
- Använd makrot, öppna confocal stacken, och öppna fönstret ljusstyrka/kontrast (bild | Justera | Brightness/Contrast). Sedan köra makrot (Plugin | Makro | Kör) och följ instruktionerna.
- När du ombeds ange operation (bild calculator-fönstret), välja bild 1 som stack 1 (GFP), bild 2 som stack 2 (nagelband) och subtrahera.
Obs: Makrot genererar en maximal projektionsbild av bearbetade GFP signalen (MAX_Result av stack1), en genomsnittlig projektion av nagelband (AVG_stack2), resultatet av subtraktion av nagelband stacken från GFP stacken (resultatet av stack1) och den obearbetade nagelband stack (stack2). - När de ombads att justera kontrast, Använd kontrollerna i fönstret ljusstyrka/kontroll för att justera ljusstyrka/kontrast av maximal projektion bilden av god Jordbrukarsed och genomsnittliga projektionen av nagelband, att generera en RGB-sammanslagna bild av båda signaler som visar på god Jordbrukarsed i grön och nagelbanden i grått. Gå samman resultatet av stack1 och stack2, på samma sätt generera en kombinerad GFP och nagelband stack som kan användas i nästa skede.
- För att visualisera benen i tre dimensioner, använda specialiserade 3D programvara med de nyligen genererade stackarna (figur 4E).
- Öppna den RGB stacken med 3D programvara (se Tabell för material). I popup-dialogrutan, Välj alla kanaler i avsnittet läge konvertering och ange storleken på en voxel (volym av en pixel).
Obs: All nödvändig information finns i bildfiler från oavsett egenutvecklade Mikroskop programvara som används. - På kanal 2-modul (GFP signal), högerklicka och välj Display | volren. Sedan vänsterklicka på volren modul. Klicka vänster på Redigera i avsnittet egenskaper (nedre vänstra hörnet av skärmen) och välj volrengreen.col. Högerklicka på kanal 1 modul (nagelband signal) och välj Display | volren. Sedan vänsterklicka på volren modul. I avsnittet Egenskaper vänsterklicka på Avancerad och välj ddr (en transparent röntgenbild-liknande display), sedan justera gammavärdet för att se nagelband bakgrunden (figur 4E).
- För att generera en 3D-rotation, högerklicka på stacken projektmodulen. Välj sedan Animera | rotera. Vänsterklicka på modulen rotera.
- Avsnitt Klicka på använda bbox centeri boenden . Högerklicka på modulen rotera och välj Beräkna | movie maker. Klicka på vänster musknapp på modulen movie maker . I avsnittet properties vänsterklicka vänster på Avancerat (överst till höger i avsnittet Egenskaper).
- Fyll i fältet filnamn namnet på filmen rotation. I fältet kvalitet skriva 1 (max kvalitet). Lämna ram 200 önskas en 8,3 s rotation (detta antal kan vara minskade eller ökade för att ändra hastigheten på rotationen). Tryck sedan på tillämpa (gröna knappen, nedre vänstra hörnet av avsnittet egenskaper (se Video 1)).
- Öppna den RGB stacken med 3D programvara (se Tabell för material). I popup-dialogrutan, Välj alla kanaler i avsnittet läge konvertering och ange storleken på en voxel (volym av en pixel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 4visas detta förfarande möjliggör utmärkt avbildning av GFP-märkta axoner i vuxen Drosophila ben, tillsammans med deras terminal arbors. Viktigast av allt erhålls en ren GFP-signal utan all kontaminering från fluorescensen som avges av benet nagelbanden. Signalen från nagelbanden kan sedan kombineras med GFP signalen att identifiera placeringen av axoner i benen (figur 4E, figur 1och Video 1). Kritiskt, är det viktigt att få väl fast benen. Figur 5 visar exempel på en väl fast (figur 5A) och ett dåligt-fasta ben (figur 5B). I det förstnämnda fallet är de interna strukturerna inuti benen av en enhetlig färg och de tracheas, som är mörk, är synliga. En huvudsakliga trakeal röret körs i mitten av varje ben segment (anslutning till huvudstammen nerv) och många tunnare förgreningar är också synliga. I det senare, mörka material finns i tarsus och tibia och luftrör systemet är inte tydligt i lårbenet och coxa: i sådana fall alltid noteras att signalen från fluorescerande proteiner bryts ned av låg intensitet eller saknas helt. Andra, noggrann dissektion av benen är nödvändigt att få alla ben segment (från coxa till tibia) och att undvika mekanisk stöt till benen. För det tredje måste benen lämnas i monteringsmedium tillräckligt länge för att tränga in på insidan av benen. Ibland ben segment, särskilt lårbenet, visas kollapsade — detta kan bero på avsaknaden av penetration av fixativ eller monteringsmedium. Man slutligen måste använda hög kvalitet Mikroskop mål, korrigerat för planhet på fältet och speciellt utformad för fluorescens eller apokromatiska.
Figur 1: schemat för det vuxna Drosophila ben motoriska systemet. För vuxna benet MNs (grön) cell organ är lokaliserade i cortex (grå) av bröstkorg ganglion av VNC. MNs arborize deras dendriter i det ben neuropil (blå) och skicka sina axoner i benet att innerverar ett av 14 benmusklerna (röd). Observera att endast T1 benen är schematized. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: förfarandet att montera benen på objektglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Imaging förfarande. (A) utsläpp spectra av god Jordbrukarsed och ben nagelbanden med 488 nm Argon laser magnetisering, erhålls med spectral imaging av delar av benen som uttrycker GFP och ben av Drosophila som inte uttrycker GFP respektive. Observera att stödnivåerna som fluorescens inte har varit normaliserade, t.ex., är från rådata som använder samma parametrar (mål, montering lasereffekt, vinst, confocal bländare, medium, offset) som för benet imaging förfarande. Också visat är detektor Fönstren används för avbildning på GFP + nagelband fluorescens (detektor 1: grön) och nagelband (detektor 2: rosa), baserat på god Jordbrukarsed vs nagelband bakgrund spektra. (B, C) Confocal avsnitt ben märkt med mCD8::GFP under kontroll av DVGlut-Gal4 erhålls från detektor 1 (B) och detektor 2 (C). (D, E) Markör mättnadsinställningar används till bild (B, C) respektive (se text för förklaring): blå ingen signal, röd färgmättnad. Observera att de huvudsakliga nerv spåren är mättade på detektor 1, medan på detektor 2 vissa regioner av nagelband är mättad (se pilar). Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: bearbetning av bilder med hjälp av ImageJ/FIJI. (A) Max projektion av de confocal stackar som erhållits från 498-535 nm detektor. (B) Max projektion av confocal stacken erhållits från 566-652 nm detektor. (C) bild med bara GFP signal erhålls genom att subtrahera (A) från (B). (D) samman bilder av (B) och (C). (E) 3D-rekonstruktion av (C). Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: lågenergi-Visa dissekerade ben visar exempel på bra (A) och dålig b fixering. Skalstapeln = 200 µm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: filmen av GFP-märkta axoner (grön) tillsammans med nagelband (grå) av en leg. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nagelbanden vuxen Drosophila och andra leddjur, som innehåller många mörka pigment, är ett stort hinder för visning av strukturer inuti kroppen. Det är dessutom starkt auto lysrör som förvärras av fixering. Dessa två funktioner är mycket problematisk för observationer av fluorescerande färgämnen eller molekyler inuti kroppen av djur med ett exoskelett.
Förfarandet som vi har beskrivit och som vi använder rutinmässigt i labbet ger ren och detaljerade bilder av axon banor och deras terminal ändelser i vuxen Drosophila ben. Viktigast av allt erhålls en ren GFP-signal utan all kontaminering från fluorescensen som avges av benet nagelbanden. Denna funktion är obligatoriskt för att kunna visualisera och kvantifiera tredimensionella funktioner av axon arbors använder 3D-imaging program. På detta sätt kan data som erhållits från flera ben jämföras. Förfarandet är enkelt anpassas för att observera signaler från andra fluorescerande proteiner och lätt kunde användas till bild axoner i andra vuxna leddjur.
De två kritiska aspekterna av förfarandet är i) för att få en stark signal om GFP, och ii) korrekt fixering av benen. För den senare vi rutinmässigt få bra fixering, ändå vissa ben är ibland inte fast ordentligt. Därför förfarandet måste förbättras, kanske genom att lägga till agenter som marknadsför genomträngningen av reagens (såsom dimetylsulfoxid) eller andra medel för fixering (mikrovågsugn fixering, om den bibehåller god Jordbrukarsed fluorescens), men vi har inte utforskat denna möjlighet Bortsett från att använda en preinkubation steg i PBS med Triton (vilket avsevärt förbättrat fixering). För att få en bra GFP-signal använder vi en stark DVglut-Gal4 -drivrutinen (även kallad OK371-Gal4). Det är också nödvändigt att använda en bra reporter – vi använder mCD8-GFP och har också fått bra signaler med cytoplasmiska GFP eller mCherry. Oavsett, använder vi reportrar som innehåller flera exemplar av den primära reportern (hexameric) och flera kopior av LexO eller UAS platser.
En begränsning av detta förfarande är att det endast gäller fasta vävnad. Vi utvecklar för närvarande förfaranden för i vivo observationer och testar olika alternativ (montering och Mikroskop). En begränsning med konfokalmikroskopi är att det är svårt att visa genom hela benet: Detta beror på att signaler från djupt liggande områden signalen från GFP är spridda genom överliggande vävnaden. Omväxlande tillåter biphoton Mikroskop imaging genom tjockleken på hela benet.
Slutligen, andra metoder använder olika typer av montering och fixering4,12. Betydelsen och styrkan i vårt förfarande är att en subtraktion steg skilja sanna GFP signalen från andra (främst cuticular) signaler låter utmärkt 3-dimensionell rekonstruktion och visualisering av axoner och deras terminal arbors.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Robert Renard för förbereda flyga mat Media. Detta arbete var stöds av en NIH grant NS070644 till R.S.M. och finansiering från ALS Association (nr 256), FRM (#AJE20170537445) och ATIP-Avenir Program till J.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22 mm x 22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- ImageJ. Bio-Formats. , Available from: http://imagej.net/Bio-Formats (2018).
- ImageJ. Image Stitching. , Available from: http://imagej.net/Image_Stitching (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
