Summary
Das Protokoll beschreibt sondenschaft Erwachsenen Zebrafisch mit einem biologischen; dann zerlegen und zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR Darm vorbereiten. Diese Methode ermöglicht die Verwaltung von bioaktiven Substanzen, intestinale Aufnahme und der lokalen immun Reiz hervorgerufen zu überwachen. Es ist relevant für die Prüfung der intestinalen Dynamik von oralen Prophylaxe.
Abstract
Die meisten Krankheitserreger dringen in Organismen durch ihre Schleimhaut. Dies gilt insbesondere bei Fischen wie sie kontinuierlich zu einer mikrobiellen angereicherte Wasser Umwelt ausgesetzt sind. Entwicklung effektiver Methoden zur mündlichen Lieferung von immunstimulantien oder Impfstoffe, die das Immunsystem gegen Infektionskrankheiten zu aktivieren, ist höchst wünschenswert. Bei der Ausarbeitung prophylaktische Werkzeuge, werden gute experimentelle Modelle benötigt, um ihre Leistung zu testen. Hier zeigen wir eine Methode für die orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch und eine Reihe von Verfahren zu sezieren und zytometrie, konfokale Mikroskopie und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Analyse des Darms vorbereiten. Mit diesem Protokoll können wir präzise Volumen bis zu 50 µL für Fische mit einem Gewicht von ca. 1 g einfach und schnell, ohne Schädigung der Tiere verwalten. Diese Methode ermöglicht es uns, die Aufnahme direkt in Vivo eindringmittel gekennzeichneten Verbindungen durch die Darmschleimhaut und die immunmodulatorische Fähigkeit von solchen Biologics am lokalen Standort nach Intubation zu erkunden. Durch die Kombination von nachgelagerten Verfahren wie Durchflusszytometrie, Histologie, qPCR und konfokalen Mikroskopie des intestinalen Gewebes, können wir verstehen, wie immunstimulantien oder Impfstoffe in der Lage sind, die intestinale Schleimhaut-Hindernisse überqueren, durchlaufen die Lamina Propria und den Muskel, übt eine Wirkung auf die intestinalen mukosalen Immunsystems zu erreichen. Das Modell könnte verwendet werden, um Kandidaten orale Prophylaxe und Delivery-Systeme oder die lokale Wirkung von eine oral verabreichte bioaktive Verbindung testen.
Introduction
Das Ziel dieses Artikels soll in der Tiefe eine einfache Methode für die orale Intubation Zebrafisch, zusammen mit nützlichen verbunden nachgelagerten Verfahren beschreiben. Orale Intubation mit Zebrafisch ist ein praktisches Modell bei der Untersuchung von Infektionskrankheiten Dynamik, oralen Impfstoff/immunstimulierende Medikament/Nanoparticle Aufnahme und Wirksamkeit und Darm-Schleimhaut Immunität geworden. Zebrafisch orale Intubation wird zum Beispiel in der Studie von Mycobacterium Marinum und Mycobacterium Peregrinum Infektion1eingesetzt wurden. Lovmo Et al. auch zur erfolgreich dieses Modell Nanopartikel und M. Marinum mit dem Magen-Darm-Trakt von Erwachsenen Zebrafisch2liefern. Darüber hinaus verwendet Chen Et Al. Zebrafisch orale Intubation um zu zeigen, dass Drogen durch Nanopartikel verkapselt wann verabreicht über den Magen-Darm-Trakt, über die Blut-Gehirn-Schranke3transportiert wurden. Diese Autoren durchgeführt Intubation basierend auf der Gauvage-Methode von Collymore Et Al. beschrieben 4 mit einigen Änderungen. Allerdings hat sie kein sehr detailliertes Protokoll beschreibt die orale Intubation Verfahren bereitgestellt. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch aufbauend auf Collymore Et al. 4 wir sind weiter die Vorbereitung des Darms für nachgelagerte Analyse zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR.
Der Darm und vor allem seine Schleimhaut ist die erste Linie der Verteidigung gegen Infektion und die primären Ort der Nährstoffaufnahme5. Wenn die Epithelzellen und Antigen-präsentierenden Zellen in der Schleimhaut Barrieren Gefahrensignale wahrnehmen, ist eine sofortige angeborene Immunantwort ausgelöst. Als nächstes ist die hochspezifische adaptiven Immunantwort von T- und B-Lymphozyten6,7gegründet. Entwicklung von oralen Impfstoffen ist ein aktueller Schwerpunkt im Vaccinology. Solchen Impfstoffen wäre ein effektives Werkzeug, um den Organismus an exponierten Standorten aufgrund der spezifischen Reaktion der Immunzellen in der Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)8,9zu schützen. In der Aquakultur haben Schleimhaut-Impfstoffe offensichtliche Vorteile im Vergleich zu injizierbaren Impfstoffen. Sie sind praktisch für Massenimpfungen, weniger arbeitsintensiv, sind für die Fische weniger belastend und Jungfische verabreicht werden können. Dennoch müssen Schleimhaut Impfstoffkandidaten das zweite Segment der Darm erreichen, ohne in die Mundhöhle denaturiert wird. Sie müssen auch Schleimhaut Hindernisse überqueren, um Zugriff auf antigenpräsentierende Zellen (APCs), lokale und/oder systemische Reaktionen10zu induzieren. Daher unbedingt testen der Schleimhaut-Aufnahme durch die Kandidaten mündliche Antigene und ihrer Trägersysteme erreicht, sowie die Immunantwort hervorgerufen, bei der Entwicklung von oralen Impfstoffen.
In einem biomedizinischen Kontext entwickelt ein Modell, um die biologische Wirkungen von Verbindungen zu testen, nachdem orale Intubation von Interesse ist. Viele von den anatomischen und physiologischen Merkmale des Darms sind zwischen Bilaterian Linien mit Säugetieren und Knochenfische11konserviert. Diese orale Intubation Modell an nachgelagerte Analyse angeschlossen kann ein Werkzeug, um Einblicke in die menschliche Biologie sowie ein Testfeld für Biologics zur Verfügung zu stellen oder andere Substanzen in Vivo.
Die orale Intubation Protokoll kann von einem Bediener, z.B.erfolgreich administrieren bis zu 50 µL der Protein Nanopartikel Suspension mit einem Gewicht von 1 g, mit eine hohe Überlebensrate Fischen durchgeführt werden. Das Verfahren ist einfach einzurichten und schnell; 30 Fische können in 1 h intubiert werden. Das Protokoll für Darm Vorbereitung ist Schlüssel zur Bereitstellung von QUALITÄTSPROBEN Zell- und für die spätere Analyse. Der nachgeschaltete Ergebnisse Beispiele die zeigen das Protokoll nutzen bei der Beschaffung von Daten in Bezug auf intestinale Aufnahme und Qualität RNA für qPCR zu isolieren. Das Protokoll wäre von großem Nutzen für diejenigen, die ein geeignetes Modell, um die Dynamik von oralen Prophylaxe oder andere Verbindungen im Darm zu testen.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren Zebrafisch (Danio Rerio) wurden von der Ethikkommission der Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH Nummer 1582) im Einvernehmen mit der internationalen Leitprinzipien für Forschung an denen Tiere (autorisiert. EU 2010/63). Alle Experimente mit live Zebrafisch wurden bei 26 – 28 ° c durchgeführt.
1. Vorbereitung der Ausrüstung für orale Intubation
- Legen Sie ca. 1 cm von einem feinen Silikonschlauch auf einer 31 G Luer Lock Nadel an der Spitze der Nadel zu decken.
- Schnitt einer 10 µL Sterilfilter Pipette Tipp (ca. 2 cm), nehmen Sie das feinere Ende und legen Sie es über den Silikonschlauch als eine Hülle. Sicherstellen Sie, dass die Spitze der Nadel, um nicht zu verletzen, das Tier die Pipette hinausragt.
- Legen Sie die Nadel auf einer 100 µL Luer Lock Spritze.
Hinweis: Spülen Sie mit Ethanol und dann Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, finden Sie unter Materialien) gründlich zwischen den Behandlungen.
(2) die erforderlichen Lösungen
- Bereiten Sie 150 mg/L (für Anästhesie) oder 300 mg/L (für Euthanasie) Ethyl 3-Aminobenzoate Methanesulfonate (MS-222) Lösung mit Wasser aus dem Aquarium, wo der Zebrafisch sind gepflegt. Füllen Sie einen kleinen Behälter mit 1 L des Anästhetikums Lösung und halten Sie es belüftet.
- Füllen Sie einen anderen kleinen Behälter mit 1 L Aquarienwasser ohne MS-222 für Fische Erholung und halten Sie es belüftet.
- 50 mL 1 X PBS aus 10 x sterile Vorratslösung zu machen.
- Zytometrie Analyse/Darm Zelle isoliert Vorbereitung genügend frische 0,15 % Kollagenase Typ IV-Lösung für 1 mL pro Fisch aus einer Stammlösung oder Pulver in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 1 % V/V Penicillin und Streptomycin (siehe Material). Machen Sie Aliquote (1 pro Fisch) von 1 mL in 2 mL Zentrifuge Röhren. Bei 4 ° C bis 30 min vor der Dissektion Schritt halten.
- Zur Fixierung der konfokalen Mikroskopie/Probe bereiten Sie 50 mL frische 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung mit PBS-Puffer oder tauen Sie eine Stammlösung von-20 ° C-Gefrierschrank in einer Dampfhaube auf.
Achtung: PFA ist giftig. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt vor der Arbeit mit ihm. Handschuhe und Schutzbrille getragen werden sollte, und immer Lösungen in einer Dampfhaube lassen.
3. Herstellung der fluoreszierende Nanopartikel Suspension
- Beschriften Sie die Protein-Nanopartikel mit Atto 488-NHS Ester (siehe Tabelle der Materialien) oder einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Aufschwemmen der Nanopartikel in 0,1 M-Sodium Bicarbonat-Puffer bei der Konzentration von 2 mg/mL.
- Atto 488-NHS Ester in Amin-freie Dimethyl Sulfoxid (DMSO) 2 mg/ml auflösen. Halten Sie eine Aliquote von 10 µL Kennzeichnung Effizienz (Schritt 3.7-3.8) zu überprüfen.
- Mischen Sie die Nanopartikel und Atto 488-NHS Ester in einem Molverhältnis von 1:2 (Protein: Farbstoff) durch rühren in der Dunkelheit.
- Spin-down der beschrifteten Nanopartikel durch Zentrifugation bei 8.000 X g für 10 min bei Raumtemperatur, den überstand zu entfernen und halten sie zur Kennzeichnung (Schritt 3.7-3.8) zu überprüfen.
- Waschen Sie die markierte Nanopartikel durch resuspending in 1 mL 0,1 M Sodium Bicarbonat Puffer durch aufschütteln und pipettieren rauf und runter. Dann verwerfen des Überstands durch Zentrifugation bei 8.000 X g für 10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie Schritt 3.6 für 5mal.
- Das Pellet in 5 mL 0,1 M-Sodium Bicarbonat-Puffer in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen aufschwemmen und Aliquote fluoreszierende Nanopartikel in 1,5 mL Zentrifuge Röhren (30 Aliquote) zu machen. Spin-down bei 8.000 X g für 10 min bei Raumtemperatur, den überstand verwerfen und bei-80 ° C lichtgeschützt aufbewahren.
-
Messen Sie die Kennzeichnung Effizienz mit einem Microvolume Spektralphotometer.
- Nehmen Sie 1 µL der Originallösung Atto 488 Schritt 3.3 gehindert und verdünnen Sie es weiter in DMSO (z. B.01:20 nach dem Volumenverhältnis). Dies ist das Volumen, das molare Verhältnis von Protein-Nanopartikel und Atto 488 Mischung in Schritt 3.4 gewöhnen.
- 1 µL der gespeicherten überstand aus der Kennzeichnung Reaktion in Schritt 3.5 statt. Messen Sie die Absorption (abs) bei = 501 nm. Der Anteil der Kennzeichnung ist:
(
- Bereiten Sie vor dem Experiment die Nanopartikel Suspension auf die gewünschte Konzentration mit 1 X PBS-Lösung.
4. Zebrafisch Anesthetization und orale Intubation
- Schnell die Fische (> 0,5 g) mindestens 48 h vor dem Experiment, den Darm zu entleeren.
- Bewegen Sie die Fische (12 Fische) bis zu den experimentellen Tanks (6 L) eine Nacht vor dem Experiment zur Akklimatisierung12ermöglichen.
- Wirbel die Nanopartikel-Lösung gut (z. B. 2500 u/min und 30 s) und zeichnen Sie die gewünschte Lautstärke der Nanopartikel Suspension (z. B. 20 – 50 µL) in die Spritze an der geschützten Nadel befestigt.
- Legen Sie den Fisch in den belüfteten 150 mg/L MS-222-Lösung (siehe Abschnitt 2) bis sie auf den Boden des Tanks sinken und nicht auf eine Schwanzflosse Prise reagieren; Dieser Vorgang dauert weniger als 5 Minuten.
- Schnell die betäubten Fische mit einem Netz auf einem nassen Plastikbehälter übertragen, das Tier horizontal, um die Nadel zu stellen und sofort beginnen die orale Intubation zu orientieren.
- Vorsichtig unterstützen Sie die Fische mit einer Hand zu und öffnen Sie den Mund mit der anderen Hand unter Verwendung der geschützten Nadel. Sanft stechen Sie die Nadel nach unten die Speiseröhre um ca. 1 cm von der Mundöffnung.
Hinweis: Der Betreiber kann einen leichten Widerstand fühlen, wenn das Ende des der Pipettenspitze Gill übergeben hat. Achten Sie darauf, nicht die Nadel Eintrag Winkel auch vieles, was die Kieme Perforieren kann. - Injizieren Sie langsam die Nanopartikel Suspension zu den Fischen. Stellen Sie sicher, dass die Federung nicht nach außen durch die Kiemen oder den Mund fließt.
- Vorsichtig entfernen Sie die Nadel und legen Sie den Fisch in den Schmutzwassertank (siehe Abschnitt 2). Genesung dauert in der Regel innerhalb von 1 min.
- Überprüfen Sie den Fisch sorgfältig für jede Abweichung (z. B.Blutungen an den Kiemen ist ein Zeichen der Perforation).
- Sobald der Fisch erholt haben, kehren sie an die experimentelle Panzer.
5. Zebrafisch Darm Dissektion
- Nach einem bestimmten Zeitraum buchen Intubation (z. B. 5 h bzw. 24 h), legen Sie den Fisch mit einem Netz in 300 mg/L MS-222 Lösung für Euthanasie (siehe Abschnitt 2). Stellen Sie sicher die Kiemendeckel nicht mehr bewegt und es gibt keine Rute Prise Reflex. Fünf Minuten sind normalerweise ausreichend.
- Abholen der euthanasierten Tieres mit einem Netz und legen Sie es auf einem Filterpapier.
Hinweis: Das Filterpapier ist sehr nützlich für die selbstklebende Gewebe entlang der Darm entfernt. - Mit scharfe Dissektion Schere, machen Sie einen halbrunden Schnitt aus dem Anus, der Kiemendeckel und offenen Schnitt mit einer feinen Pinzette. Schneiden Sie beide Enden des Darms, nehmen Sie die inneren Organe, und legen Sie sie auf dem Filterpapier.
Achtung: Arbeiten schnell, Zellstoffwechsel und Tod zu reduzieren.
Hinweis: Alternativ, entfernen Sie das selbstklebende Gewebe mit PBS-Puffer und auf Eis. - Trennen Sie den Darm aus inneren Organen und achten Sie auf seine Orientierung (Anterior posterior Darm Segment) und ziehen Sie es heraus. Das vordere Segment des Darmes ist in der Regel breiter als posterioren Segment. Achten Sie darauf, um alle des Darms zu erhalten, wenn sezieren.
Hinweis: Das hintere Ende ist ganz fein und zerbrechlich in kleine Fische und brechen kann, besonders bei Tieren < 0, 7 g. - Rollen Sie den Darm auf dem Filterpapier mit einer Pinzette um das selbstklebende Gewebe aus dem Darm zu lösen.
- Fahren Sie mit den Darm auf verschiedenen nachgeschalteten Analysen (Abschnitte 6, 7 und 8) vorzubereiten.
6. Vorbereitung der Darmzellen für Zytometrie
- Bereiten Sie im Voraus Aliquote von 0,15 % Kollagenase Lösung (siehe Abschnitt 2.4).
Hinweis: Aliquote sollte bei Raumtemperatur bevor Sie fortfahren. - Optional: Fortsetzung von Schritt 5.5, Schlitz offen den Darm längs und mit 1 X PBS waschen.
- Mit einer Pinzette, legen Sie den Darm in die 2 mL Zentrifugenröhrchen mit 0,15 % Kollagenase Lösung gefüllt.
- Legen Sie die Röhren auf eine vertikale Labor Rotator für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Legen Sie den Darm auf ein 100 µm Zelle Sieb über eine 50 mL Zentrifugenröhrchen unterstützt. Unterteilen Sie den Darm mit einer 5 mL Spritzenkolben, 3 Mal mit 1 X PBS, sammeln die Durchströmung der Probe in der 50 mL Zentrifugenröhrchen waschen.
- Zentrifugieren Sie die 50 mL Zentrifugenröhrchen 400 X g für 10 min bei 4 ° C.
- Sorgfältig die Pipette aus den meisten des Überstands nicht verlieren die Zellen, von die einige zu den Schleim verbunden sein kann.
- Aufschwemmen Sie die Darmzellen am unteren Rand die Zentrifugenröhrchen mit 500 µL 1 X PBS und auf Eis bis zytometrie Analyse
- Filter-Proben durch einen 30 µm Zelle Filter in 5 mL Rundrohr unten für zytometrie.
- Legen Sie die Parameter (z. B. die Anzahl der Zellen für die Analyse, die Region von Interesse, Spannung und Entschädigung, Auswahl von Detektoren) auf eine Cytometer Ausrüstung (siehe Material).
- Sofort analysieren Sie die Zellen auf einem Cytometer, nach den Anweisungen der Einsatz13.
7. Vorbereitung Darm Cryosections für die konfokale Mikroskopie
- Füllen Sie den Kunststoff-Formenbau (siehe Tabelle der Materialien), halbe Lautstärke mit optimale Arbeitstemperatur (O.C.T.) Verbindung.
- Fortsetzung von Schritt 5.5 und unmittelbar nach der Dissektion, legen Sie vorsichtig den Darm in der Kunststoff-Formenbau. Stellen Sie sicher, dass der Darm vollständig eingebettet in die O.C.T.-Verbindung ist. Falls erforderlich, fügen Sie mehr O.C.T. Verbindung zu den Kunststoff-Formenbau.
Hinweis: Es wird empfohlen, den Darm mit einem "Z" Form in O.C.T. Verbindung einfach die natürliche Ausrichtung verfolgen zu platzieren. - Legen Sie den Kunststoff-Formenbau auf Trockeneis bis es undurchsichtig geht (weniger als eine Minute).
- Speichern Sie den Kunststoff-Formenbau bei-80 ° C für langfristige Nutzung oder Prozess sofort mithilfe des folgenden Verfahrens.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Schneiden Sie den gefrorenen Darm in 10 µm Abschnitte oder entsprechenden Dicke mit einem Kryostaten bei-20 ° c
- Den Darm Abschnitt mit einem feinen Pinsel auf einer Folie zu sammeln.
- Tauchen Sie die Folie in 4 % PFA für 15 min bei Raumtemperatur, die Probe zu beheben.
Achtung: PFA ist giftig. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt vor der Arbeit mit ihm. Handschuhe und Schutzbrille getragen werden sollte, und immer Lösungen in einer Dampfhaube lassen. - Waschen Sie die Folie 3 Mal mit 1 X PBS, 10 min.
- Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel und legen Sie ein Deckglas über die Probe.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Beobachten Sie die Probe unter einem confocal Mikroskop bei entsprechenden Vergrößerung.
8. Vorbereitung der Darm für Real-Time qPCR (RT-qPCR)
- Fortsetzung von Schritt 5.5, bringen Sie den Darm in einem kryogenen Fläschchen und frieren Sie schnell den Darm in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C bis zum Gebrauch ein.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Für die Homogenisierung, 200 µL von 2 % (V/V) gekühlt 1-Thioglycerol/Homogenisierung Lösung hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) oder alternative Homogenisierung Lösung für den Darm Probe.
- Arbeiten schnell, Homogenisieren die Darm Probe auf Eis mit einem Labor-Homogenisator mit hoher Geschwindigkeit (eingestellt auf 25 – 30.000 u/min) bis keine sichtbare Gewebe Fragmente erhalten. 3 Mal für 5 s ist in der Regel ausreichend.
- Isolieren der RNA mit einem kommerziellen kit (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend des Herstellers Anweisungen14 oder eine geeignete alternative Methode. Bei Bedarf speichern Sie die RNA bei-80 ° C für den Langzeiteinsatz.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Quantifizieren Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer15 und bewerten Sie die Qualität mit einer RNA-Analysator-16.
- Bereiten Sie 1 µg oder einer entsprechenden Menge an cDNA mit einer cDNA Synthese Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Folgen Sie für qPCR Analyse bitte der MIQE Leitlinien17. - Entwerfen Sie geeignete Grundierung Paare für das Gen/s von Interesse.
- Wählen Sie eine geeignete Referenz-gen und analysieren den Ausdruck jedes Gen durch eine RT-qPCR-Erkennung mit einem kommerziellen System kit (siehe Material).
Hinweis: zum Beispiel 5 µL SYBR green Supermix, 0,5 µM Primer, 2,5 µL verdünnter cDNA und 1,5 µL Wasser in einem Endvolumen von 10 µL für jede Vertiefung der qPCR Platte hinzufügen.
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Representative Results
Zebrafisch (durchschnittliches Gewicht: 1,03 ± 0,16 g) des gemischten Geschlechts wurden erfolgreich intubiert mit verschiedenen rekombinanten Proteins Nanopartikel (bakterielle Einschlusskörperchen) mit unseren hausgemachten orale Intubation Gerät (Abbildung 1). Wir haben erfolgreich die orale Intubation durchgeführt und erreicht eine niedrige durchschnittliche prozentuale Mortalität (6,8 %) (Tabelle 1). Zebrafisch waren entweder mit 30 µL oder 50 µL von Nanopartikel-Suspensionen intubiert und die Sterblichkeit innerhalb von 24 h Post Intubation berechnet wurde. Die Experimente wurden durchgeführt von zwei Betreibern, R hatte weniger Erfahrung im Umgang mit Zebrafisch orale Intubation als J. Die Ergebnisse zeigten, dass auch ein neuer Betreiber unabhängig voneinander die orale Intubation durchführen könnte experimentieren und leicht erreichen eine hohe Überlebensrate durch dieses Protokoll. Aus unserer Erfahrung die optimale Fischgröße beträgt 1 g, aber wir haben erfolgreich intubiert Fisch so klein wie 0,5 g.
Um besser zu verstehen, ob die fluoreszierende Nanopartikel IBsTNF (eine rekombinante Zytokin Protein nanostrukturierten als Einschlusskörperchen) Zebrafisch ist von unserer Methode übergeben und aufgenommen im Zebrafisch-Darm oder nicht, wir zytometrie durchgeführt Analyse. Die Nanopartikel (100 µg/Fisch, 50 µL) und PBS (Kontrolle) waren Zebrafisch (durch Intubation) oral verabreicht und Darm wurde um 5 h und 24 h Post Intubation seziert. Insgesamt Darmzellen wurden von Schritt 6 vorbereitet und durch den Nachweis der Fluoreszenz Emission Signal analysiert. Die repräsentative Histogramme der Fluoreszenzintensität und Punkt plottet der fluoreszierenden Zelle Prozentsatz sind in Abbildung 2dargestellt. Die Dichte der fluoreszierenden Zellen ist deutlich höher in Nanopartikel intubierten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe in 5 h und 24 h (Abb. 2A). Die Prozentsätze der fluoreszierenden Zellen sind deutlich höher in 5 h (46,3 %) und 24 h (43,0 %) der Nanopartikel intubiert Gruppen (Abbildung 2B).
Zu weiteren Studie, welche Teil der intestinalen Schicht der Nanopartikel Aufnahme beteiligt ist, haben wir konfokalen Mikroskopie-Analyse durchgeführt. Die Nanopartikel (20 µg/Fisch, 50 µL) und PBS (Kontrolle) wurden mündlich an Zebrafisch intubiert und der Darm wurde bei 5 h Post Intubation seziert. Die Darm Abschnitten wurden von tiefgefrorenem Gewebe Verfahren nach Schritt 7(Abbildung 3)vorbereitet. Die konfokale Bilder fluoreszierende Nanopartikel im Darm sind in Abbildung 3Bdargestellt. Die fluoreszierende Nanopartikel wurden im Zebrafisch Darm gefunden. Wir beobachteten die Fluoreszenz in den Epithelzellen, Lamina Propria und Muskelzellen.
Um zu überprüfen, ob wir durch unser Protokoll hochwertige RNA extrahieren konnte, analysierten wir die RNA aus dem Darm mit einem Bioanalyzer (auch bezeichnet als RNA-Analysator hier) extrahiert. Zebrafisch wurden mündlich mit PBS intubiert (50 µL) oder die Nanopartikel (20 µg/Fisch, 50 µL). Die Eingeweide wurden für die RNA-Extraktion bei 24 h Post Intubation seziert. Wir haben sieben RNA-Proben mit dem Analyzer zu testen. Wir fanden, dass alle getesteten RNA-Proben hohe RNA Integrität Zahlen im Bereich von 7,9 auf 8,9 (Abbildung 4).
Abbildung 1 : Orale Intubation Gerät. (A) Bild einer 31 G Luer Lock Nadel auf einer 100 µL Spritze mit dem Silikon Schlauch und Pipette Spitze Ende über die Spitze der Nadel fixiert. (B) ein vergrößertes Bild der Nadel Teil. Der schwarze Pfeil zeigt übersteigt das Pipette Spitze Ende der Spitze der Nadel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Flow Cytometry Analyse der fluoreszierende Nanopartikel im Zebrafisch Darm über orale Intubation. Zebrafisch mit PBS oder fluoreszierende IBsTNF behandelt wurden (100 µg) für 5 h und 24 h, beziehungsweise. (A) die repräsentativen Histogramme der Fluoreszenzintensität. (B) Punkt plottet Graphen der fluoreszierenden Zellen Prozentsatz. Jeder grüner Punkt stellt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen in eine einzelne, n ≥4. Daten repräsentieren Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Unterschiede wurden mit One-Way ANOVA analysiert. Signifikante Unterschiede in Bezug auf Kontrolle (**, p < 0,01) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Bilder der konfokalen Mikroskopie Analyse. Fische wurden mündlich mit PBS oder 20 µg/Fisch fluoreszierende Nanopartikel intubiert. Der Darm wurde bei 5 h Post Intubation seziert. (A) Zebrafisch Darm eingebettet in OCT Verbindungen. Der Darm wurde mit der natürlichen Ausrichtung einer Form "Z" (a: vordere Ende; p: hinteren Ende) gelegt. (B) konfokalen Mikroskopie Bilder von Zebrafisch-Darm. Die weißen Pfeile zeigen, dass die fluoreszierende Nanopartikel in der Darmschleimhaut aufgenommen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : RNA Analyzer virtuelle Gelbild zeigt RNA extrahiert aus 7 Zebrafisch Darm abgetastet Post Intubation. Probennummer 1 und 2 sind Gruppen von PBS intubiert und Probennummer 3 bis 7 sind Nanopartikel intubiert Gruppen. RNA-Integrität-Nummern (RIN) sind an der Unterseite von 7,9 bis 8,9 gegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Operator | Volumen | # Fisch intubiert | Mittlere Gewicht (g ± SD) |
# Todesfälle | Sterblichkeit (%) |
| R | 30 ΜL | 22 | 0,88 ± 0,14 | 3 | 13.6 |
| R | 30 ΜL | 17 | 0,93 ± 0,19 | 0 | 0 |
| J | 50 ΜL | 19 | 1.23 ± 0,31 | 1 | 5.2 |
| J | 50 ΜL | 30 | 1,08 ± 0,40 | 2 | 6.6 |
| Insgesamt | 88 | 1,03 ± 0,16 | 6 | 6.8 | |
| SD: Standardabweichung des Mittelwerts | |||||
Tabelle 1: Vergleich der Zebrafisch Sterblichkeit durch zwei Operatoren, die mit dem Protokoll verursacht. Der Operator-Identifikations-Code, intubierten Volumen, die Anzahl der Fische und Fische Gewicht in Gramm (g) werden angezeigt.
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Discussion
Dieses Protokoll ist eine Verbesserung der zuvor beschriebenen Technik für orale Intubation von Collymore Et al. 4 unser Protokoll beschreibt im Detail die orale Intubation Methode und umfasst die Vorbereitung des Darms für nachgelagerte Analysen. Unsere Methode verbessert Fisch Manipulation Geschwindigkeit, so dass eine Person das gesamte Protokoll schnell und ohne viel Variation zwischen den Betreibern durchführen. Ein Hauptunterschied von unserem Protokoll mit dem vorherigen ist, dass wir den Erfolg des Experiments orale Intubation nicht nur durch Beobachtung des Tieres für Wohlbefinden bewerten (z. B. keine Blutung) und für kein Durchsickern der Flüssigkeit verabreicht, sondern auch durch die Überprüfung die Aufnahme von bioaktiven Nanopartikel im Darm mit nachgeschalteten Analyse (zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR). Wir zeigen, dass intubierten eindringmittel beschrifteten Nanopartikel im Darm gefunden wurden.
Auf der praktischen Seite die Intubation Ausrüstung ist billig, präzise und wiederverwendbare: das Grundgerät besteht aus einem wiederverwendbaren 100 µL Glas (z. B.Hamilton) Spritze gekoppelt an eine 31 G-Nadel mit einem Stück Silizium auf der Oberseite. Eine geschnittene sterile Spitze über der Silikonschlauch gelegt wird und kann für jede einzelne Verwaltung geändert werden. Die Spritze ist wiederverwendbar und die dünne Nadel ermöglicht sondenschaft kleine Fische mit eine hohe Wahrscheinlichkeit des Erfolges. Darüber hinaus konnten geschnittene sterile Tipp direkt über die Nadel ohne der Silikonschlauch platziert werden, wodurch die Intubation Ausrüstung einfacher, in einem Labor gemacht werden. Die verabreichte bioaktive Verbindung ist deutlich sichtbar, und eine korrekte Handhabung leicht überwacht werden kann. Ein entscheidender Schritt bei der Intubation ist der Nadel-Eintrag. Es ist wichtig, dass die Nadel nicht gekippt oder zuviel eingefügt, um zu vermeiden, die Kiemen zu perforieren. Die Sterblichkeit bei dieser Methode beobachtet ist sehr niedrig (ca. 7 %) und hängt von der Größe des Fisches. Gill Perforation ist die häufigste Ursache des Todes Fisch und wenn es Fische sterben innerhalb der ersten Stunde passiert. Obwohl Fische von 0,5 g leicht intubiert werden kann ist die optimale Fischgröße etwa 1 g. Ein weiterer Unterschied zu der von Collymore Et Al. entwickelten Methode ist, dass die Fische für 48 h gefastet werden um sicherzustellen, dass die Magen-Darm-Trakt leer ist. Das ganze Intubation Verfahren kann sehr schnell erfolgen (30 Tiere/h) von einem Bediener und wichtiger ist, die Methode ist konsistent zwischen verschiedenen Betreibern4. Die Intubation-Methode ist leicht zu erlernen und erfordert nicht viel Übung zu meistern.
Der Darm Dissektion Verfahren muss ordnungsgemäß ausgeführt werden, um gute QUALITÄTSPROBEN für zytometrie, konfokale und qPCR-Analysen zu erhalten. Die entscheidende Schritt ist an dieser Stelle die Zerlegung des gesamten Darms; der hintere Abschnitt ist zerbrechlich und leicht zu verlieren. Sobald der Darm zerlegt ist, kann es für zytometrie (2 h-Protokoll), qPCR Analyse (2Std Protokoll bis total RNA Isolierung) oder konfokalen Mikroskopie (1 h, Proben für Cryosection bereit zu haben) weiterverarbeitet werden. Es ist sehr wichtig, um die Ausrichtung des Darms, vor allem für die konfokale Mikroskopie nachzuverfolgen. Zytometrie Analyse erfordert eine schnelle Verarbeitung, und das Verfahren nicht vor Abschluss beendet werden. In der Erwägung, dass RNA Isolation und Proben vorbereitet für Cryosection richtig gespeichert und jederzeit verarbeitet werden kann. Für zytometrie gute QUALITÄTSPROBEN ohne Schutt Verklumpung der Maschine können mit dieser Methode isoliert werden und schnelle Analyse auf das Vorhandensein von fluoreszierenden Zellen leicht auf Einzelpersonen durchgeführt werden kann. RNA-Qualitätsüberwachung zeigte, dass hochwertige RNA vom Darm ermöglicht Analyse der einzelnen Fische durch qPCR isoliert werden kann. Schließlich bietet die Cryosection Vorbereitung für die konfokale Mikroskopie wichtige strukturelle Informationen über die Protein-Nanopartikel-Aufnahme. Unsere Methoden stellen somit ein Modell, um die Dynamik von oralen Prophylaxe oder andere Verbindungen im Darm zu testen.
Die Einschränkungen unserer Studie sind die Größe der Fische, da wir nicht testen Verwaltung in Fische, die kleiner als 0,5 g und die Verwendung eines chemischen Betäubungsmittels die Tiere zu beruhigen. Einige Autoren verwenden Sie kaltes Wasser (0 – 4 ° C) um die Zebrafisch-18 zu betäuben aber unter dem Gesichtspunkt des Tierschutzes und europäischen rechtlichen Einschränkungen beschlossen wir, dass MS-222 die Methode der Wahl wurde.
Der Zebrabärbling bietet viele Vorteile gegenüber anderen Modellsysteme, die unter anderem einen kompletten Satz von Gen-Daten und die verfügbaren transgenen Linien. Für Immunologen stellen Sie die transgenen Linien (z. B. SF Mpx:GFP und Tg Mpeg1:GFP) eine Szene für die in-Vivo -Beobachtung der immunen Zellen wie z.B. Makrophagen und Neutrophilen19,20. Unsere orale Intubation und nachgelagerte Analyse mit transgenen Linien zu verbinden wäre ideal für die Ermittlung der Zelltypen, die mit der Aufnahme, Transport und Verarbeitung von orale Impfstoffe, Nanopartikeln und Krankheitserregern bei Fischen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Europäische Kommission und AGAUR Mittel zur NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER und 2014SGR-345 AGAUR) unterstützt. RT hält ein Pre-Promotionsstipendium aus AGAUR (Spanien), JJ wurde unterstützt durch ein Promotionsstipendium von der China Scholarship Council (China) und NR stützt sich auf das Ramón y Cajal-Programm (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Wir danken Dr. Torrealba für kompetente Beratung in Protein-Produktion, N. Barba aus "Servei de Microscopia" und Dr. M. Costa von der "Servei de Citometria" von der Universitat Autònoma de Barcelona für hilfreiche technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 mL homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
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