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Immunology and Infection

वयस्क Zebrafish के ओरल इंटुबैषेण: एक मॉडल के लिए एक अति सक्रिय यौगिकों के आंत्र का मूल्यांकन

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58366
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Institute of Biotechnology and Biomedicine (IBB-UAB), Universitat Autònoma de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Animal Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona

Summary

प्रोटोकॉल एक जीवविज्ञान के साथ intubating वयस्क zebrafish का वर्णन; इसके बाद cytometry, फोकल माइक्रोस्कोपी और qPCR के लिए आंत को विदारक और तैयार करते हैं । इस विधि की अनुमति देता है, सक्रिय यौगिकों के प्रशासन को आंतों के ऊपर की निगरानी और स्थानीय प्रतिरक्षा उत्तेजना पैदा की । यह मौखिक prophylactics के आंत्र गतिशीलता परीक्षण के लिए प्रासंगिक है ।

Abstract

अधिकांश रोगजनकों उनके म्यूकोसा के माध्यम से जीवों पर आक्रमण । यह मछली में विशेष रूप से सच है के रूप में वे लगातार एक माइक्रोबियल युक्त पानी के माहौल को उजागर कर रहे हैं । immunostimulants या टीके, जो संक्रामक रोगों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के मौखिक वितरण के लिए प्रभावी तरीकों का विकास अत्यधिक वांछनीय है । नियत्रंण उपकरण तैयार करने में, अच्छे प्रयोगात्मक मॉडल उनके प्रदर्शन का परीक्षण करने की जरूरत है । यहां, हम वयस्क zebrafish के मौखिक इंटुबैषेण और प्रक्रियाओं का एक सेट के लिए एक विधि दिखाने के लिए काटना और cytometry, फोकल माइक्रोस्कोपी और मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विश्लेषण के लिए आंत तैयार करते हैं । इस प्रोटोकॉल के साथ, हम ठीक ५० µ एल तक मात्रा प्रशासन कर सकते है लगभग 1 जी बस और जल्दी से वजन मछली, पशुओं को नुकसान पहुंचाए बिना । इस विधि हमें आंतों की श्लेष्मा झिल्ली और इंटुबैषेण के बाद स्थानीय साइट पर इस तरह के तर्कों की इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता द्वारा फ्लोरोसेंट बला यौगिकों के vivo में प्रत्यक्ष का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । इस तरह के प्रवाह cytometry, प्रोटोकॉल, qPCR और आंत्र ऊतक के फोकल माइक्रोस्कोपी के रूप में बहाव के तरीकों के संयोजन से, हम समझ सकते हैं कि कैसे immunostimulants या टीकों आंत्र श्लैष्मिक बाधाओं को पार करने में सक्षम हैं, लेमिना propria के माध्यम से पारित, और मांसपेशियों तक पहुँचने, आंतों श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रणाली पर एक प्रभाव डालती. मॉडल के लिए उंमीदवार मौखिक prophylactics और वितरण प्रणाली या किसी भी मौखिक रूप से प्रशासित सक्रिय यौगिक के स्थानीय प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है ।

Introduction

इस अनुच्छेद के लक्ष्य को गहराई में वर्णन करने के लिए zebrafish के मौखिक इंटुबैषेण के लिए एक सरल विधि है, साथ उपयोगी संबंधित बहाव प्रक्रियाओं के साथ । मौखिक इंटुबैषेण का उपयोग zebrafish संक्रामक रोग गतिशीलता के अध्ययन में एक व्यावहारिक मॉडल बन गया है, मौखिक वैक्सीन/immunostimulant, दवा/nanoparticle और प्रभावकारिता, और आंत्र श्लैष्मिक उन्मुक्ति । उदाहरण के लिए, माइकोबैक्टीरियम marinum और माइकोबैक्टीरियम peregrinum संक्रमण1के अध्ययन में zebrafish ओरल इंटुबैषेण का उपयोग किया गया है । Lovmo एट अल. इसके अलावा सफलतापूर्वक इस मॉडल का इस्तेमाल किया वयस्क zebrafish2के गैस्ट्रो आंत्र पथ को नैनोकणों और एम marinum उद्धार । इसके अलावा, चेन एट अल. प्रयुक्त zebrafish ओरल इंटुबैषेण दिखाने के लिए कि दवाओं नैनोकणों द्वारा समझाया, जब गैस्ट्रो आंत्र पथ के माध्यम से प्रशासित, रक्त मस्तिष्क बाधा3भर में ले जाया गया । इन लेखकों Collymore एट अल द्वारा वर्णित gauvage विधि के आधार पर इंटुबैषेण प्रदर्शन किया । कुछ संशोधनों के साथ 4 । हालांकि, वे एक अत्यधिक विस्तृत मौखिक इंटुबैषेण प्रक्रिया का वर्णन प्रोटोकॉल प्रदान नहीं किया । यहां, हम Collymore एट अल पर वयस्क zebrafish इमारत के ओरल इंटुबैषेण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । 4 हम आगे cytometry, फोकल माइक्रोस्कोपी और qPCR द्वारा प्रासंगिक बहाव के विश्लेषण के लिए आंत की तैयारी शामिल हैं ।

आंत और विशेष रूप से इसके म्यूकोसा संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है और पोषक तत्व की प्राथमिक साइट5। जब उपकला कोशिकाओं और प्रतिजन-श्लैष्मिक बाधाओं के भीतर कोशिकाओं को पेश खतरे संकेतों अनुभव, एक तत्काल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू हो रहा है. अगला, अत्यधिक विशिष्ट अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया टी और बी लिम्फोसाइटों6,7द्वारा स्थापित किया गया है । मौखिक टीके का विकास vaccinology में एक वर्तमान फोकस क्षेत्र है । इस तरह के टीके एक प्रभावी उपकरण म्यूकोसा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट प्रतिक्रिया के कारण उजागर साइटों पर जीव की रक्षा करने के लिए होगा-जुड़े लसीकावत् ऊतकों (माल्ट)8,9. जलीय कृषि में, श्लैष्मिक टीके इंजेक्शन टीके की तुलना में स्पष्ट लाभ है । वे बड़े पैमाने पर टीकाकरण के लिए व्यावहारिक हैं, कम श्रम गहन, कम मछली के लिए तनावपूर्ण हैं, और युवा मछली के लिए प्रशासित किया जा सकता है । फिर भी, श्लैष्मिक वैक्सीन उंमीदवारों को मौखिक वातावरण में विकृत किया जा रहा बिना दूसरा आंत खंड तक पहुंचने चाहिए । वे भी श्लैष्मिक बाधाओं को पार करने के क्रम में पहुंच प्राप्त करने के लिए प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) पेश करने के लिए स्थानीय और प्रेरित/ इसलिए, श्लैष्मिक के परीक्षण उंमीदवार मौखिक एंटीजन और उनके वितरण प्रणाली, साथ ही साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा द्वारा हासिल की, मौखिक टीके के विकास में आवश्यक है ।

एक बायोमेडिकल संदर्भ में, मौखिक इंटुबैषेण के बाद यौगिकों के जैविक प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक मॉडल विकसित करने के लिए बढ़ती ब्याज की है । आंत के संरचनात्मक और शारीरिक सुविधाओं के कई bilaterian वंश के बीच संरक्षित कर रहे हैं, स्तनधारियों और बोनी11मछलियों के साथ. बहाव विश्लेषण से जुड़ा यह मौखिक इंटुबैषेण मॉडल मानव जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक उपकरण हो सकता है, साथ ही vivo मेंजैव तर्क या अन्य यौगिकों के लिए एक परीक्षण जमीन.

मौखिक इंटुबैषेण प्रोटोकॉल एक ऑपरेटर द्वारा किया जा सकता है, उदाहरणके लिए, सफलतापूर्वक एक उच्च जीवित रहने की दर के साथ, 1 जी वजन मछली के लिए प्रोटीन nanoparticle निलंबन के ५० µ एल अप करने के लिए एडमिनिस्ट्रेटिंग । प्रक्रिया को स्थापित करने और जल्दी सरल है; १ एच में ३० मछलियाँ intubated जा सकती हैं. आंत तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल बाद के विश्लेषण के लिए गुणवत्ता सेल और ऊतक नमूने प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है । बहाव के परिणाम के उदाहरण दिए गए है जो आंतों के ऊपर से संबंधित डेटा प्राप्त करने में प्रोटोकॉल की उपयोगिता दिखा रहे है और qPCR के लिए अलग गुणवत्ता आरएनए में । प्रोटोकॉल एक उपयुक्त मॉडल की जरूरत उन लोगों के लिए महान उपयोग की होगी के लिए मौखिक prophylactics या आंत में अंय यौगिकों की गतिशीलता का परीक्षण ।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक zebrafish शामिल प्रक्रियाओं (ढाणियो rerio) Universitat Autònoma de बार्सिलोना (CEEH संख्या १५८२) की नैतिकता समिति द्वारा पशुओं को शामिल अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय मार्गदर्शक सिद्धांतों के साथ समझौते में अधिकृत किया गया ( यूरोपीय संघ 2010/63) । लाइव zebrafish के साथ सभी प्रयोगों 26-28 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया ।

1. ओरल इंटुबैषेण के लिए उपकरण तैयार करना

  1. एक 31 जी Luer ताला सुई पर एक ठीक सिलिकॉन ट्यूब के लगभग 1 सेमी जगह सुई टिप कवर करने के लिए ।
  2. एक 10 µ एल बाँझ फिल्टर पिपेट टिप (लगभग 2 सेमी) में कटौती, महीन अंत ले लो और यह एक म्यान के रूप में सिलिकॉन ट्यूब पर जगह है । सुनिश्चित करें कि पिपेट सुई की नोक से परे फैली जानवरों को घायल करने से बचने के लिए ।
  3. एक १०० µ एल Luer लॉक सिरिंज सुई संलग्न ।
    नोट: हमेशा इथेनॉल के साथ कुल्ला और फिर फॉस्फेट खारा (पंजाबियों, सामग्रीदेखें) उपचार के बीच अच्छी तरह से बफर ।

2. समाधान आवश्यक

  1. तैयार १५० मिलीग्राम/l (संज्ञाहरण के लिए) या ३०० मिलीग्राम/l (इच्छामृत्यु के लिए) एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonate (एमएस-२२२) मछलीघर जहां zebrafish बनाए रखा है से पानी के साथ समाधान । संवेदनाहारी समाधान के 1 L के साथ एक छोटा सा टैंक भरें और इसे वातित रखें ।
  2. मछली वसूली के लिए MS-२२२ के बिना मछलीघर पानी की 1 एल के साथ एक और छोटे टैंक भरें और इसे वातित रखें ।
  3. एक 10x बाँझ शेयर समाधान से 1x पंजाबियों के ५० मिलीलीटर बनाओ ।
  4. cytometry विश्लेषण के लिए/आंतों सेल अलगाव, तैयार पर्याप्त ताजा ०.१५% collagenase प्रकार चतुर्थ समाधान एक स्टॉक समाधान से मछली प्रति 1 मिलीलीटर के लिए या पाउडर से Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 1% v/v पेनिसिलिन और streptomycin के साथ (देखें सामग्री) । 2 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में 1 मिलीलीटर की aliquots (1 प्रति मछली) बनाओ । विच्छेदन चरण से पहले 30 मिनट तक 4 ° c पर रखें ।
  5. फोकल माइक्रोस्कोपी/नमूना निर्धारण के लिए, पंजाब में ताजा 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान के ५० मिलीलीटर तैयार करें या गल स्टॉक सॉल्यूशन से-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक धुएं हुड में ।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है । कृपया इसके साथ काम करने से पहले सामग्री सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें । दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहना जाना चाहिए, और हमेशा एक धुएं हुड के अंदर समाधान छोड़ दें ।

3. फ्लोरोसेंट Nanoparticle सस्पेंशन की तैयारी

  1. एटो के साथ प्रोटीन nanoparticle लेबल-४८८ एन एच एस एस्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) या निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट डाई ।
  2. 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर ०.१ एम सोडियम बिकारबोनिट बफर में नैनोकणों को पुनर्निलंबित ।
  3. एटो ४८८ अमीन में एन एच एस एस्टर भंग-नि: शुल्क dimethyl sulfoxide (DMSO) पर 2 मिलीग्राम/ लेबलिंग दक्षता की जांच करने के लिए 10 µ l का एक aliquot रखें (चरण 3.7 – 3.8).
  4. अंधेरे में सरगर्मी से 1:2 (प्रोटीन: डाई) के एक दाढ़ अनुपात में नैनोकणों और एटो ४८८ एन एच एस एस्टर मिश्रण.
  5. ८,००० x g पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा लेबल नैनोकणों नीचे स्पिन, supernatant को हटाने और यह लेबलिंग दक्षता की जांच करने के लिए रखने के लिए (3.7 कदम-3.8) ।
  6. ०.१ मीटर सोडियम बिकारबोनिट बफर की 1 मिलीलीटर में resuspend द्वारा लेबल नैनोकणों और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धो लें । फिर ८,००० x g पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक द्वारा supernatant त्यागें । दोहराएँ चरण ३.६ के लिए 5 बार.
  7. ०.१ एम सोडियम बिकारबोनिट बफर की 5 मिलीलीटर में गोली एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में resuspend और १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों (30 aliquots) में फ्लोरोसेंट nanoparticle के aliquots बनाते हैं । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ८,००० एक्स जी में नीचे स्पिन, supernatant को त्यागें और प्रकाश से सुरक्षित-८० ° c पर स्टोर ।
  8. एक microvolume spectrophotometer का उपयोग कर लेबलिंग दक्षता को मापने ।
    1. मूल एटो ४८८ समाधान के 1 µ एल ले लो ३.३ कदम से रखा और आगे यह DMSO में पतला (जैसे, 1:20 मात्रा अनुपात के अनुसार) । यह ३.४ कदम पर प्रोटीन nanoparticle और एटो ४८८ मिश्रण के दाढ़ अनुपात प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल मात्रा है ।
    2. चरण ३.५ में लेबलिंग अभिक्रिया से सहेजे गए supernatant के 1 µ l को लें । अवशोषण (abs) पर = ५०१ एनएम उपाय । लेबलिंग का प्रतिशत है:
      (Equation 1
  9. प्रयोग से पहले, वांछित एकाग्रता 1x पंजाब समाधान का उपयोग कर पर nanoparticle निलंबन तैयार करते हैं ।

4. Zebrafish Anesthetization और ओरल इंटुबैषेण

  1. तेजी से मछली (> 0.5 g) आंत खाली करने के लिए प्रयोग करने से पहले कम से ४८ ज ।
  2. प्रयोगात्मक टैंक (6 एल) के लिए मछली (12 मछली) ले जाने के प्रयोग से पहले एक रात acclimatization12अनुमति देते हैं ।
  3. भंवर nanoparticle अच्छी तरह से समाधान (जैसे, २,५०० rpm और 30 एस) और nanoparticle निलंबन के वांछित मात्रा आकर्षित (जैसे, 20-50 µ एल) संरक्षित सुई से जुड़ी सिरिंज में ।
  4. वातित में मछली प्लेस १५० मिलीग्राम/L MS-२२२ समाधान (अनुभाग 2 देखें) जब तक वे टैंक के नीचे करने के लिए सिंक और एक पूंछ पंख चुटकी के लिए जवाब नहीं है; इस प्रक्रिया से कम 5 मिनट लगते हैं ।
  5. जल्दी से एक गीला प्लास्टिक ट्रे के लिए एक शुद्ध के साथ anesthetized मछली हस्तांतरण, मालूम जानवर क्षैतिज सुई का सामना करने के लिए और तुरंत मौखिक इंटुबैषेण शुरू करते हैं ।
  6. ध्यान से एक हाथ से मछली का समर्थन और दूसरे हाथ से संरक्षित सुई का उपयोग कर मुंह खोलो । धीरे मुंह खोलने से लगभग 1 सेमी के लिए घेघा नीचे सुई डालें ।
    नोट: ऑपरेटर एक मामूली प्रतिरोध महसूस हो सकता है जब पिपेट टिप के अंत गिल पारित कर दिया है । ध्यान रखना सुई प्रविष्टि बहुत ज्यादा है जो गिल छिद्र हो सकता है कोण नहीं ।
  7. धीरे से मछली को nanoparticle सस्पेंशन इंजेक्षन । सुनिश्चित करें कि निलंबन से गिल या मुंह के माध्यम से जावक प्रवाह नहीं है ।
  8. धीरे सुई निकालें और वसूली टैंक में मछली जगह (2 अनुभाग देखें) । वसूली आमतौर पर 1 मिनट के भीतर लेता है ।
  9. किसी भी विषमता के लिए ध्यान से मछली की जांच करें (जैसे, गिल पर खून बह रहा है वेध का संकेत है) ।
  10. एक बार मछलियों को बरामद करने के बाद उन्हें प्रायोगिक टैंकों में लौटा दें ।

5. Zebrafish आंत विच्छेदन

  1. समय के बाद एक निर्दिष्ट अवधि के बाद इंटुबैषेण (जैसे, 5 और/एच 24 एच), ३०० मिलीग्राम/एल एमएस में एक शुद्ध का उपयोग कर मछली प्लेस-२२२ इच्छामृत्यु के लिए समाधान (2 अनुभाग देखें) । सुनिश्चित करें कि operculum चलती बंद हो जाता है और कोई पूंछ चुटकी पलटा है । पांच मिनट सामांय रूप से पर्याप्त है ।
  2. एक नेट के साथ euthanized जानवर उठाओ और यह एक फिल्टर कागज पर जगह है ।
    नोट: फिल्टर कागज आंत के साथ चिपकने वाला ऊतक को हटाने के लिए बहुत उपयोगी है ।
  3. तेज विच्छेदन कैंची का प्रयोग, एक अर्द्ध operculum और खुला चीरा ठीक चिमटी का उपयोग करने के लिए गुदा से परिपत्र चीरा बनाते हैं । आंत के दोनों सिरों में कटौती, सभी आंतरिक अंगों बाहर ले, और उन्हें फिल्टर कागज पर जगह है ।
    चेतावनी: सेल चयापचय और मौत को कम करने के लिए जल्दी से काम ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पंजाब में चिपकने वाला ऊतक और बर्फ पर निकालें ।
  4. आंतरिक अंगों से आंत अलग करने के लिए अपने अभिविन्यास रखने के लिए सुनिश्चित करें (पीछे आंत्र खंड के लिए पूर्वकाल) और यह खिंचाव से बाहर । आमतौर पर, आंत के पूर्वकाल खंड पीछे खंड से व्यापक है । ध्यान रखना आंत के सभी प्राप्त करने के लिए जब विदारक ।
    नोट: पीछे अंत काफी ठीक है और छोटी मछली में नाजुक है और बंद टूट सकता है, विशेष रूप से जानवरों में < 0.7 g.
  5. आंत से चिपकने वाला ऊतक को अलग करने के क्रम में चिमटी के साथ फिल्टर कागज पर आंतों रोल ।
  6. विभिन्न बहाव विश्लेषण (धारा 6, 7 और 8) के लिए आंत तैयार करने के लिए आगे बढ़ें ।

6. Cytometry के लिए आंत्र कोशिकाओं की तैयारी

  1. ०.१५% collagenase समाधान के एडवांस aliquots में तैयार करें (धारा २.४ देखें).
    नोट: Aliquots आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान पर होना चाहिए ।
  2. वैकल्पिक: ५.५ कदम से जारी रखने, भट्ठा आंत longitudinally खुला और 1x पंजाबियों के साथ धो लो ।
  3. चिमटी का प्रयोग, 2 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में आंत जगह ०.१५% collagenase समाधान से भरा ।
  4. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक ऊर्ध्वाधर प्रयोगशाला रोटेटर पर ट्यूबों रखें ।
  5. एक १०० µm सेल छलनी पर आंत प्लेस एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब पर समर्थित । एक 5 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर के साथ आंत को तोड़ने, 1x पंजाबियों के साथ 3 बार धोने, ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में नमूना के माध्यम से प्रवाह का संग्रह ।
  6. 10 मिनट के लिए ४०० x g पर ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब केंद्रापसारक, 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  7. कोशिकाओं को खोने नहीं, जिनमें से कुछ बलगम के लिए जुड़ा हो सकता है, जबकि supernatant के अधिकांश बंद पिपेट ध्यान से ।
  8. 1x पंजाब के ५०० µ एल के साथ केंद्रापसारक ट्यूब के तल पर आंत्र कोशिकाओं resuspend और cytometry विश्लेषण तक बर्फ पर रखें
  9. cytometry के लिए 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों में एक 30 µm सेल फिल्टर के माध्यम से नमूने फिल्टर ।
  10. पैरामीटर सेट करें (उदा., विश्लेषण के लिए कक्षों की संख्या, ब्याज का क्षेत्र, वोल्टेज और क्षतिपूर्ति, डिटेक्टरों का चयन) एक cytometer उपकरण पर (सामग्री देखें) ।
  11. उपयोग13के निर्देशों का पालन करते हुए, किसी cytometer पर तुरंत कक्षों का विश्लेषण करें ।

7. फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए आंत Cryosections की तैयारी

  1. प्लास्टिक मोल्ड भरें ( सामग्री की मेजदेखें) इष्टतम काटने तापमान (O.C.T.) यौगिक के साथ आधा मात्रा के लिए ।
  2. ५.५ कदम से जारी रखने और तुरंत विच्छेदन के बाद, ध्यान से प्लास्टिक मोल्ड में आंत जगह है । सुनिश्चित करें कि आंत पूरी तरह से O.C.T. यौगिक में एंबेडेड है । यदि आवश्यक हो, प्लास्टिक मोल्ड करने के लिए और अधिक O.C.T. यौगिक जोड़ें ।
    नोट: यह O.C.T. यौगिक में एक "जेड" आकार के साथ आंत जगह के लिए आसानी से अपने प्राकृतिक अभिविन्यास का पालन करने के लिए सिफारिश की है.
  3. सूखी बर्फ पर प्लास्टिक मोल्ड प्लेस जब तक यह अपारदर्शी जाता है (एक मिनट से भी कम) ।
  4. लंबी अवधि के उपयोग या प्रक्रिया के लिए तुरंत निंनलिखित प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए-८० ° c पर प्लास्टिक मोल्ड स्टोर ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  5. 10 µm वर्गों या उपयुक्त मोटाई में एक cryostat का उपयोग कर-20 डिग्री सेल्सियस में जमे हुए आंत स्लाइस ।
  6. एक स्लाइड पर एक ठीक ब्रश के साथ आंत अनुभाग लीजिए ।
  7. नमूना ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पीएफए में स्लाइड विसर्जित कर दिया ।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है । कृपया इसके साथ काम करने से पहले सामग्री सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें । दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहना जाना चाहिए, और हमेशा एक धुएं हुड के अंदर समाधान छोड़ दें ।
  8. 1x पंजाबियों, 10 मिनट प्रत्येक के साथ स्लाइड 3 बार धो लें ।
  9. बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें और नमूना पर एक coverslip जगह है ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  10. उचित आवर्धन पर एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत नमूना निरीक्षण ।

8. वास्तविक समय के लिए आंत की तैयारी qPCR (RT-qPCR)

  1. ५.५ कदम से जारी रखने, एक क्रायोजेनिक शीशी में आंत रखो और तेजी से तरल नाइट्रोजन में आंत फ्रीज और उपयोग जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  2. homogenization के लिए, जोड़ें २०० µ एल के 2% (v/) ठंडा 1-Thioglycerol/homogenization समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) या आंत के नमूने के लिए वैकल्पिक homogenization समाधान ।
  3. जल्दी से काम, उच्च गति पर एक प्रयोगशाला homogenizer के साथ बर्फ पर आंत का नमूना homogenize (सेट पर 25-30000 rpm) जब तक कोई दिखाई ऊतक टुकड़े रहते हैं । 5 एस के लिए 3 बार आमतौर पर पर्याप्त है ।
  4. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर आरएनए को अलग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार14 या एक उपयुक्त वैकल्पिक पद्धति. जरूरत के रूप में, लंबी अवधि के उपयोग के लिए-८० ° c पर आरएनए स्टोर.
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  5. एक spectrophotometer15 का उपयोग कर आरएनए एकाग्रता को बढ़ाता है और एक आरएनए विश्लेषक16का उपयोग कर गुणवत्ता का मूल्यांकन.
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कर 1 µ g या सीडीएनए का एक उचित मात्रा में तैयार करें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । qPCR विश्लेषण के लिए, कृपया MIQE दिशानिर्देशों का पालन करें17.
  7. डिजाइन जीन के लिए उपयुक्त प्राइमरी जोड़े/
  8. एक उपयुक्त संदर्भ जीन का चयन करें और एक RT-qPCR का पता लगाने प्रणाली द्वारा एक वाणिज्यिक किट (सामग्री देखें) का उपयोग करके प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण ।
    नोट: उदाहरण के लिए, SYBR ग्रीन supermix के 5 µ एल, ०.५ µ एम प्राइमरों, २.५ µ एल के पतला सीडीएनए और १.५ µ एल के एक अंतिम मात्रा में पानी की µ प्लेट के प्रत्येक कुआं के लिए 10 qPCR l जोड़ें ।

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Representative Results

Zebrafish (औसत वजन: १.०३ ± ०.१६ ग्राम) मिश्रित सेक्स के सफलतापूर्वक अलग रिकॉमबिनेंट प्रोटीन नैनोकणों (बैक्टीरियल शामिल शरीर) के साथ intubated थे हमारे घर का उपयोग मौखिक इंटुबैषेण डिवाइस (चित्रा 1) । हम सफलतापूर्वक मौखिक इंटुबैषेण प्रदर्शन किया है और एक कम औसत प्रतिशत मृत्यु दर हासिल (६.८%) (तालिका 1) । Zebrafish के साथ intubated थे या तो 30 µ l या ५० µ l के nanoparticle सस्पेंशन और मृत्युदर की गणना 24 ज पोस् इंटुबैषेण के भीतर की गई थी. प्रयोगों के दो ऑपरेटरों द्वारा प्रदर्शन किया गया, आर कम zebrafish मौखिक इंटुबैषेण के साथ जे से काम कर अनुभव था । परिणाम से पता चला कि एक नया ऑपरेटर स्वतंत्र रूप से मौखिक इंटुबैषेण प्रयोग प्रदर्शन कर सकता है और आसानी से इस प्रोटोकॉल द्वारा एक उच्च जीवित रहने की दर को प्राप्त करने । हमारे अनुभव से, इष्टतम मछली का आकार 1 जी है, लेकिन हम सफलतापूर्वक मछली के रूप में छोटे रूप में intubated है ०.५ g ।

बेहतर समझने के लिए कि क्या फ्लोरोसेंट नैनोकणों आईबीएसTNFα (एक रिकॉमबिनेंट शामिल करने के शरीर के रूप में cytokine प्रोटीन नैनोसंरचित) हमारे विधि द्वारा zebrafish को दिया गया था और zebrafish आंत द्वारा या नहीं लिया है, हम प्रदर्शन cytometry विश्लेषण. नैनोकणों (१०० µ g/मछली, ५० µ l) और पंजाब (नियंत्रण) मौखिक रूप से प्रशासित थे (इंटुबैषेण द्वारा) zebrafish करने के लिए और आंत 5 ज और 24 एच पोस्ट इंटुबैषेण में विच्छेदित किया गया था । कुल आंत्र कोशिकाओं 6 कदम से तैयार किया गया था और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन संकेत का पता लगाने के द्वारा विश्लेषण किया । प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम और फ्लोरोसेंट कोशिका प्रतिशत के डॉट भूखंडों चित्रा 2में दिखाया गया है । फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का घनत्व स्पष्ट रूप से दोनों में नियंत्रण समूह की तुलना में nanoparticle intubated समूह में उच्च है 5 ज और 24 ज (चित्रा 2ए) । फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत में काफी अधिक है दोनों 5 ज (४६.३%) और 24 ज (४३.०%) of nanoparticle intubated समूह (चित्रा 2बी) ।

आगे का अध्ययन करने के लिए जो आंत्र परत का हिस्सा nanoparticle में शामिल है, हम फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण प्रदर्शन किया । नैनोकणों (20 µ g/मछली, ५० µ l) और पंजाब (नियंत्रण) को मौखिक रूप से intubated zebrafish गया था और आंत 5 ज पद इंटुबैषेण पर विच्छेदित की गई थी । आंत वर्गों कदम 7 (चित्रा 3ए) के अनुसार एक जमे हुए ऊतक विधि द्वारा तैयार थे । आंत में फ्लोरोसेंट नैनोकणों की फोकल छवियों चित्रा 3बीमें दिखाया गया है । फ्लोरोसेंट नैनोकणों zebrafish आंत में पाया गया । हम उपकला कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति मनाया, लेमिना propria, और मांसपेशियों की कोशिकाओं.

सत्यापित करें कि क्या हम अपने प्रोटोकॉल द्वारा उच्च गुणवत्ता आरएनए निकाल सकते हैं करने के लिए, हम एक विश्लेषक के साथ आंत से निकाली गई आरएनए का विश्लेषण (भी यहां आरएनए विश्लेषक के रूप में संदर्भित). Zebrafish (५० µ एल) या नैनोकणों (20 µ ग्राम/मछली, ५० µ एल) के साथ मौखिक रूप से intubated थे । 24 ज पोस्ट इंटुबैषेण में आरएनए निष्कर्षण के लिए आंतों को विच्छेदित किया गया । हम विश्लेषक के साथ परीक्षण करने के लिए सात आरएनए नमूने का चयन किया. हमने पाया है कि सभी परीक्षण आरएनए नमूने उच्च आरएनए अखंडता संख्या ७.९ से ८.९ (चित्रा 4) को लेकर है ।

Figure 1
चित्रा 1 : ओरल इंटुबैषेण डिवाइस । (एक) 31 जी Luer ताला सुई की छवि एक १०० µ एल पर तय की सिलिकॉन ट्यूब और पिपेट टिप सुई की नोक को कवर अंत के साथ सिरिंज । (ख) सुई भाग के एक बढ़े हुए छवि । काले तीर इंगित करता है जहां पिपेट टिप अंत सुई की नोक से अधिक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : zebrafish आंत में फ्लोरोसेंट नैनोकणों का प्रवाह cytometry विश्लेषण वाया ओरल इंटुबैषेण । Zebrafish पंजाबियों या फ्लोरोसेंट आईबीएसTNFα (१०० µ जी) के साथ 5 ज और 24 एच, क्रमशः के लिए इलाज किया गया । (क) प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम । (ख) फ्लोरोसेंट कोशिकाओं प्रतिशत के डॉट भूखंड ग्राफ । प्रत्येक हरे डॉट एक व्यक्ति में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है, n ≥ 4 । डेटा मतलब (SEM) के ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । मतभेद एक तरह से ANOVA का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । नियंत्रण के संबंध में महत्वपूर्ण अंतर (* *, p < 0.01) कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : छवियां फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण की । मछली intubated या 20 µ g/मछली फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ मौखिक रूप से थे । आंत 5 ज पद इंटुबैषेण पर विच्छेदित किया गया । (क) Zebrafish आंत OCT यौगिकों में एंबेडेड । आंत एक "Z" आकार के प्राकृतिक अभिविंयास के साथ रखा गया था (एक: पूर्वकाल अंत; पी: पीछे अंत) । (ख) zebrafish आंत की फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां । सफेद तीर बताते है कि फ्लोरोसेंट नैनोकणों आंत्र म्यूकोसा में ले रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : आरएनए विश्लेषक आभासी जेल छवि दिखा आरएनए से निकाले गए 7 zebrafish आंतों नमूना पोस्ट इंटुबैषेण. सैंपल नंबर 1 और 2 हैं पंजाब intubated ग्रुप्स और सैंपल नंबर 3 से 7 nanoparticle intubated ग्रुप्स हैं । आरएनए अखंडता संख्या (रिण) ७.९ से ८.९ को लेकर नीचे दिए गए हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ऑपरेटर वॉल्यूम # फिश intubated मतलब वजन
(जी ± एसडी)		 # मौतें मृत्यु दर (%)
आर 30 µ l 22 ०.८८ ± ०.१४ 3 १३.६
आर 30 µ l 17 ०.९३ ± ०.१९ 0 0
जे ५० µ l 19 १.२३ ± ०.३१ 1 ५.२
जे ५० µ l 30 १.०८ ± ०.४० 2 ६.६
कुल ८८ १.०३ ± ०.१६ 6 ६.८
एसडी: मतलब का मानक विचलन

तालिका 1: प्रोटोकॉल का उपयोग कर दो ऑपरेटरों की वजह से zebrafish मृत्यु दर की तुलना. ऑपरेटर पहचान कोड, intubated मात्रा, मछली संख्या, और ग्राम (जी) में मछली औसत वजन दिखाया जाता है ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल Collymore एट अल द्वारा मौखिक इंटुबैषेण के लिए पहले वर्णित तकनीक का एक सुधार है । 4 हमारे प्रोटोकॉल मौखिक इंटुबैषेण विधि विस्तार में वर्णन करता है और बहाव के विश्लेषण के लिए आंत की तैयारी भी शामिल है । हमारी विधि एक व्यक्ति पूरे प्रोटोकॉल तेजी से प्रदर्शन करने के लिए ऑपरेटरों के बीच ज्यादा भिन्नता के बिना, अनुमति मछली हेरफेर गति में सुधार. पिछले एक के साथ हमारे प्रोटोकॉल का एक मुख्य अंतर यह है कि हम न केवल अच्छी तरह से किया जा रहा (जैसे, कोई खून बह रहा है) के लिए पशु का अवलोकन द्वारा एक मौखिक इंटुबैषेण प्रयोग की सफलता का मूल्यांकन और प्रशासित द्रव की कोई रिसाव के लिए, लेकिन यह भी जांच से बहाव विश्लेषण (cytometry, फोकल माइक्रोस्कोपी और qPCR) का उपयोग कर आंत में एक सक्रिय nanoparticle के ऊपर ले । हम बताते है कि intubated फ्लोरोसेंट लेबल नैनोकणों आंत में पाए गए ।

व्यावहारिक पक्ष पर, इंटुबैषेण उपकरण सस्ते, सटीक और पुन: प्रयोज्य है, बुनियादी उपकरण एक पुनर्प्रयोज्य १०० µ एल ग्लास (उदाहरणके लिए, हैमिल्टन) सिलिकॉन के शीर्ष पर एक टुकड़ा के साथ एक 31 जी सुई के लिए युग्मित सिरिंज से बना है । एक कटौती बाँझ टिप सिलिकॉन ट्यूब पर रखा गया है और प्रत्येक व्यक्ति प्रशासन के लिए बदला जा सकता है. सिरिंज पुन: प्रयोज्य है, और पतली सुई सफलता की एक उच्च संभावना के साथ intubating छोटी मछली की अनुमति देता है । इसके अलावा, कटौती बाँझ टिप सीधे सुई पर सिलिकॉन ट्यूब जो इंटुबैषेण उपकरण एक प्रयोगशाला में बनाया जा करने के लिए आसान अनुमति देता है बिना रखा जा सकता है. प्रशासित सक्रिय यौगिक स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है, और एक सही प्रशासन आसानी से निगरानी की जा सकती है. इंटुबैषेण प्रक्रिया के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम सुई प्रविष्टि है । यह महत्वपूर्ण है कि सुई झुका नहीं है या बहुत ज्यादा डाला के लिए गिल छिद्र से बचने के । इस विधि के साथ मनाया मृत्यु दर बहुत कम है (लगभग 7%) और मछली के आकार पर निर्भर करता है । गिल वेध मछली मौत का सबसे आम कारण है और जब यह होता है मछली मरने के पहले घंटे के भीतर । हालांकि ०.५ g की मछली को आसानी से intubated जा सकता है इष्टतम मछली का आकार 1 ग्राम के आसपास है । Collymore एट अल द्वारा विकसित विधि के साथ एक और अंतर । यह है कि मछली ४८ के लिए तेजी से कर रहे है एच यकीन है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग खाली है । पूरे इंटुबैषेण प्रक्रिया बहुत जल्दी किया जा सकता है (30 जानवरों/एच) एक ऑपरेटर द्वारा और महत्वपूर्ण बात, विधि विभिंन ऑपरेटरों के बीच संगत है4। इंटुबैषेण विधि जानने के लिए आसान है और मास्टर करने के लिए बहुत अभ्यास की आवश्यकता नहीं है ।

आंत विच्छेदन प्रक्रिया ठीक से cytometry, फोकल और qPCR विश्लेषण के लिए अच्छी गुणवत्ता के नमूने प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इस बिंदु पर महत्वपूर्ण कदम पूरी आंत का विच्छेदन है; पीछे अनुभाग नाजुक और खोने के लिए आसान है । एक बार आंत विदारक है, यह आगे cytometry (2 एच प्रोटोकॉल), qPCR विश्लेषण (कुल आरएनए अलगाव तक 2 एच प्रोटोकॉल) या फोकल माइक्रोस्कोपी (1 एच cryosection के लिए तैयार नमूनों है) के लिए संसाधित किया जा सकता है । यह विशेष रूप से फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, आंत के अभिविन्यास का ट्रैक रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. Cytometry विश्लेषण तीव्र प्रक्रिया की आवश्यकता है, और प्रक्रिया पूरी होने से पहले रोका नहीं जा सकता । जबकि, आरएनए अलगाव और cryosection के लिए तैयार नमूनों को ठीक से संग्रहीत और किसी भी समय संसाधित किया जा सकता है । cytometry के लिए, मशीन का झुरमुट मलबे के बिना अच्छी गुणवत्ता के नमूनों इस विधि और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए तेजी से विश्लेषण के साथ अलग किया जा सकता है व्यक्तियों पर आसानी से किया जा सकता है । आरएनए गुणवत्ता निगरानी से पता चला कि उच्च गुणवत्ता आरएनए qPCR द्वारा व्यक्तिगत मछली के विश्लेषण की अनुमति आंत से अलग किया जा सकता है । अंत में, फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए cryosection तैयारी प्रोटीन nanoparticle के बारे में महत्वपूर्ण संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है । हमारे तरीके इस प्रकार एक मॉडल प्रदान करने के लिए मौखिक prophylactics या आंत में अंय यौगिकों की गतिशीलता का परीक्षण ।

हमारे अध्ययन की सीमाएं मछली के आकार के बाद से हम मछली में प्रशासन परीक्षण नहीं ०.५ जी से छोटे और एक रासायनिक संवेदनाहारी के उपयोग के लिए पशुओं को बेहोश कर रहे हैं । कुछ लेखकों ठंडा पानी का उपयोग करें (0-4 ° c) zebrafish18 anesthetize करने के लिए लेकिन पशु कल्याण और यूरोपीय कानूनी बाधाओं के संदर्भ में हमने तय किया कि MS-२२२ पसंद की विधि थी ।

zebrafish जीन डेटा का एक पूरा सेट और उपलब्ध ट्रांसजेनिक लाइनों सहित अंय मॉडल प्रणालियों पर कई लाभ प्रदान करता है । immunologists के लिए, ट्रांसजेनिक लाइनों (जैसे, टीजी mpx: GFP और टीजी mpeg1: GFP) इस तरह के मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल19,20के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की में vivo अवलोकन के लिए एक दृश्य सेट । ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ हमारे मौखिक इंटुबैषेण और बहाव विश्लेषण के संयोजन, कोशिका के ऊपर, परिवहन और मौखिक टीके के प्रसंस्करण, नैनोकणों और मछली में रोगजनकों शामिल प्रकार की पहचान के लिए आदर्श हो सकता है ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्पेनी विज्ञान मंत्रालय, यूरोपीय आयोग और AGAUR कोष से NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER और 2014SGR-३४५ AGAUR) के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । आर टी AGAUR (स्पेन) से एक पूर्व डॉक्टरेट छात्रवृत्ति आयोजित करता है, जेजे चीन छात्रवृत्ति परिषद (चीन) से एक पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित था और NR रामोन y Cajal कार्यक्रम (RYC-2010-06210, २०१०, MINECO) द्वारा समर्थित है । हम Torrealba प्रोटीन उत्पादन में विशेषज्ञ सलाह के लिए डॉ., बरबा "Servei de Microscopia" और डॉ एम कोस्टा से "Servei de Citometria" Universitat Autònoma de बार्सिलोना के लिए सहायक तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 mL homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १३९ Zebrafish ओरल इंटुबैषेण आंत श्लैष्मिक उन्मुक्ति cytometry फोकल इमेजिंग qPCR
वयस्क Zebrafish के ओरल इंटुबैषेण: एक मॉडल के लिए एक अति सक्रिय यौगिकों के आंत्र का मूल्यांकन
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Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral… More

Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

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