Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للكشف عن وجود العَدلات في أقسام علم الأنسجة الثابتة/بيرميبيليزيد وتقييم حالة تفعيل العَدلات المنقي حية. على وجه الخصوص، يربط الببتيد40 موب lactoferrin موجودة في حبيبات العَدلات الخاصة والتعليم العالي. تعرض محتويات الحبيبية من خلال تفعيل العَدلات أو بيرميبيليزيشن يسمح بوضع علامات على العَدلات.
Abstract
هنا، نحن نقدم بروتوكول التي تنطوي على استخدام موب40، ببتيد المركب مع القدرة على ربط lactoferrin الغليكوزيلاتي المخزنة بتركيزات عالية في حبيبات محددة والعالي من العَدلات. يمكن استخدام هذا البروتوكول تفاصيل كيف مترافق موب40 مباشرة إلى فلوروفوري لوصمة عار العَدلات في الأنسجة الثابتة/بيرميبيليزيد، وكذلك كيفية هذا يمكن استخدامها في التصوير خلية يعيش للاعتداء لتفعيل العَدلات وتحبيب دي. أساليب الكشف العَدلات تقتصر على إبلاغها الأجسام المضادة، التي لا تكون دائماً مناسبة لتطبيقات معينة. موب40 عدم اختراق غشاء الخلية وهكذا تستثني من lactoferrin المخزنة في العَدلات غير-تنشيط/غير-بيرميبيليزيد. موب40 له فائدة إضافية تتمثل في الاعتراف lactoferrin من مجموعة مضيف واسعة، يجعلها مفيدة بشكل خاص لمقارنة النتائج في الدراسات التي تشمل نماذج بحوث متعددة، خفض عدد الكواشف مكررة، وتبسيط البروتوكولات من خلال تلطيخ خطوة واحدة.
Introduction
العَدلات هي واحدة من الأسلحة الرئيسية في جهاز المناعة الفطرية ويجندون بشكل روتيني إلى المواقع التهاب في جميع أنحاء الجسم. دراسة العَدلات قد تضعف إلى حد كبير قبل انتهاء مدة قصيرة في المختبر (أقل من 8 ساعات)، وأدوات الكشف محدودة تحت ظروف القاعدية أو بعد التنشيط. نقدم هنا، بروتوكول مجربة لكشف واسعة ومحددة من العَدلات الثدييات في عينات الثابتة/بيرميبيليزيد. كما أننا نقدم بروتوكول مفصل لتلطيخ العَدلات يعيش مع موب40. استخدام بروتوكول المصبوغة العَدلات حية، يمكن تحديد توقيت ومكان لتفعيل العَدلات. هذا البروتوكول مثالي للباحثين الذين يرغبون في دراسة الإفراج عن التنشيط أو الحبيبية العَدلات. خارج مهامهم مضادات الميكروبات، تقدر العَدلات الآن كخلايا immunomodulatory تشارك في طائفة واسعة من الأمراض والاستجابات المناعية (الفطرية والتكيف)1،2. العَدلات موجودة في معظم التهابات الأنسجة، في أرقام عالية في الأنسجة المصابة والأورام الملتهبة3من خلال الرابطة وكرون تفجر4، في مناطق من الالتهاب غير المعدية مثل سينوفيا (التهاب المفاصل المرضى RA)5. العَدلات تحتوي على أربع فئات من قبل تشكيل حبيبات المسمى أزوروفيل (α) والخاصة (β1) والتعليم العالي (β2) حبيبات والحويصلات الافرازية (γ)6. إلى الهجرة إلى موقع تحريضية، تصبح تنشيط العَدلات المعينين والتتابع تفرز محتويات الحبيبية (تتألف من الالتصاق ومركبات مضادات الميكروبات وجزيئات إيمونومودولاتوري)، الذي يشجع زيادة التوظيف ويسهم في الإصابة بالقرار (بل أيضا إلى تلف أنسجة المضيف)7. في حين تعتبر العَدلات جانبا مهما من الحصانة الفطرية، وحتى الآن هناك الكواشف الكشف القليلة المتاحة لدراستها، وأقل حتى التي يمكن استخدامها لتقييم حالة تفعيل العَدلات الحية.
الأساليب الحالية للكشف عن العَدلات تعتمد على الأجسام المضادة المتولدة ضد المستضدات يتعرض سطح الخلية، مثل لي-6 ز2 أو البروتينات المخزنة على وجه التحديد في حبيبات العَدلات تحت ظروف القاعدية (مثلاً، ميلوبيروكسيداسي ، lactoferrin). وتشمل مزايا مونوكلونل بهم ملزمة قوية وحساسية وبراعة التحليل في ظروف مختلفة. ومع ذلك، هناك عدة سلبيات لاستخدام الأجسام المضادة ومكافحة--لي-6 ز خاصة. هذه الجوانب السلبية تشمل الخصوصية، كما موجودة في معظم الخلايا النقوي في نخاع العظم وفي جميع المحببة بما في ذلك الحمضات؛ Ly-6 ز وهكذا، فك رموز العَدلات من الحمضات مع هذه العلامة تتطلب المجمعات أكثر النهج8. آخر المقايضة متكررة مع الأجسام المضادة هو مداها خصوصية المضيف غالباً محدودة، مما يجعل من الصعب الدراسات المقارنة مع واحد أو أكثر من الأنواع الحيوانية. عيب ثالث من أساليب الكشف عن الأجسام المضادة، خاصة عند استخدام الخلايا الحية أو الحية، هو قدرتها على تعطيل وظيفة الخلية أو تؤدي إلى تنشيط الخلية. على سبيل المثال، يتم تطبيق الإدارة لمكافحة--لي-6 ز للفئران عادة إلى نضوب العَدلات وقلة العَدلات عابر9. بالإضافة إلى ذلك اتضح أن حقن الأجسام المضادة قد حفز الدالة انتيتومور العَدلات10. وأخيراً، الكشف عن أضداد العَدلات لا تكشف عن حالة تنشيط الخلية.
ولقد حددنا 40 أمينية ببتيد حمض يسمى موب40، التي يمكن استخدامها في عدد من الاختبارات لتسمية العَدلات تحت ظروف في المختبر أو في الجسم الحي ، فضلا عن الاعتداء حالة تفعيل العَدلات يعيش11. موب40 مشتق من موب7012، مجال من البروتين ملزمة مخاط سطح reuteri ملبنة وصف في الأصل لقدرته على ربط مخاط13،14. موب40 يتفاعل مع lactoferrin الغليكوزيلاتي موجود بتركيزات عالية في حبيبات العَدلات الخاصة والتعليم العالي. موب40 يمكن أن يتعرض لهذه الحبيبات من خلال الخطوات permeabilization القياسية الموجودة في الأنسجة أو خلية تنشيط fluorescence الفرز البروتوكولات (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتلطيخ قوية من العَدلات الثابتة. عندما يتم الاحتفاظ العَدلات يعيش في حالة المعطل، الببتيد40 موب مستبعد من محتويات الحبيبية، وخلايا لا وصمة عار إيجابية مع العلامة. عند التنشيط، موب40 يمكن ربط lactoferrin المكشوفة وتؤدي إلى تلطيخ قوية مع الببتيد. وهكذا، يمكن استخدام موب40 لتحديد حالة تفعيل العَدلات المنقي، يجعلها علامة جذابة لمتابعة عملية المعدية. كما يتيح القدرة على ربط العيش العَدلات مفعّلة موب40 لاستخدامها كأداة للكشف عن مناطق التهاب العَدلات في نماذج حيوانية حية (مثل ماوس التهاب المفاصل نموذجي15). يمكن استخدام البروتوكولات بالتفصيل مخطوطة هذا المسمى كيف فلوريسسينتلي موب40 للكشف عن العَدلات في الأنسجة علم الأنسجة وكيفية الاعتداء تفعيل العَدلات المنقي حية في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جرى استعراض كافة الأساليب الموصوفة هنا ووافقت عليها المنظمات الفرنسية كورك (عيادة لجنة البحوث)، وحزب الشعب الكمبودي (des لجنة لحماية الأشخاص) و CNIL (اللجنة الوطنية المعلوماتية et Liberté).
1-تلطيخ العَدلات في الأنسجة الأنسجة مع فلوريسسينتلي المسمى موب40
- للحصول على الأنسجة للأنسجة، إصلاح أقسام الأنسجة/خزعة في كمية مناسبة من بارافورمالدهيد 4% (PFA) لمدة 30 دقيقة تصل إلى 4 ح تبعاً لسمك العينة. وضع العينات في ثلاجة 4 درجات مئوية أثناء التثبيت.
ملاحظة: الأساليب البديلة التثبيت/توقيت يمكن أن تكون بديلاً على أساس الاحتياجات الفريدة للمستخدم.- إزالة منهاج عمل بيجين وإضافة 16% من محلول السكروز مع حجم ما يكفي لتغطية تماما العينة ومكان العينة عند 4 درجة مئوية عن 4 ح حتى بين عشية وضحاها.
- إزالة 16% من محلول السكروز وإضافة محلول السكروز 30% في وحدة تخزين كبيرة بما يكفي لتغطية العينة تماما، ووضعه في 4 درجات مئوية عن 4 ح حتى بين عشية وضحاها.
- إزالة محلول السكروز 30% ولطخة قبالة الحل الزائدة من الأنسجة مع منشفة ورقية. ضع المقطع الأنسجة في وسائل الإعلام درجة الحرارة (OCT) قطع الأمثل وتجميد المفاجئة في 2-ميثيلبوتاني تبريد في حمام الثلج الجاف-إيثانول (-72 درجة مئوية). بمجرد تجميد الصلبة (بعد ~ 2 دقيقة)، إزالة كتل من 2-ميثيلبوتاني ووضعها على الثلج الجاف حتى جميع الكتل على الانتهاء وجاهزة للتخزين على المدى الطويل. تخزين الكتل المجمدة في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- الليلة التي سبقت كتل الأنسجة هي أن يكون قطع وإخراجها من الثلاجة-80 درجة مئوية ووضعها في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها حجته.
- استخدام كريوستات، قطع الأنسجة جزءا لا يتجزأ من أكتوبر إلى شرائح سميكة ميكرومترات 10-إلى 30 والجسميات على الشرائح الزجاجية عالية الجودة.
ملاحظة: يمكن استخدام شرائح أكثر سمكا أو أرق استناداً إلى متطلبات التجريبية. - بقلم شمع أو أي أسلوب آخر مسعور، رسم مربع حول الأنسجة شريحة على الشريحة الزجاجية واسمحوا جافة.
- إعداد الحل المصبوغة بأداء إضعاف 1:1,000 موب40-Cy5 (أو الفلورسنت موب40نسخة أخرى، حل الأسهم 1 ملغ/مل) في حل صابونين-برنامج تلفزيوني 0.1%. وينبغي تركيز40 موب النهائي الأمثل 1 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: يمكن استخدام تركيزات النهائي أقل (0.1 0.01 ميكروغرام/مل) ولكن قد تؤدي إلى انخفاض كثافة إشارة.
تحذير: يمكن أن يسبب مسحوق صابونين تهيج التنفس. تأكد من وزن صابونين في منطقة محمية أو مجلس الوزراء. يمكن استخدام أساليب بديلة permeabilization مثل تريتون. إضافة علامات إضافية في التركيزات الموصى بها من الشركة المصنعة (على سبيل المثال-، 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، فالويدين، أجسام مضيئة). - بلطف وتراجع الشريحة الزجاجية في حل من 0.1% صابونين-برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- لطخة السائل الزائد بعيداً حول المقطع الأنسجة وإضافة حل المصبوغة كافية تغطي كامل المقطع الأنسجة بعناية. ضع الشريحة في غرفة رطوبة تجنب التبخر واحتضان من أجل ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تبقى محمية من الضوء.
- بلطف وتراجع الانزلاق إلى 0.1% صابونين-برنامج تلفزيوني الحل 3 x. ثم، بلطف وتراجع الانزلاق إلى حل برنامج تلفزيوني 3 x. وأخيراً، تراجع بلطف الانزلاق إلى المقطر ح2س س 3. الجافة بعناية السائل الفائض من الشريحة.
- إضافة كمية صغيرة (~ 20 ميكروليتر) من تصاعد المتوسطة (20 مم تريس pH 8.0، 0.5% يبيغاللوكاتيشين البروبيل-ن، والغليسيرول 90%) بجوار الشريحة الأنسجة وإلقاء بلطف ساترة زجاجية على رأس الشريحة الزجاجية. بلطف وبشكل متساو اضغط ساترة على المقطع الأنسجة، واستخدام منشفة ورقية، بعناية إزالة أي وسائط المتصاعدة التي يقذف حول حواف ساترة.
- ضع الشريحة المحملة في خزانة مظلمة ل 24 ساعة للسماح لوسائل الإعلام المتزايدة لترسيخ. وبدلاً من ذلك، ضع الشريحة المحملة في 37 درجة مئوية ح 1.
- استخدام كريوستات، قطع الأنسجة جزءا لا يتجزأ من أكتوبر إلى شرائح سميكة ميكرومترات 10-إلى 30 والجسميات على الشرائح الزجاجية عالية الجودة.
- صورة شرائح الأنسجة في مجهر فلوري وفقا لطريقة اكتساب المرجوة.
2-تصور لتفعيل العَدلات مع الرجعية-إينفيرسو-موب40-الببتيد Cy5
- الحصول على العَدلات الإنسان استخدام بروتوكول التالية. إعداد الحلول التالية ووضعها في وصول مجلس الوزراء مساء أمس. التعرض للأوكسجين ستبدأ بتفعيل العَدلات وكذلك حفز الخلية وفاة16،17.
ملاحظة: العَدلات قد يكون بدلاً من ذلك تنقية "على مقاعد البدلاء" موب40-وصف التجارب؛ ومع ذلك، انتبه إلى أن التعرض للأكسجين تبدأ تؤثر على تفعيل العَدلات.- إعداد الحل التالي:
حل 1 [كلوريد الصوديوم (NaCl) 0.9%]: إضافة 4.5 غرام من كلوريد الصوديوم إلى 500 مل ح2تصفية O. الحل.
حل 2 (ديكستران 6%): إضافة 6 ز ديكستران في محلول كلوريد الصوديوم 0.9% إلى 100 مل.
الحل 3 (المخزن المؤقت للغسيل): حل حمض الإيثيلين (يدتا) في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى تركيز يدتا نهائي من 2 مم. مباشرة قبل الاستخدام، حل ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني/يدتا الحل أن تركيز جيش صرب البوسنة النهائي هو 10% w/v. - الطرد المركزي أنابيب جمع الدم في 650 غ س لمدة 20 دقيقة دون فواصل.
- دون الإخلال بفصل الدم، نقل أنابيب جمع الدم وصول بلازما مجلس الوزراء وجمع كسور (أعلى) في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
- إزالة الأنبوبة المحتوية على البلازما من وصول مجلس الوزراء وأجهزة الطرد المركزي في 2,900 س ز لمدة 20 دقيقة مع فواصل بيليه الصفائح الدموية.
- دون الإخلال بالصفائح الدموية الأعلاف، بلطف نقل الأنبوب البلازما مرة أخرى إلى وصول مجلس الوزراء وبيبيت البلازما الصفائح الدموية الفقيرة في أنبوب 50 مل طازجة (وتسمى فيما يلي "البلازما").
- إعداد الحل التالي:
- فصل خلايا الدم الحمراء عن الكريات البيضاء
- استخدام الأنابيب التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) من الخطوة 2.1.3.، الجمع بين كرات الدم الحمراء في أنبوب 50 مل مخروطية (5 الدم جمع أنبوب محتويات كل أنبوب 50 مل).
- إضافة كلوريد الصوديوم 0.9% حتى يصل إلى الحجم الإجمالي 44 مل. إضافة 6 مل من ديكستران 6% (الأخير).
- بلطف مزج خليط الدم/ديكستران بعكس الأنبوب 10-20 مرة. واسمحوا الرواسب أنبوب لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- بينما يتم حدوث الترسيب، إعداد تدرج بركل عن طريق إضافة 4.2 مل من محلول بركل إلى 5.8 مل بلازما في أنبوب مخروطي 15 مل، ومزيج جيد بعكس الأنبوب.
- جمع الكسر أعلى من ديكستران بينما كان يحاول تجنب بيبيتينج خلايا الدم الحمراء.
- تشديد سداده ملولبة وإزالة أنبوب ديكستران من قاعة وصول الطرد المركزي الأنبوب في 300 غرام x لمدة 10 دقائق مع فواصل.
- بعناية وضع الأنبوب مرة أخرى في قاعة وصول دون إزعاج الخلايا الأعلاف، وإزالة السائل عن طريق بيبيتينج.
- بلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل بلازما وأضف ببطء شديد إلى الجزء العلوي من الحل بركل. كن حذراً لا للحث على مزج الطبقات عندما بيبيتينج الخلايا في الأعلى.
- بعناية إزالة أنبوب الحل بركل من وصول الدائرة (تجنب خلط)، وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 20 دقيقة دون فواصل. سوف تظل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) على سطح حل بركل، وسوف بيليه العَدلات مع كرات الدم الحمراء.
- إزالة تلويث كرات الدم الحمراء
- إعداد 14 مل الغسيل حل المخزن المؤقت عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني ميكروليتر 700 + 10% جيش صرب البوسنة إلى 14 مل الغسيل المخزن المؤقت.
- ضع الأنبوب الحل بركل العودة إلى قاعة وصول. إزالة بركل وببمكس عبر بيبيتينج وتعليق إعادة الخلايا الأعلاف في 1 مل من الغسيل حل المخزن المؤقت. وسيكون بيليه أن تكون إعادة تعليق لون أحمر بسبب تلويث كرات الدم الحمراء.
- إضافة 200 ميكروليتر من حبات المغناطيسية المضادة-CD235a (جليكوفورين) إلى الخلايا إعادة تعليق وتخلط بلطف واحتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل. تحميل هذه الخطوة تلويث كرات الدم الحمراء مع الخرز المغناطيسي حيث أنه يمكن إزالتها.
- أغسل العمود الفاصل مع 2 مل غسيل المخزن المؤقت 3 x.
- حين عقد أنبوب مخروطي 15 مل تحت العمود الفاصل، ببطء "الماصة؛" الخليط ربك/العَدلات إلى أعلى العمود. كما أنها نابعة من خلال جمع الخلايا في الأنبوب المخروطية 15 مل. -التدفق عبر ينبغي غائم ويفقد لونه أحمر بسبب كرات الدم الحمراء تبقى ملزمة للعمود.
- إضافة 2 مل من الغسيل المخزن المؤقت إلى أعلى العمود وجمع في أنبوب مخروطي 15 مل نفسه. بنهاية الغسيل 2 مل، التدفق عبر ينبغي أن يكون واضحا، مما يدل على أنه تم جمع جميع العَدلات.
- مزيج بلطف على أنبوب لضمان التوزيع حتى من العَدلات وجمع 10 ميكروليتر لخلية العد. ملاحظة الحجم النهائي لخلية العد الأغراض. تعداد إجمالي عدد الخلايا التي تحتوي على أي خلية قياسية عد الأسلوب.
- إزالة أنبوب العَدلات من قاعة وصول، والطرد المركزي العَدلات في 300 غرام x لمدة 20 دقيقة مع فواصل.
- ضع العَدلات رسابة العودة إلى قاعة وصول وإزالة المخزن المؤقت الغسيل عن طريق بيبيتينج. إعادة تعليق بيليه العَدلات في البلازما بكثافة خلية كحد أقصى 107 المجنحة مليلتر.
- تعداد العَدلات المنقي والتصور استخدام موب40
- أضف 1 ميكروليتر من ري موب40-Cy5 (1 ملغ/مل) إلى 1 مل متوسطة Rosewell الحديقة التذكارية المعهد (ربمي) 1640 دون الأحمر الفينول. مزيج من بيبيتينج جيدا.
- لأغراض هذا البروتوكول، حددت النتيجة كما لو كانت قوية العَدلات تفعيل الكاشف، N-فورميلميثيونيل-لوسيل-فينيلالاناين (فملب)، يتم إضافة. إضافة 1 ميكرومتر من فملب إلى ربمي/ري-موب40-أنبوب Cy5 ومزيج عبر بيبيتينج أعلى وأسفل.
ملاحظة: كل الإجراءات التجريبية ستكون مختلفة من هذه النقطة إلى الأمام، اعتماداً على الأسئلة التي يجري تناولها. - نقل مل 1 ربمي/ري-موب40-Cy5/فملب الخليط إلى طبق مجهرية أسفل زجاج. لهذا الطبق، إضافة وحدة لتنقية الخلايا المقابلة العَدلات الكلي6 10. مزيج من بيبيتينج برفق.
- ضع الطبق إلى مجهر مقلوب فلورسنت والبدء في الحصول على الصور. على سبيل المثال، من المستحسن للحصول على صور الأساس قبل إضافة كاشف-تفعيل العَدلات مثل فملب أو البكتيريا. في هذا المثال، يبدأ اكتساب ربمي/ري-موب40-Cy5/العَدلات، وفي تيميبوينت لاحق، "الماصة؛" الكاشف-تفعيل العَدلات إلى الطبق الزجاج ومواصلة الحصول على الصور.
ملاحظة: أن هذه الخطوات يمكن إجراء التعديلات بناء على الاحتياجات العلمية. - عملية اقتناء أفلام صور-لبس مرة فيما يتعلق بالمجهر المحددة المستخدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج موب40-تكشف الأنسجة الملون من شرائح الأنسجة عادة منتشرة في جميع أنحاء الأنسجة خلايا فردية. موب40 البقع lactoferrin، وموجودة في حبيبات العَدلات ومجزأة. وهكذا، ينظر إليه عادة تلطيخ الشروريه أو عدة مناطق فصل كبير من إشارة تأتي من العَدلات الفردية (الشكل 1). فمن المفيد إضافة علامة خلية ثانية مثل DAPI لمساعدة المشترك تعريب إشارة40 موب مع الخلية الملون. العدد الإجمالي للكشف عن الخلايا يعتمد على عدد العَدلات الحالية في مجال الرؤية، ويمكن أن تختلف جذريا تبعاً لمصدر وقوة الاستجابة المناعية. يظهر هنا صور الممثل من العَدلات المنقي البشرية الثابتة (الشكل 1أ) ومن خزعة نسيج لمريض التهاب القولون التقرحي (الشكل 1ب). كما أظهرت صور مأخوذة من مستوى منخفض نسبيا من العَدلات في رئات الفئران المصابة مع الكلبسيله الرئوية (الشكل 1ج) وعلى مستوى عال من العَدلات في القولون من خنزير غينيا المصابين سوني دوسنتاريا (الشكل 1د).
نتائج استخدام العَدلات حية، وتنقية عادة ما تظهر الخلية قليلاً إلى أي تلطيخ في نقاط زمنية مبكرة، وزيادة تدريجية في ري موب40 تلطيخ مع مرور الوقت كما أصبح تفعيل العَدلات أكثر. يظهر هنا سلسلة دورة زمنية من الصور من تجربة استخدام المنقي العَدلات البشر المصابين الفلورسنت سوني س. (الشكل 2). اعتماداً على قوة إشارة تفعيل، قد على العَدلات أن تبدأ في تلطيخ مع موب40 سريعاً، ولذلك فمن المستحسن البدء في الحصول على الصور قبل إضافة المنشطات. عندما تصبح تنشيط الخلايا وري موب40 إيجابية، أنهم ينبغي أن يحمل ملف تعريف المصبوغة مماثلة لتلك الخلايا الثابتة وبيرميبيليزيد، والتي تعطي تلطيخ الشروريه. تركيز الأمثل موب40 لتلوين كل خلية حية وثابتة 1 ميكروغرام/مل (الشكل 3). خفض تركيزات (0.1 0.01 ميكروغرام/مل) يمكن أن تستخدم لكن النتيجة في خفض كثافة إشارة. كما يوصي باستخدام صورة DIC أو وصمة عار يعيش خلية أخرى للتفريق بين الخلايا التي يتم عرض إشارة40 موب ري.
الشكل 1 : موب 40 --الملون العَدلات الإنسان والفأر والأصل خنزير غينيا. (أ) ممثل موب40 تلطيخ (الأخضر) من العَدلات تنقيته من المانحين بشرية صحية. نواة الخلية هي ملطخة ب DAPI (أزرق). (ب) Staining من العَدلات الإنسان في الأنسجة من خزعة التهاب القولون التقرحي. وكشف العَدلات مع موب40 (الأخضر) ونواة الخلية هي ملطخة DAPI (أزرق). (ج) الأنسجة من الرئة بالماوس المصابين الكلبسيله الرئوية. وكشف العَدلات الماوس في الأنسجة باستخدام موب40 (الأخضر) ونواة الخلية هي ملطخة DAPI (أزرق). (د) الأنسجة من القولون من خنزير غينيا المصابين سوني دوسنتاريا. وكشف العَدلات استجابة للعدوى في الأنسجة مع موب40 (أخضر). S- سوني البكتيريا (أحمر) التعبير عن البروتين دسريد نيون. نواة الخلية هي ملطخة ب DAPI (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : العَدلات يعيش وصمة عار مع موب 40 فقط عند تنشيط. اختيار الصور من سلسلة انقضاء وقت التي تنطوي على العَدلات الإنسان المنقي المصابين سوني س. حضور ري موب40. في الأول لقاءات مجموعة من الصور (أعلى) العَدلات سوني س. بكتيريا (الأحمر) تظهر مع سهم أخضر. على مر الزمن، هو البكتيريا استيعابه قبل العَدلات وهضمها. كما يصبح المنشط في العَدلات من البكتيريا، البقع أقوى تدريجيا مع ري موب40. الصور على اليسار قنوات الفلورسنت مضافين مع الصور DIC. الصور على اليمين قنوات الفلورسنت فقط. أخذت الصور على فترات 5-دقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تأثير مختلف موب 40 التركيزات في تلطيخ العَدلات. تلوين الممثل لثابت/بيرميبيليزيد العَدلات بتركيزات مختلفة من موب40-Cy5. العَدلات البشرية النقية الثابتة وملطخة بتركيزات موب40المشار إليه-Cy5. نواة الخلية هي ملطخة ب DAPI (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يتم وصف فحوصات اثنين التي يستخدم فيها الببتيد40 موب دراسة التهاب العَدلات والتنشيط. ونحن تبين كيف يمكن أن تكشف موب40 العَدلات الموجودين في أقسام التشريح المرضى أو إظهار دولتهم تفعيل العَدلات المنقي حية باستخدام. الخطوات الأساسية لاستخدام موب40 ككاشف المصبوغة هي نفس مع أي أسلوب الكشف الفلورية الأخرى. ويجب الحرص على ضمان التوافق بين إشارات مضيئة وأن اتخذت خطوات الغسيل كافية لإزالة تلوين الخلفية. أهم الاعتبارات لتحقيق نتائج جيدة المصبوغة هي نوعية المجهر وكشوف الشرائح/تغطية الزجاج وأقسام الأنسجة. عند عرض العَدلات المنقي حية، أهم الخطوات في عملية تنقية نفسها. العَدلات هي حساسة ويمكن تفعيلها من خلال عدد من إشارات مختلفة. بغية ضمان أن التجربة يؤدي إلى نتائج ذات مغزى، يجب الحرص على إبقاء العَدلات المنقي غير نشطة حتى أنهم على استعداد لاستخدامها. يمكن تحقيق هذا بتنفيذ البروتوكول تنقية العَدلات في دائرة لوصول للحد من التعرض العَدلات إلى الأوكسجين.
كلا من الحد منها والاستفادة من موب40، اعتماداً على مسألة تجريبية يجري تناولها، هو أن البقع فقط40 موب المنشط العَدلات إلا إذا كانوا هم بيرميبيليزيد إلى حد ما. هذا يمكن أن يكون ميزة كبيرة إذا كانت التجربة ويدعو التهاب التالية في الحيوانات الحية أو الخلايا المنقي، ولكن قد يكون عيب إذا كانت التجربة تتطلب الكشف عن جميع العَدلات العيش بغض النظر عن حالة التنشيط. القيد ثاني محتملة لهذا البروتوكول هو الحقيقة أن lactoferrin موجود في إفرازات جسدية مختلفة مثل الدموع والحليب والمخاط. لتلطيخ الأنسجة التي تمسك هذه الإفرازات (مثل colonic خزعات الذي طبقة المخاط غير سليمة)، سيتم أيضا وصمة عار موب40 طبقة المخاط جنبا إلى جنب مع أي العَدلات الحالية. في الممارسة العملية، وهذا لم يؤثر في تحليلنا، ولكن تجدر إشارة مصدرا محتملاً.
حاليا، هو موب40 العلامات البيولوجية العَدلات فقط التي يمكن التفريق بين عدم تفعيلها وتفعيل العَدلات حية. أيضا، لا تظهر موب40، خلافا لأساليب الكشف عن الأجسام المضادة، تغير في وظيفة أو البقاء على قيد الحياة من العَدلات في المختبر أو في الجسم الحي. على سبيل المثال، يمكن إضافة أجسام مضادة محددة ضد العَدلات يعيش إشارة تفعيل التي تؤثر على وظيفة العَدلات أو البقاء في البلد المضيف. وهذا يجعل موب40 كاشف مفيدة جداً للأبحاث المتعلقة بالإفراج عن التنشيط أو الحبيبية العَدلات في المختبر أو في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، موب40 مجموعة خصوصية مضيف واسع ويمكن أن يكون مترافق مباشرة إلى عدد من فلوروفوريس مختلفة، مما يسمح لاستخدامها في فحوصات المصبوغة خطوة واحدة عبر العديد من المضيفين. وهكذا، موب تلطيخ40 قابل للمقارنة بين الماوس، البشرية، وأهداف أخرى الثدييات، وأنه يبسط ويقلل من عدد الكواشف اللازمة للكشف عن العَدلات.
بينما يركز هذا البروتوكول تحديداً على الأنسجة والخلايا الحية التصوير باستخدام موب40، ونحن قد استخدمت أيضا بنجاح الببتيد في نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز ويعيش الحيوان في فيفو تصوير. ونحن نتوقع أن تكون موب40 قابلة لفحوصات مختلفة كثيرة تنطوي على الكشف عن العَدلات أو التصور من الأحداث المثيرة في الجسم، وأن الدراسات المستقبلية وبروتوكولات سوف توضع لزيادة النفوذ طيف موب يستخدم 40 ، لا سيما باستخدام تقنيات التصوير غير الغازية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتم سرد B.S.M. مخترع على موب40 براءات الاختراع:
موب40: EP11290403.2 براءات الاختراع الأوروبية، 09/09/2011.
ري موب40: EP براءات الاختراع الأوروبية رقم 17306746.3، 12/11/17.
Acknowledgments
أيد هذا العمل فوجاين لوريت مؤسسة (LF-2015-15) (B.S.M.) ويمنح ANR جكجك (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
