Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein der Neutrophilen behoben/permeabilized Histologie Abschnitte erkennen und bewerten den Aktivierungsstatus der live gereinigten Neutrophilen. Vor allem bindet MUB40 Peptid Lactoferrin in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden. Exposition der Granulat-Inhalte durch Permeabilisierung oder Neutrophilen Aktivierung ermöglicht die Kennzeichnung von Neutrophilen.
Abstract
Hier bieten wir ein Protokoll unter Verwendung von MUB40, ein synthetisiertes Peptid mit der Fähigkeit, glykosylierten Lactoferrin gespeichert in hohen Konzentrationen in bestimmten und tertiäre Körnchen der Neutrophilen zu binden. Dieses Protokolldetails wie MUB40 direkt an ein Fluorophor konjugiert einsetzbar, Neutrophile in feste/permeabilized Geweben sowie zu beflecken, wie Hiermit können live Cell Imaging für die Neutrophilen Aktivierung und de-Granulierung assay. Neutrophilenzahl Nachweismethoden beschränken sich auf Spezies-spezifische monoklonale Antikörper, die nicht immer für bestimmte Anwendungen geeignet sind. MUB40 die Zellmembran nicht durchdringen und ist somit von Lactoferrin gespeichert in nicht-aktiviert/nicht-permeabilized Neutrophilen ausgeschlossen. MUB40 hat den zusätzlichen Vorteil erkennen Lactoferrin aus ein breites Wirtsspektrum, macht es besonders nützlich für den Vergleich der Ergebnisse in Studien mit mehreren Forschungsmodelle, Verringerung der Zahl der doppelte Reagenzien und Vereinfachung der Protokolle durch ein-Schritt-Färbung.
Introduction
Neutrophile sind eines der primären Waffen des angeborenen Immunsystems und werden routinemäßig zu den Stätten der Entzündung um den Körper angeworben. Die Studie der Neutrophilen wurde weitgehend beeinträchtigt durch ihre kurze Lebensdauer in Vitro (weniger als 8 h) und begrenzte Erkennungs-Tools unter basalen Bedingungen oder nach der Aktivierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine erprobte Protokoll für die Breite und spezifische Erkennung von Säugetier-Neutrophils in feste/permeabilized Proben. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll zum Beizen live Neutrophilen mit MUB40. Mit dem live Neutrophilenzahl Färbung Protokoll, können den Zeitpunkt und Ort der Neutrophilen Aktivierung geortet werden. Dieses Protokoll ist ideal für Forscher, die Neutrophilen Aktivierung oder Granulat Release studieren möchten. Jenseits ihrer antimikrobiellen Funktionen werden Neutrophile jetzt als immunmodulatorische Zellen in einer Vielzahl von Krankheiten und Immunreaktionen (angeborene und adaptive)1,2geschätzt. Neutrophile sind im meisten entzündlichen Gewebe, bei hohen Stückzahlen im infizierten Gewebe, entzündliche Tumoren3, während IBS und Morbus Crohn Schübe4, und in Bereichen der nicht-infektiöse Entzündung wie die Synovia der rheumatoiden Arthritis ( RA) Patienten5. Neutrophilen enthalten vier Klassen von vorgeformten Körnchen namens Azurophil (α), spezifische (β1), Tertiär (β2) Granulat und sekretorischen Vesikel (γ)6. Bei der Migration zu einer entzündlichen Site rekrutierte Neutrophilen werden aktiviert und sequenziell sezernieren Granulat Inhalte (bestehend aus Adhäsion, antimikrobielle Substanzen und immunmodulatorischen Molekülen), die fördert weitere Rekrutierung und trägt zur Infektion Auflösung (aber auch zu Host Gewebeschäden)7. Während Neutrophile gelten ein kritischer Aspekt der angeborenen Immunität, bisher gibt es sind einige Nachweisreagenzen zur Verfügung, um sie zu studieren, und noch weniger, die kann verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der lebenden Neutrophilen zu beurteilen.
Aktuelle Methoden zur Erkennung von neutrophilen Granulozyten verlassen sich auf monoklonale Antikörper gegen die Zelloberfläche exponierten Antigene, wie Ly - 6 G2 oder Proteine im einzelnen gespeichert in Neutrophilen Granulat unter basalen Bedingungen (z. B. Myeloperoxidase erzeugt Lactoferrin). Vorteile von monoklonalen Antikörpern sind ihre starke Bindung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit unter verschiedenen Assay-Bedingungen. Es gibt jedoch einige Nachteile mit monoklonalen Antikörpern und Anti-Ly - 6G im besonderen. Diese Nachteile sind die Spezifität, Ly - 6G auf der Mehrzahl der myeloischen Zellen im Knochenmark und auf alle einschließlich der eosinophilen Granulozyten vorliegt; Entschlüsselung von Neutrophilen aus eosinophilen mit dieser Marker erfordert daher mehr komplexe Ansätze8. Eine weitere häufige Kompromiss mit monoklonalen Antikörpern ist ihre oft begrenzte Spezifität Wirtsspektrum, Vergleichsstudien mit mehreren Tierarten erschwert. Ein dritter Nachteil der Antikörper Abfragung Methoden, insbesondere bei Verwendung von lebenden Zellen oder in vivo, ist ihr Potenzial Zellfunktionen zu stören oder zu Zellaktivierung führen. Beispielsweise wird die Verwaltung von Anti-Ly - 6 G, Mäuse häufig auf Neutrophilen Erschöpfung und vorübergehende Neutropenie9angewendet. Zudem ist nachgewiesen, dass Antikörper Injektion Neutrophilenzahl Antitumor-Funktion10stimulieren kann. Schließlich verrät Antikörpernachweis der Neutrophilen nicht den Aktivierungsstatus der Zelle.
Wir haben festgestellt, dass eine 40-amino Acid Peptid namens MUB40, die in einer Reihe von Tests zu beschriften Neutrophilen in Vitro oder in Vivo Bedingungen sowie die Aktivierungsstatus des live Neutrophilen11assay verwendet werden können. MUB40 leitet sich vom MUB7012, eine Domäne der Lactobacillus Reuteri Oberfläche Schleim-Bindeprotein ursprünglich für seine Fähigkeit, Schleim13,14binden beschrieben. MUB40 interagiert mit glykosylierten Lactoferrin, das in hohen Konzentrationen in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden ist. MUB40 können diese Module durch standard Permeabilisierung Schritte in Histopathologie oder Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Protokolle für robuste Färbung der festen Neutrophilen ausgesetzt werden. Wenn live Neutrophilen in einem inaktivierten Zustand gehalten werden, das MUB40 Peptid ist aus dem Granulat Inhalt ausgeschlossen, und Zellen keine Flecken, positiv mit dem Marker. Nach der Aktivierung können MUB40 binden an exponierten Lactoferrin und zu robusten Färbungen mit das Peptid führen. So kann MUB40 verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der gereinigten Neutrophilen, so dass es einen attraktive Marker der infektiösen Prozess folgen bestimmen. Auch Möglichkeit, binden an aktivierte Neutrophilen Leben MUB40 als Werkzeug verwendet werden, um Bereiche der Neutrophilen Entzündung in live Tiermodellen (z. B. einer Maus Arthritis Modell15) zu erkennen. Die Protokolle in diesem Manuskript Detail wie Eindringmittel beschriftet MUB40 einsetzbar, Neutrophile in Histologie Gewebe und wie man die Aktivierung des live gereinigten Neutrophilen in-vitro-Tests zu offenbaren.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden überprüft und genehmigt von den französischen Organisationen CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) und CNIL (Kommission Nationale Informatique et Liberté).
1. Neutrophile im Histopathologie Gewebe mit Gewebekulturen Färbung gekennzeichnet MUB40
- Um das Gewebe für die Histopathologie zu erhalten, befestigen Sie Gewebeentnahme/Abschnitte in einem geeigneten Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bis zu 4 h je nach der Dicke der Probe. Legen Sie die Proben im Kühlschrank 4 ° C, während der Fixierung.
Hinweis: Alternative Fixierung Methoden/Timings können je nach individuellen Anforderungen des Benutzers ersetzt werden.- Entfernen der PFA, fügen Sie 16 % Saccharose-Lösung mit genügend Volumen, um die Probe vollständig zu bedecken, und legen Sie die Probe bei 4 ° C für 4 h bis zur Übernachtung.
- Entfernen Sie 16 % Saccharoselösung und fügen Sie 30 % Saccharoselösung bei einem großen genug um die Probe vollständig zu bedecken hinzu, und legen Sie sie bei 4 ° C für 4 h bis zur Übernachtung.
- Entfernen Sie die 30 % Saccharose-Lösung und tupfen Sie überschüssige Lösung aus dem Gewebe mit einem Papiertuch. Die Gewebe-Abschnitt in optimale Temperatur (OCT) Medien und Snap-Freeze in 2-Methylbutane in Trockeneis-Ethanol Badewanne (-72 ° C) abgekühlt. Sobald (nach ~ 2 min) gefroren, entfernen Sie Blöcke aus der 2-Methylbutane und legen Sie sie auf Trockeneis, bis alle Blöcke fertig und bereit für die langfristige Lagerung sind. Speichern Sie die gefrorenen Blöcke bei-80 ° C für die langfristige Lagerung.
- Am Abend vorher Gewebe Blöcke sind zu schneiden, entfernen Sie sie aus dem-80 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie bei-20 ° C über Nacht equilibrate.
- Mit einem Kryostaten, schneiden Sie OCT-eingebettetes Gewebe in 10 - 30 μm dicke Scheiben und adsorbieren Sie, qualitativ hochwertige Glas-Objektträger.
Hinweis: Dicker oder dünnere Scheiben können abhängig von den experimentellen Anforderungen verwendet werden. - Zeichnen Sie mit einem Wachs-Stift oder anderen hydrophoben Methode ein Feld um die Gewebe-Scheibe auf den Objektträger und lassen Sie trocknen.
- Vorbereiten der Färbelösung durch Ausführen einer 1:1,000 Verdünnung der MUB40-Cy5 (oder andere fluoreszierende MUB40Version, 1 mg/mL Stammlösung) in 0,1 % Saponin-PBS-Lösung. Die optimale MUB40 Endkonzentration sollte 1 μg/mL.
Hinweis: Untere Endkonzentrationen verwendet werden (0,1-0,01 μg/mL), aber kann um zu niedrigeren Signalintensität führen.
Achtung: Saponin Pulver kann Atmung Reizungen verursachen. Achten Sie darauf, Saponin in einem Schaltschrank oder geschützten Bereich wiegen. Alternative Permeabilisierung Methoden können z. B. Triton verwendet werden. Fügen Sie zusätzliche Markierungen bei vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen (zB., 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Phalloidin, fluoreszierende Antikörper). - Tauchen Sie vorsichtig die Objektträger in eine Lösung von 0,1 % Saponin-PBS dreimal.
- Sorgfältig blot entfernt überschüssige Flüssigkeit um den Gewebe-Abschnitt und fügen Sie genug Färbelösung um Abschnitt Gewebe vollständig zu bedecken. Legen Sie die Folie in eine feuchte Kammer zur Vermeidung von Verdampfung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Halten Sie es vor Licht geschützt werden.
- Tauchen Sie vorsichtig die Folie in 0,1 % Saponin-PBS-Lösung 3 X. Dann tauchen Sie sanft die Folie in PBS-Lösung 3 X. Schließlich tauchen Sie sanft das Abrutschen in destilliertem H2O 3 X. Trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Folie.
- Fügen Sie eine kleine Menge (~ 20 μl) Eindeckmedium (20 mM Tris pH 8.0, 0,5 % N-Propyl Gallat, 90 % Glycerin) neben der Gewebe-Scheibe und einem Glas Deckgläschen auf den Objektträger legen Sie sanft hin. Schonend und gleichmäßig drücken Sie das Deckglas auf Abschnitt Gewebe und mit einem Papiertuch, entfernen Sie vorsichtig alle Montage-Medien, die an den Rändern des Deckglases extrudiert.
- Legen Sie die montierte Folie in einem dunklen Schrank für 24 h erlauben die Montage-Medien zu festigen. Alternativ legen Sie die montierte Folie bei 37 ° C für 1 h.
- Mit einem Kryostaten, schneiden Sie OCT-eingebettetes Gewebe in 10 - 30 μm dicke Scheiben und adsorbieren Sie, qualitativ hochwertige Glas-Objektträger.
- Bild des Gewebes Scheiben auf einem fluoreszierenden Mikroskop nach der gewünschten Erwerbsmethode.
2. Visualisierung von Neutrophilen Aktivierung mit Retro-Inverso-MUB40-Cy5 Peptid
- Erhalten Sie menschlichen Neutrophilen verwenden das folgende Protokoll. Bereiten Sie die folgenden Lösungen und legen Sie sie in einer anoxischen Kabinett über Nacht. Einwirkung von Sauerstoff wird zur Aktivierung von Neutrophilen und weiter induzieren Zelle Tod16,17beginnen.
Hinweis: Neutrophile können alternativ gereinigt werden "auf der Bank" für MUB40-Kennzeichnung Experimente; Beachten Sie jedoch, dass Sauerstoff Exposition Neutrophilenzahl Aktivierung auswirken wird.- Bereiten Sie die folgende Lösung:
Lösung 1 [0,9 % Natriumchlorid (NaCl)]: 500 mL H2O. Filter die Lösung 4,5 g NaCl hinzufügen.
Lösung 2 (Dextran 6 %): 100 mL 6 g Dextran in NaCl 0,9 % Lösung hinzufügen.
Lösung 3 (Waschen-Puffer): Auflösen von Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in PBS pH 7,2 bis eine EDTA-Endkonzentration von 2 mM. Unmittelbar vor Gebrauch lösen Sie Rinderserumalbumin (BSA) in der PBS/EDTA-Lösung so, dass die Endkonzentration BSA 10 % w/V auf. - Zentrifugieren Sie Blutentnahmeröhrchen 650 X g für 20 min ohne Pause.
- Ohne Unterbrechung der getrennten Blut, übertragen Sie die Blutentnahmeröhrchen auf einer anoxischen Kabinett und sammle Plasma Brüche (oben) in einem 50 mL konische Röhrchen.
- Entfernen Sie das Plasma-haltigen Rohr aus dem anoxischen Kabinett und Zentrifuge bei 2.900 x g für 20 min mit Pausen, um die Thrombozyten pellet.
- Ohne Unterbrechung die gebeizte Thrombozyten, überweisen Sie sanft die Plasma Röhre zurück auf der anoxischen Kabinett und Pipettieren der Thrombozyten Armen Plasma in ein frisches 50 mL Röhrchen (nachstehend "Plasma").
- Bereiten Sie die folgende Lösung:
- Trennung von roten Blutkörperchen Leukozyten
- Verwenden die Röhrchen mit der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) aus Schritt 2.1.3., kombinieren die Erythrozyten in einer konischen 50 mL-Tube (5 Blut Sammlung Rohr Inhalt pro 50 mL-Tube).
- Fügen Sie NaCl 0,9 % hinzu, bis das Gesamtvolumen 44 mL erreicht. 6 mL Dextran 6 % (letzte) hinzugeben.
- Mischen Sie vorsichtig die Blut/Dextran-Mischung durch Umdrehen der Röhre 10 - 20 Mal. Lassen Sie das Rohr Sediment für mindestens 30 Minuten.
- Während Ablagerung stattfindet, bereiten Sie einen Percoll-Gradienten 5,8 mL Plasma in einem 15 mL konische Röhrchen 4,2 mL Percoll-Lösung hinzu, und mischen Sie gut durch das Rohr invertieren.
- Sammeln der oberen Teil der Dextran bei dem Versuch, Pipettieren Erythrozyten zu vermeiden.
- Ziehen Sie die Schraubkappe, entfernen Sie die Dextran-Röhre aus der anoxischen Kammer und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g für 10 min mit Pausen.
- Vorsichtig setzen Sie den Schlauch wieder in anoxischen Kammer ohne zu stören die gebeizte Zellen, und entfernen Sie die Flüssigkeit über pipettieren.
- Sanft wieder aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL Plasma und sehr langsam an die Spitze der die Percoll-Lösung. Achten Sie darauf, dass Sie nicht mischen der Schichten, wenn die Zellen an der Spitze Pipettieren zu induzieren.
- Entfernen Sie vorsichtig die Percoll-Lösung-Röhre von anoxischen Kammer (Vermeidung mischen) und Zentrifuge bei 800 X g für 20 min ohne Pause. Peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) bleibt auf die Percoll-Lösung-Oberfläche und Neutrophilen werden Pellets mit der Erythrozyten.
- Entfernung von kontaminierenden Erythrozyten
- Bereiten Sie 14 mL Pufferlösung zu waschen, indem Sie 14 mL Waschpuffer 700 μl PBS + 10 % BSA hinzufügen.
- Setzen Sie die Percoll-Lösung-Röhre wieder in der anoxischen Kammer. Entfernen Sie die Percoll und PBMCs über pipettieren und auszusetzen Sie gebeizte Zellen in 1 mL der Pufferlösung waschen wieder. Das Pellet wieder ausgesetzt sein wird eine rote Farbe aufgrund von kontaminierenden Erythrozyten haben.
- Die neu suspendierten Zellen 200 μL des Anti-CD235a (Glycophorin) magnetische Beads hinzufügen, vorsichtig mischen und mindestens 15 min inkubieren. Dieser Schritt lädt die kontaminierenden Erythrozyten mit magnetischen Beads, damit sie entfernt werden können.
- Waschen der Trennsäule mit 2 mL des Waschens Puffer 3 X.
- Halten Sie eine 15 mL konische Rohr unter der Spalte "Trennung" pipette langsam die Neutrophilen/RBC-Mischung auf den oberen Rand der Spalte. Sammeln Sie die Zellen in der 15 mL konische Röhre, wie sie durchfließen. Die Durchströmung sollte bewölkt sein und verlieren seine rote Farbe durch die Erythrozyten bleiben an der Spalte gebunden.
- Fügen Sie 2 mL Waschpuffer an die Spitze der Säule und sammeln Sie sich in der gleichen 15 mL konische Rohr. Bis zum Ende des Spülprogramms 2 mL sollte der durchströmten klar sein, was bedeutet, dass die Neutrophilen gesammelt worden sind.
- Mischen Sie vorsichtig das Rohr um sorgen für gleichmäßige Verteilung der Neutrophilen und 10 μL für Zellzählung zu sammeln. Beachten Sie das Endvolumen für Zelle zählen Zwecke. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einer Standardzelle Zählmethode auf.
- Entfernen der Neutrophilen Röhre aus der anoxischen Kammer und Zentrifugieren die Neutrophilen bei 300 X g für 20 min mit Pausen.
- Setzen Sie sedimentierte Neutrophilen anoxischen Kammer zurück und entfernen Sie waschen Puffer über pipettieren. Wieder aussetzen der Neutrophilen Pellet im Plasma mit einer maximalen Zelldichte von 107 PMN/mL.
- Aufzählung der gereinigten Neutrophilen und Visualisierung mit MUB40
- Fügen Sie 1 μL des RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL), 1 mL der eine Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium ohne Phenol rot. Durch Pipettieren gut mischen.
- Für die Zwecke dieses Protokolls wurde das Ergebnis erläutert, wie wenn ein potenter Neutrophilen Aktivierung Reagenz, N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (FMLP), wird hinzugefügt. Die RPMI/RI-MUB401 μm FMLP hinzufügen-Cy5 Rohr und Mix über Pipettieren rauf und runter.
Hinweis: Jeder Versuchsdurchführung wird von diesem Punkt vorwärts, je nach der Fragen unterscheiden. - 1 mL RPMI/RI-MUB40überführen-Cy5/FMLP-Mischung zu einer Glasschale unten Mikroskopie. Dieses Gericht fügen Sie ein Volumen von gereinigten Zellen entspricht 106 total Neutrophilen hinzu. Mischen Sie, indem Sie sanft pipettieren.
- Legen Sie die Schale in einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop und starten Sie Bildaufnahme zu. Beispielsweise empfiehlt es sich, Grundlinie Bilder vor der Zugabe von einer Aktivierung von Neutrophilen Reagenz wie FMLP oder Bakterien erwerben. In diesem Beispiel beginnen die Übernahme von RPMI/RI-MUB40-Cy5/Neutrophilen, und bei einer späteren Timepoint pipette die Aktivierung von Neutrophilen Reagenz in der Glasschale und Bildaufnahme fortsetzen.
Hinweis: Änderungen an diesen Schritten können basierend auf wissenschaftlichen Bedürfnisse erfolgen. - Prozess erworbenen Bilder/time-Zeitraffer Filme wie bezieht sich auf die speziellen Mikroskop verwendet.
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Representative Results
Ergebnisse der MUB40-gefärbten Gewebe von Histopathology Dias zeigen in der Regel einzelne Zellen in das Gewebe verteilt. MUB40 Flecken Lactoferrin, die ist in Neutrophilen Granulat und Abteilen. So gesehen, in der Regel punctata beflecken oder mehrere große getrennte Bereiche des Signals aus einzelnen Neutrophilen (Abbildung 1) kommen. Es ist hilfreich, fügen eine zweite Zelle Markierung wie DAPI zu helfen, das MUB40 Signal mit der gefärbten Zelle Co zu lokalisieren. Die Gesamtzahl der gefundenen Zellen hängt von der Anzahl der Neutrophilen im Blickfeld und kann variieren erheblich je nach Quelle und Stärke der Immunantwort. Hier sind repräsentative Bilder aus gereinigtem festen menschlichen Neutrophilen (Abb. 1A) und eine Gewebeentnahme eine Colitis ulcerosa Patienten (Abbildung 1B). Gezeigt werden Bilder von einem relativ niedrigen Niveau von Neutrophilen in der Lunge von Mäusen mit Klebsiella Pneumoniae (Abbildung 1C) infiziert und ein hohes Maß an neutrophilen Granulozyten in den Dickdarm ein Meerschweinchen infiziert mit Shigella Sonnei (Abbildung 1D).
Ergebnisse mit live, gereinigten Neutrophilen zeigen in der Regel wenig bis keine Zelle Färbung zu frühen Zeitpunkten und schrittweise erhöhen, RI-MUB40 Färbung im Laufe der Zeit weitere Neutrophile aktiviert werden. Hier dargestellt ist eine Zeitreihe Kurs von Bildern aus einem Experiment mit gereinigtem menschlichen Neutrophilen mit fluoreszierenden S. Sonnei (Abbildung 2) infiziert. Abhängig von der Stärke des aktivierenden Signals können Neutrophile beginnen Färbung mit MUB40 schnell, so ist es empfehlenswert, starten, Importieren von Bildern vor der Zugabe von Aktivatoren. Wenn Zellen aktiviert werden und RI-MUB40 positive, sollten sie ein ähnliches Färbung Profil mit der festen und permeabilized Zellen weisen die eine punktförmige Anfärbung geben. Die optimale Konzentration der MUB40 für beide live und feste Zelle Färbung ist 1 μg/mL (Abbildung 3). Niedrigere Konzentrationen (0,1-0,01 μg/mL) kann verwendet werden, aber Ergebnis geringer Signalintensität. Es wird auch empfohlen, verwenden eine DIC-Bild oder anderen live-Cell-Fleck um zu unterscheiden, welche Zellen ein RI-MUB40 Signal angezeigt werden.
Abbildung 1 : MUB 40 -gebeizt Neutrophilen von Mensch, Maus und Meerschweinchen Herkunft. (A) Vertreter MUB40 Färbung (grün) der Neutrophilen von gesunden menschlichen Spendern gereinigt. Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. (B) Färbung der menschlichen Neutrophilen im Gewebe aus einer Biopsie der Colitis ulcerosa. Neutrophile werden mit MUB40 (grün) aufgedeckt und Zellkerne gefärbt mit DAPI (blau). (C) Histopathologie aus der Lunge einer Maus mit Klebsiella Pneumoniaeinfiziert. Maus Neutrophilen werden im Gewebe mit MUB40 (grün) aufgedeckt und Zellkerne gefärbt mit DAPI (blau). (D) Histopathologie aus dem Dickdarm ein Meerschweinchen mit Shigella Sonneiinfiziert. Neutrophilen, die Reaktion auf die Infektion zeigen sich im Gewebe mit MUB40 (grün). S. Sonnei Bakterien (rot) zum Ausdruck bringen des fluoreszierende DsRED Proteins. Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Live Neutrophilen Fleck mit MUB 40 nur bei aktiviertem. Ausgewählte Bilder aus einer Zeitreihe Zeitraffer mit gereinigtem menschlichen Neutrophilen im Beisein von RI-MUB40mit S. Sonnei infiziert. Im ersten Begegnungen Satz von Bildern (oben) ein Neutrophilen S. Sonnei Bakterium (rot) mit einem grünen Pfeil angezeigt. Im Laufe der Zeit ist das Bakterium durch die Neutrophilen verinnerlicht und verdaut. Da die Neutrophilen aus den Bakterien aktiviert wird, färbt es schrittweise stärker mit RI-MUB40. Bilder auf der linken Seite sind fluoreszierende Kanäle mit DIC Bilder überlagert. Bilder auf der rechten Seite sind nur fluoreszierende Kanäle. Bilder wurden in 5-Minuten-Intervallen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Wirkung der verschiedenen MUB 40 Konzentrationen an Neutrophilen beflecken. Repräsentative Färbung der fest/permeabilized Neutrophilen mit verschiedenen Konzentrationen von MUB40-Cy5. Gereinigte menschlichen Neutrophilen wurden fixiert und gefärbt mit der angegebenen Konzentrationen von MUB40-Cy5. Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier sind zwei Tests beschrieben, in denen das MUB40 Peptid verwendet wird, um Neutrophilenzahl Entzündung und Aktivierung zu studieren. Wir zeigen, wie MUB40 offenbaren kann, Neutrophile in Histopathologie Abschnitte oder zeigen ihren Aktivierungsstatus mit live gereinigten Neutrophilen. Die entscheidenden Schritte für die Verwendung von MUB40 als Färbung Reagens sind dasselbe wie mit keiner anderen Methode der Fluoreszenz-Detektion. Vorsicht ist geboten, damit Kompatibilität von fluoreszierenden Signalen und angemessene Waschschritte ergriffen wurden, um die Hintergrundfärbung entfernen. Die wichtigsten Überlegungen, die gute Färbung Ergebnisse zu erzielen sind die Qualität des Mikroskops, Glas Folien/Deckel rutscht und die Gewebeschnitte. Beim Anzeigen von live gereinigter Neutrophils sind die wichtigsten Schritte in den Reinigungsprozess selbst. Neutrophile sind empfindlich und können durch eine Reihe von verschiedenen Signalen aktiviert werden. Um sicherzustellen, dass das Experiment sinnvolle Ergebnisse liefert, muss darauf geachtet werden, halten die gereinigten Neutrophilen inaktiv, bis sie einsatzbereit sind. Dies kann erreicht werden, durch Ausführen der Neutrophilen Reinigung-Protokoll in einer anoxischen Kammer, Neutrophilen Einwirkung von Sauerstoff zu begrenzen.
Eine Einschränkung und Vorteil der MUB40, abhängig von den experimentellen Frage gerichtet und ist, dass MUB40 nur Flecken Neutrophilen aktiviert, wenn sie irgendwie permeabilized sind. Dies kann ein großer Vorteil sein, wenn das Experiment folgende Entzündung in einem lebenden Tier oder gereinigte Zelle fordert, aber es ein Nachteil sein kann, wenn das Experiment Erkennung von allen live Neutrophilen unabhängig vom Aktivierungsstatus erfordert. Eine zweite mögliche Beschränkung auf dieses Protokoll ist die Tatsache, dass Lactoferrin ist in verschiedenen körperlichen Absonderungen wie Tränen, Milch und Schleim. Für Histopathologie Färbung, in denen diese Sekrete (z.B. Kolon Biopsien bestehen, die Schleimschicht intakt ist), wird MUB40 auch die Schleimschicht zusammen mit jedem gegenwärtigen Neutrophilen beflecken. In der Praxis dies bisher nicht unsere Analyse beeinflussen, aber als mögliche Signalquelle anzumerken.
Derzeit ist MUB40 nur Neutrophilenzahl Biomarker, die aktivierten und nicht aktivierten live Neutrophilen unterscheiden kann. Auch scheint MUB40, im Gegensatz zu Antikörper Abfragung Methoden, nicht die Funktion oder das Überleben von Neutrophilen in Vitro oder in Vivozu ändern. Zugabe von spezifischen Antikörpern gegen live Neutrophilen kann beispielsweise eine aktivierende Signal beeinflussen Neutrophilen-Funktion oder das Überleben im Wirt sein. Dadurch werden MUB40 ein sehr nützliches Reagenz für Forschung an Neutrophilen Aktivierung oder Granulat Release in Vitro oder in Vivo. Darüber hinaus MUB40 hat ein breites Wirtsspektrum Spezifität und können direkt zu einer Reihe von verschiedenen Fluorophore, so dass für den Einsatz in einem Schritt Färbung Tests über mehrere Hosts konjugiert werden. So MUB40 Färbung ist vergleichbar zwischen Maus, Mensch, und anderen Säugetieren Ziele, und es vereinfacht und reduziert die Anzahl der Reagenzien Neutrophilen erkennen musste.
Während dieses Protokoll konzentriert sich speziell auf Histopathologie und live Cell Imaging mit MUB40, wir haben auch erfolgreich verwendet, das Peptid bei der Sortierung von FACS und leben Tiere in-Vivo Bildgebung. Wir gehen davon aus, dass MUB40 viele verschiedene Tests mit der Erkennung der Neutrophilen oder entzündliche Ereignisse im Körper zugänglich sein wird und dass zukünftige Studien und Protokolle zu weiteren Hebel das Spektrum der MUB entwickelt werden 40 verwendet, vor allem mit nicht-invasiven bildgebenden Techniken.
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Disclosures
B.S.M. wird als Erfinder auf MUB40 Patente aufgeführt:
MUB40: Europäische Patent EP11290403.2, 09.09.2011.
RI-MUB40: Europäische Patent EP Nr. 17306746.3, 12.11.17.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) und ANR JCJC gewährt (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
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