Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות הנוכחות של נויטרופילים בסעיפים היסטולוגיה קבוע/permeabilized ולהעריך את מצב ההפעלה נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. בפרט, פפטיד40 MUB מאגד לקטופרין נוכח בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. חשיפה של התכנים גרגר דרך permeabilization או הפעלה נויטרופילים מאפשר הסימון של נויטרופילים.
Abstract
כאן, אנו מספקים פרוטוקול הכרוכות של MUB40, פפטיד מסונתזת את היכולת לאגד לקטופרין glycosylated המאוחסן בריכוזים גבוהים בגרגרים שלישוני וספציפית של נויטרופילים. זה פרטי פרוטוקול איך MUB40 מצומדת ישירות אל fluorophore יכול לשמש כתם נויטרופילים ברקמות קבוע/permeabilized וכן איך ניתן להשתמש ב- live-תא הדמיה כדי assay הפעלה נויטרופילים, פרור ולהשתחרר. שיטות איתור נויטרופילים מוגבלות תלויי מין נוגדנים חד-שבטיים, אשר אינם תמיד מתאים עבור יישומים מסוימים. MUB40 אינו לחדור את קרום התא, ולכן נכללו לקטופרין המאוחסן בשאינם-מופעל/הלא-permeabilized נויטרופילים. MUB40 יש ערך מוסף של הכרה לקטופרין ממגוון המארחת רחב, שימושי במיוחד עבור השוואת תוצאות מחקרים שכללו מספר מודלים מחקר, צמצום מספר ריאגנטים כפולים, ופישוט פרוטוקולים דרך מכתים צעד אחר צעד.
Introduction
נויטרופילים באחת הזרועות העיקרית של מערכת החיסון המולדת, מגויסים באופן שגרתי לאתרים של דלקת סביב הגוף. המחקר של נויטרופילים נפגע במידה רבה על ידי שלהם אורך קצר במבחנה (פחות מ- 8 שעות) על ידי כלי איתור מוגבלת בתנאים הבזליים או לאחר ההפעלה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נבדק היטב עבור גילוי רחב וספציפי של נויטרופילים בתרבית של דגימות קבוע/permeabilized. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט עבור צביעת נויטרופילים לחיות עם MUB40. באמצעות פרוטוקול מכתימים נויטרופילים בשידור חי, העיתוי והמיקום של הפעלת נויטרופילים יכול ניתן למצוא. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור חוקרים המבקשים ללמוד שחרור הפעלה או גרגר נויטרופילים. מעבר שלהם פונקציות מיקרוביאלית, נויטרופילים יתקבלו בברכה עכשיו כתאים immunomodulatory מעורב במגוון רחב של מחלות תגובות מערכת החיסון (מולדת ולא אדפטיבית)1,2. הנויטרופילים הם נוכח רקמות דלקתיות ביותר, במספרים גבוהים ברקמות נגוע, גידולים דלקתיות3, במהלך IBS, קרוהן התלקחויות4, ו באזורים של דלקת שאינן זיהומיות כגון synovia של דלקת מפרקים שגרונית ( חולי RA)5. נויטרופילים להכיל ארבע כיתות של גרגרי הקבועים מראש בשם azurophil (α), ספציפי (β1), גרגרי השלישון (β2) והפרשה שלפוחית (γ)6. על ההעברה לאתר דלקתיות, נויטרופילים מגויס להיות מופעל, ברצף להפריש גרגר תוכן (מורכבת אדהזיה, תרכובות מיקרוביאלית ומולקולות immunomodulatory), אשר מקדם נוסף גיוס ותורמת זיהום רזולוציה (אלא גם כדי נזק לרקמות מארח)7. בעוד נויטרופילים נחשבים היבט חשוב של מולדת חסינות, לצאת לשם עם ריאגנטים זיהוי כמה זמין ללמוד אותן, אפילו פחות כי ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב ההפעלה של נויטרופילים לחיות.
שיטות הנוכחי של גילוי נויטרופילים להסתמך על נוגדנים חד-שבטיים שנוצר כנגד אנטיגנים חשוף תא-השטח, כגון Ly - 6 G2 או חלבונים ספציפי המאוחסן בגרגרים נויטרופילים בתנאים הבזליים (למשל, myeloperoxidase לקטופרין). היתרונות של נוגדנים חד-שבטיים כוללים שלהם הנחשב חזק, רגישות, רב-תכליתיות בתנאים assay שונים. עם זאת, ישנם מספר חסרונות באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ו- anti-Ly - 6G בפרט. חסרונות אלה כוללים יחודיות, כמו Ly - 6G הוא נוכח במרבית התאים מיאלואידית במח העצם ועל כל גרנולוציטים כולל אאוזינופילים; לפיכך, פיענוח נויטרופילים של אאוזינופילים עם סמן זה דורש יותר מתחמי מתקרב8. עוד חליפין תכופים עם נוגדנים חד-שבטיים הוא בהיקף ירידה לפרטים מארח לעיתים קרובות מוגבל, מקשה על מחקרים השוואה עם מיני בעלי חיים אחד או יותר. החיסרון השלישי של שיטות זיהוי נוגדנים, במיוחד כאשר באמצעות תאים חיים או ויוו, הוא הפוטנציאל שלהם כדי לשבש את תפקוד התא או להוביל ההפעלה התא. לדוגמה, הממשל של אנטי-Ly - 6G לעכברים בדרך כלל חלה על דלדול נויטרופילים, נויטרופניה ארעי9. זה בנוסף הוכח כי הזרקת נוגדנים עשוי לעורר פונקציה antitumor נויטרופילים10. לבסוף, זיהוי נוגדנים של נויטרופילים אינו חושף את מצב ההפעלה של התא.
זיהינו פפטיד חומצה אמינו 40 בשם MUB40, אשר יכול לשמש במספר מבחני תווית נויטרופילים בתנאים במבחנה או ויוו , כמו גם assay את מצב ההפעלה של נויטרופילים בשידור חי11. MUB40 נגזרת70MUB12, תחום של לקטובצילוס reuteri פני השטח מחייב ריר החלבון במקור תיאר את יכולתו לקשור ריר13,14. MUB40 אינטראקציה עם לקטופרין glycosylated הקיים בריכוזים גבוהים בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. יכול להיות חשופים MUB40 גרגירים אלה הצעדים permeabilization סטנדרטי, נוכח histopathology או תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) פרוטוקולים עבור צביעת חזקים של נויטרופילים קבוע. כאשר נויטרופילים לחיות נשמרים במצב מוחלש, פפטיד40 MUB הוא נשלל מן התכנים גרגר, התאים אינו מכתים חיובית עם הסמן. בעת ההפעלה, MUB40 ניתן לאגד לקטופרין חשוף, להוביל מכתים חזקים עם פפטיד. לפיכך, MUB40 יכול לשמש כדי לקבוע את מצב ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים, שהופך אותו סמן אטרקטיבי כדי לעקוב אחר תהליך זיהומיות. היכולת לאגד לחיות נויטרופילים הופעל גם מאפשר MUB40 לשמש ככלי, לזהות אזורים דלקתיים נויטרופילים במודלים חיים של בעלי חיים (למשל, מודל דלקת פרקים15העכבר). הפרוטוקולים בפירוט כתב היד הזה איך fluorescently הנקרא MUB40 יכול לשמש כדי לחשוף נויטרופילים ב היסטולוגיה רקמות וכיצד assay את ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים חיים במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן נבדקו ואושרו על ידי ארגוני הצרפתי CoRC (Comité de Recherche קליניק) CPP (des Comité דה הגנה Personnes), CNIL (הועדה הלאומית ואח ליברטה).
1. צביעת נויטרופילים ברקמת Histopathology עם Fluorescently מתויג MUB40
- כדי להשיג את הרקמה עבור histopathology, לתקן מקטעים ביופסיה רקמות/נפח מתאים של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 30 דקות עד 4 h תלוי בעובי של המדגם. מקם את הדגימות במקרר 4 ° C במהלך קיבעון.
הערה: שיטות קיבוע חלופי/תזמונים. הרבה בהתבסס על הצרכים הייחודיים של המשתמש.- להסיר את כדורגלן, להוסיף 16% סוכרוז פתרון עם נפח מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ולמקם את הדגימה ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.
- הסרת 16% סוכרוז פתרון להוסיף 30% סוכרוז פתרון בכל נפח גדול מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ומקם אותו ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.
- הסר את הפתרון 30% סוכרוז, למחוק את הפתרון עודף מרקמות עם מגבת נייר. במקום סעיף הרקמה בתקשורת טמפרטורה (אוקטובר) חיתוך אופטימאליים, snap-הקפאת ב- 2-methylbutane מקורר באמבט קרח יבש-אתנול (-72 מעלות צלזיוס). ברגע קפואה (לאחר ~ 2 דקות), להסיר בלוקים מ- 2-methylbutane ומניחים אותם על קרח יבש עד אבני כרגע מוכן לאחסון לטווח ארוך. אחסן את רחובות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
- בלילה לפני אבני רקמה הן לחתוך, להסיר אותם מן המקפיא-80 ° C, למקם אותם ב-20 ° C בלילה כדי equilibrate.
- שימוש של cryostat, OCT-מוטבע רקמות לחתוך לפרוסות בעובי μm 10 - 30, לספוח על שקופיות זכוכית באיכות גבוהה.
הערה: ניתן להשתמש פרוסות עבה או דק יותר בהתאם לדרישות ניסיוני. - עם עט שעווה או שיטה אחרת הידרופוביות, צייר תיבה מסביב הפרוסה רקמות בשקופית זכוכית ותנו יבש.
- להכין את הפתרון צביעת על-ידי ביצוע לדילול 1:1,000 MUB40-Cy5 (או גירסה40אחרים MUB פלורסנט, פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל) ב- 0.1% סאפונין-PBS פתרון. ריכוז40 MUB הסופי אופטימלית צריך להיות 1 μg/mL.
הערה: ריכוז סופי נמוך יותר ניתן להשתמש (0.1-0.01 μg/mL) אבל עלול לגרום להורדת עוצמת האות.
התראה: אבקת סאפונין יכול לגרום לגירוי של הנשימות. הקפד לשקול סאפונין באזור ארון או מוגן. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות permeabilization כגון טריטון. להוסיף סמנים נוספים בריכוזים מומלץ יצרן (למשל., 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), phalloidin, פלורסנט נוגדנים). - בעדינות לטבול את השקופית זכוכית לתוך פתרון של 0.1% סאפונין-PBS שלוש פעמים.
- בזהירות כתם נמצא עודף נוזל סביב סעיף הרקמה ומוסיפים מספיק פתרון מכתימים לכסות לגמרי את סעיף הרקמה. מקם את השקופית לתא לחות כדי למנוע אידוי דגירה זה לשעה בטמפרטורת החדר. . לשמור את זה מוגן מפני אור.
- בעדינות לטבול את השקופית בתוך תמיסת סאפונין-PBS 0.1% 3 x. ואז, בעדינות לטבול את השקופית לתוך PBS פתרון 3 x. לבסוף, בעדינות לטבול את השקופית לתוך מזוקקים H2O 3 x. בזהירות יבש עודף נוזל מתוך השקופית.
- להוסיף כמות קטנה (~ 20 μL) של הרכבה בינונית (20 מ מ טריס pH 8.0, מספר N-propyl 0.5%, 90% גליצרול) ליד הפרוסה רקמות ולהניח בעדינות למטה coverslip זכוכית על גבי השקופית זכוכית. בעדינות ובצורה שווה הקש את coverslip אל סעיף הרקמה, בעזרת מגבת נייר, הסר בזהירות אמצעים כלשהם הרכבה extrudes מסביב לקצוות של coverslip.
- למקם את השקופית הנטען בארון חשוך במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התקשורת הרכבה לגבש. לחלופין, במקום השקופית הנטען בגיל 37 מעלות לשעה.
- שימוש של cryostat, OCT-מוטבע רקמות לחתוך לפרוסות בעובי μm 10 - 30, לספוח על שקופיות זכוכית באיכות גבוהה.
- תמונה הפרוסות רקמות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפי שיטת הרכישה הרצוי.
2. הדמיה של הפעלת נויטרופילים עם רטרו-Inverso-MUB40-Cy5 פפטיד
- להשיג נויטרופילים האנושי באמצעות פרוטוקול הבאים. להכין את הפתרונות הבאים, מקם אותם בתוך ארון ללון אנאוקסיים. חשיפה לחמצן יתחיל להפעיל נויטרופילים, עוד יותר לגרום לתא המוות16,17.
הערה: נויטרופילים יכול לחילופין להיטהר "על הספסל" MUB40-תיוג ניסויים; עם זאת, להיות מודע כי חשיפה חמצן יתחיל להשפיע על הפעלת נויטרופילים.- הכן את הפתרון הבא:
פתרון 1 [נתרן כלורי (NaCl) 0.9%]: הוספת 4.5 גר' NaCl עד 500 מ"ל של H2O. מסנן הפתרון.
פתרון 2 (לתוספי 6%): להוסיף 6 גר' לתוספי בפתרון 0.9% NaCl 100 מ ל.
פתרון 3 (מאגר כביסה): להמיס חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב- PBS pH 7.2 כדי ריכוז EDTA הסופי של 2 מ מ. מייד לפני שימוש, להתמוסס שור אלבומין (BSA) בפתרון PBS/EDTA כך הריכוז הסופי של BSA הוא 10% w/v. - צנטריפוגה צינורות איסוף דם ב g x 650 במשך 20 דקות בלי הפסקות.
- מבלי לשבש את פעולת הדם מופרדים, העברת צינורות איסוף דם שברים אנאוקסיים בארון, לאסוף פלזמה (למעלה) צינור חרוטי 50 מ.
- הסר את הצינור המכיל פלזמה מן הארון אנאוקסיים צנטריפוגה ב 2,900 x g כעשרים דקות עם הפסקות כדי הצניפה טסיות הדם.
- מבלי לשבש את פעולת טסיות הדם pelleted, בעדינות העברת הצינור פלזמה בחזרה לתוך ארון אנאוקסיים ו pipet טסיות פלזמה המסכן לתוך צינור מ"ל (להלן נקרא"פלזמה").
- הכן את הפתרון הבא:
- הפרדת תאי דם אדומים של לויקוציטים
- באמצעות הצינורות המכילים כדוריות דם אדומות (RBCs) משלב 2.1.3., לשלב את RBCs לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (5 דם אוסף שפופרת תוכן למחזור 50 מ ל).
- הוסף את NaCl 0.9% עד לנפח הכללי מגיע 44 מ. להוסיף 6 מ של לתוספי 6% (האחרונה).
- מערבבים בעדינות את תערובת דם/לתוספי על-ידי היפוך הצינור 10 - 20 פעמים. תן המשקע צינור במשך לפחות 30 דקות.
- בזמן שקיעת מתרחש, להכין מעבר צבע Percoll על-ידי הוספת 4.2 מ של Percoll פתרון 5.8 מ ל פלסמה צינור חרוטי 15 מ"ל ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית.
- לאסוף את השבר העליונים של לתוספי אמנם מנסה למנוע pipetting כדוריות דם אדומות.
- להדק את הבורג כובע, להסיר את הצינור לתוספי תא אנאוקסיים, centrifuge את הצינור ב- 300 גרם x 10 דקות עם הפסקות.
- בזהירות למקם את הצינור בחזרה אל החדר אנאוקסיים מבלי להפריע את התאים pelleted, ולהסיר את הנוזל דרך pipetting.
- בעדינות מחדש להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של פלסמה ולהוסיף לאט מאוד לחלק העליון של הפתרון Percoll. יש להיזהר לא לגרום ערבוב השכבות כאשר pipetting את התאים למעלה.
- הסר בזהירות את הצינור פתרון Percoll מן אנאוקסיים קאמרית (הימנעות ערבוב), והוא צנטריפוגה ב 800 x g במשך 20 דקות בלי הפסקות. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) יישאר על פני הפתרון Percoll, נויטרופילים גלולה עם RBCs.
- הסרת מזהמים RBCs
- להכין 14 מ"ל לרחוץ את בופר על-ידי הוספת 700 μL PBS + 10% BSA 14 מ"ל לרחוץ את המאגר.
- מקם את הצינור פתרון Percoll בחזרה אל החדר אנאוקסיים. להסיר את Percoll ואת PBMCs ויה pipetting והשהה מחדש את התאים pelleted 1 מ"ל לרחוץ את בופר. בגדר להיות מושעה מחדש יהיה צבע אדום בשל RBCs משחיתה.
- להוסיף 200 μL של אנטי-CD235a (glycophorin) beads מגנטי על התאים מחדש על תנאי, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של מינימום של 15 דקות. שלב זה טוען את RBCs מזהמים עם חרוזים מגנטי כך שניתן להסירם.
- שטיפת העמודה ההפרדה עם 2 מ של כביסה מאגר 3 x.
- בעוד אתה מחזיק צינור חרוטי 15 מ"ל תחת העמודה ההפרדה, pipette לאט לאט את התערובת נויטרופילים/RBC לחלק העליון של העמודה. לאסוף את התאים בצינור חרוט 15 מ"ל כפי שהם זרימה דרך. הזרימה דרך צריך להיות מעונן ולאבד את הצבע האדום בשל RBCs שנותרו מאוגד לעמודה.
- להוסיף 2 מ"ל לרחוץ את מאגר לחלק העליון של העמודה ולאסוף בצינור חרוט באותה 15 מ"ל. בסוף לשטוף את 2 מ"ל, הזרימה דרך צריך להיות ברור, המסמלת את כל נויטרופילים שנאסף.
- מערבבים בעדינות את הצינור כדי להבטיח הפצה אפילו של נויטרופילים ולאסוף μL 10 לספירת תאים. שימו לב הכרך האחרון עבור תא ספירת למטרות. למנות את המספר הכולל של תאים עם תא סטנדרטי כלשהו לספור בשיטה.
- הסר את הצינור נויטרופילים תא אנאוקסיים, centrifuge נויטרופילים ב g x 300 כעשרים דקות עם הפסקות.
- במקום נויטרופילים sedimented בחזרה אל החדר אנאוקסיים ולהסיר את המאגר כביסה דרך pipetting. מחדש להשעות בגדר נויטרופילים בפלסמה עם צפיפות התאים המרבי של 107 נויטרופיל/mL.
- ספירת נויטרופילים מטוהרים והדמיה באמצעות MUB40
- להוסיף 1 μL של רי-MUB40-Cy5 (1 מ"ג/מ"ל) 1 מ ל Rosewell פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני ללא פנול אדום. מערבבים על-ידי pipetting טוב.
- למטרות של פרוטוקול זה, התוצאה יש כבר המתוארים כאילו נויטרופילים חזק הפעלת ריאגנט, N-formylmethionyl-leucyl-פנילאלנין (FMLP), הוא הוסיף. להוסיף 1 μm של FMLP RPMI/רי-MUB40-Cy5 צינור מיקס ויה pipetting למעלה ולמטה.
הערה: כל הליך ניסיוני יהיה שונה מנקודה זו ואילך, בהתאם לשאלות נותרים ללא מענה. - העברה של 1 מ ל RPMI/רי-MUB40-Cy5/FMLP תערובת על צלחת זכוכית מיקרוסקופ התחתון. את המאכל הזה, להוסיף נפח של מטוהרים תאים המתאימים 106 סה כ נויטרופילים. מערבבים על ידי בעדינות pipetting.
- למקם את המנה במיקרוסקופ פלורסנט הפוכה ולהתחיל ייבוא תמונות. לדוגמה, מומלץ לרכוש תמונות בסיסית לפני התוספת של נויטרופילים-הפעלת ריאגנט כגון FMLP או חיידקים. בדוגמה זו, הפעל את רכישת RPMI/רי-MUB40-Cy5/נויטרופילים, ו- timepoint מאוחר יותר, pipette הכימית נויטרופילים-הפעלת לתוך קערה מזכוכית ולהמשיך ייבוא תמונות.
הערה: השינויים שביצעת את השלבים הבאים ניתן לבצע בהתבסס על צרכי מדעי. - תהליך רכש תמונות/זמן-lapse סרטים כמו מתייחס המיקרוסקופ ספציפי משמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות של MUB40-רקמות מוכתם משקופיות histopathology בדרך כלל לחשוף תאים בודדים פזורים ברחבי הרקמה. MUB40 כתמי לקטופרין, שהוא נוכח בגרגרים נויטרופילים ממודר. לכן, בדרך כלל ראיתי להכתים punctate או במספר תחומים נפרדים גדולים של האות מגיעים בודדים נויטרופילים (איור 1). זה עוזר להוספת סמן התא השני כגון דאפי לעזור לשפה משותפת האות40 MUB עם התא מוכתם. המספר הכולל של תאים שזוהו תלוי המספר של נויטרופילים נוכח שדה הראיה ואת יכול להשתנות בהתאם באופן דרמטי מקור והעוצמה של התגובה החיסונית. המוצגות כאן הן תמונות נציג מטוהרים נויטרופילים האנושי קבוע (איור 1א') ומן ביופסיה רקמות של חולים קוליטיס (איור 1B). גם הראו תמונות לקוחים מתוך רמה נמוכה יחסית של נויטרופילים של הריאות של עכברים נגועים קלבסיאלה pneumoniae (איור 1C), רמה גבוהה של נויטרופילים במעי הגס של שפן נגוע שיגלה sonnei (איור 1D).
תוצאות באמצעות נויטרופילים לחיות, מטוהרים בדרך כלל להראות תא-קטן-לא מכתים בנקודות זמן מוקדם, בהדרגה להגביר את רי-MUB40 מכתים לאורך זמן כמו נויטרופילים יותר להיות מופעל. המוצגת כאן היא סדרה כמובן זמן של תמונות מתוך ניסוי בעזרת מטוהרים נויטרופילים האנושית נגוע פלורסנט ס' sonnei (איור 2). בהתאם לעוצמת האות הפעלת, נויטרופילים יכול להתחיל מכתים עם MUB40 במהירות, אז מומלץ לרכוש תמונות לפני התוספת של מפעילים. כאשר התאים להיות מופעל, רי-MUB40 חיובי, הם צריכים להפגין פרופיל מכתימים דומה לזה של תאים קבוע ו- permeabilized, אשר נותן punctate מכתים. ריכוז אופטימלי של MUB40 עבור צביעת תא קבוע וחיים שני הוא 1 μg/mL (איור 3). להוריד את ריכוז (0.1-0.01 μg/mL) יכולים לשמש אבל התוצאה עוצמת אות נמוכה יותר. מומלץ גם להשתמש תמונת DIC או כתם לחיות תאים אחרים כדי להבדיל בין התאים אתה מציג אות רי-MUB40 .
איור 1 : MUB 40 -צבעונית נויטרופילים של האדם, העכבר ולמקור שפן. (א) MUB נציג40 מכתים (ירוק) של נויטרופילים מטוהרים מתורמים אדם בריא. גרעין התא מוכתמים דאפי (כחול). Staining (B) של נויטרופילים אנושי בתוך הרקמה של ביופסיית קוליטיס כיבית. נויטרופילים מתגלים עם MUB40 (ירוק), גרעין התא מוכתמים דאפי (כחול). (ג) Histopathology החל הריאות של עכבר נגוע pneumoniae קלבסיאלה. העכבר נויטרופילים מתגלים בתוך הרקמה באמצעות MUB40 (ירוק), גרעין התא מוכתמים דאפי (כחול). (ד) histopathology של המעי הגס של שפן נגוע שיגלה sonnei. נויטרופילים להגיב הזיהום מתגלים ברקמה עם MUB40 (ירוק). S. sonnei חיידקים (אדום) מבטאים את החלבון הניאון dsRED. גרעין התא מוכתמים דאפי (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : כתם נויטרופילים לחיות עם MUB 40 רק כאשר הופעל- נבחרת תמונות מתוך סדרה לשגות בפעם מעורבים מטוהרים נויטרופילים האנושית נגוע sonnei ס בנוכחות רי-MUB40. הראשון קבוצת תמונות (למעלה) נויטרופילים מפגשים חיידק ס sonnei (אדום) מוצגים עם חץ ירוק. במרוצת הזמן, החיידק על ידי נויטרופילים, מתעכל. כמו נויטרופילים הופך לפעיל מן החיידקים, זה כתמים למחמיר יותר חזק עם RI-MUB40. תמונות בצד השמאל הם ערוצי פלורסנט בשכבות עם תמונות DIC. תמונות מימין הן פלורסנט ערוצים בלבד. התמונות צולמו במרווחים של 5-מין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : השפעת MUB שונה 40 ריכוזי על צביעת נויטרופילים. צביעת נציג של נויטרופילים קבוע/permeabilized עם ריכוזים שונים של MUB40-Cy5. נויטרופילים האנושי מטוהרים היו קבועים, מוכתם הריכוזים המצוין של MUB40-Cy5. גרעין התא מוכתמים דאפי (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. הנה, שני מבחני מתוארים שבו משמש של פפטיד40 MUB ללמוד דלקת נויטרופילים והפעלה. אנו מראים איך MUB40 יכול לחשוף נויטרופילים להציג בסעיפים histopathology או להציג מצב ההפעלה שלהם באמצעות נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. לשלבים הקריטיים עבור שימוש MUB40 ריאגנט מוכתמים הם בדיוק כמו עם כל שיטה לזיהוי פלורסנט אחרת. יש לנקוט כדי להבטיח תאימות של אותות פלואורסצנט כביסה נאותה צעדים ננקטו כדי להסיר רקע מכתים. השיקולים החשובים ביותר כדי להשיג תוצאות טובות מוכתמים הם האיכות של המיקרוסקופ, זכוכית שקופיות/שער גולשת הסעיפים רקמות. בעת הצגת נויטרופילים מטוהרים בשידור חי, הם הצעדים החשובים ביותר בתהליך טיהור עצמה. נויטרופילים רגישים והוא יכול להיות מופעל על ידי מספר אותות שונים. על מנת להבטיח כי הניסוי מייצרת תוצאות משמעותיות, חייבים להקפיד לשמור את מטוהרים נויטרופילים לא פעילים עד שהם יהיו מוכנים לשמש. זו יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע פרוטוקול טיהור נויטרופילים ב תא אנאוקסיים להגביל את החשיפה נויטרופילים לחמצן.
הגבלה והן יתרון של MUB40, בהתאם השאלה ניסיוני נותרים ללא מענה, הוא MUB40 רק כתמים מופעל נויטרופילים, אלא אם כן הם איכשהו הם permeabilized. זה יכול להיות יתרון עצום אם הניסוי דורש דלקת הבאים החי או התא מטוהר, אבל זה יכול להיות חיסרון אם הניסוי מחייבת זיהוי של כל נויטרופילים לחיות ללא תלות במצב הפעלה. מגבלה פוטנציאליים השני פרוטוקול זה היא העובדה לקטופרין הזה קיים הפרשות גופניים שונים כגון דמעות, חלב, ריר. עבור histopathology מכתים שבו הפרשות אלה נשמרות (למשל שטיפת המעי הגס ביופסיות בהן שכבת הריר הוא שלם), MUB40 אכתים גם את שכבת הריר יחד עם כל נויטרופילים הנוכחי. בפועל, זה טרם להשפיע על הניתוח שלנו, אבל יש לציין כמקור אות פוטנציאליים.
כיום, MUB40 הוא סמן רק נויטרופילים יכול להבדיל בין מופעל, שלא הופעל נויטרופילים בשידור חי. כמו כן, MUB40, שלא כמו שיטות זיהוי נוגדנים, לא מופיע כדי לשנות את הפונקציה או הישרדות של נויטרופילים ב חוץ גופית או ויוו. לדוגמה, תוספת של נוגדנים ספציפיים נגד נויטרופילים בשידור חי יכול להיות אות הפעלת להשפיע על תפקוד נויטרופילים או הישרדות במארח. זה הופך MUB40 ריאגנט מאוד שימושי למחקר הכוללים נויטרופילים הפעלה או גרגר שחרור בתוך חוץ גופית או ויוו. בנוסף, MUB40 יש מגוון ירידה לפרטים המארחת רחב והוא יכול להיות מצומדת ישירות למספר של fluorophores שונים, מתן אפשרות לשימוש במבחני מכתימים צעד אחר צעד מעבר מארחים מרובים. לפיכך, MUB40 מכתים משולה בין עכבר, אנושי, ואת מטרות יונקים אחרים, וזה מפשט מפחיתה את מספר נוגדנים הדרושים כדי לזהות נויטרופילים.
בעוד פרוטוקול זה מתמקד במיוחד histopathology ודימות תא בשידור חי באמצעות MUB40, אנו משתמשים גם בהצלחה את פפטיד במיון FACS, לחיות חיים ויוו הדמיה. אנו צופים כי MUB40 יהיה לבצע מבחני שונים רבים המערבים את הגילוי של נויטרופילים או הפריט החזותי של אירועים דלקתיים בגוף, כי מחקרים עתידיים ופרוטוקולים יתפתחו כדי יתרון נוסף את הספקטרום של MUB שימושים 40 , בעיקר באמצעות טכניקה הדמיה לא פולשנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.S.M. מופיע בתור ממציא על MUB40 פטנטים:
MUB40: EP11290403.2 הפטנטים האירופית, 09/09/2011.
רי-MUB40: אירופה EP פטנט מס ' 17306746.3, 11/12/17.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Fugain. לורט (אם-2015-15) (B.S.M.) Fondation ומענקים ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
