Summary
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la presenza di neutrofili in sezioni di istologia fisso/permeabilizzate e valutare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati dal vivo. In particolare, il peptide di40 MUB associa la lattoferrina presente nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. L'esposizione del contenuto granello tramite permeabilizzazione o l'attivazione del neutrofilo permette per la marcatura dei neutrofili.
Abstract
Qui, forniamo un protocollo che prevedono l'uso di MUB40, un peptide sintetizzato con la capacità di legare la lattoferrina glicosilata memorizzata ad alte concentrazioni nei granuli specifici e terziari dei neutrofili. Dettagli di questo protocollo come MUB40 coniugato direttamente a un fluoroforo possono essere utilizzato a macchiare i neutrofili in fissa/permeabilizzate tessuti pure come questo possa essere utilizzato in cellule vive di imaging analizzare per-granulazione e attivazione dei neutrofili. Metodi di rilevazione dei neutrofili sono limitati a specie-specifici anticorpi monoclonali, che non sono sempre adatti per determinate applicazioni. MUB40 non penetrare la membrana cellulare e quindi è escluso dalla lattoferrina memorizzata nei neutrofili non-attivato/non-permeabilized. MUB40 ha il beneficio aggiunto di riconoscere lattoferrina da una gamma vasta host, che lo rende particolarmente utile per confrontare i risultati di studi condotti su diversi modelli di ricerca, riducendo il numero di duplicati reagenti e semplificando i protocolli attraverso passo singolo di colorazione.
Introduction
I neutrofili sono una delle armi primarie del sistema immunitario innato e ordinariamente sono reclutati ai siti di infiammazione intorno al corpo. Lo studio dei neutrofili è stato in gran parte alterato dalla loro durata di vita breve in vitro (meno di 8 h) e dagli strumenti di rilevazione limitata in condizioni basali o dopo l'attivazione. Qui, presentiamo un protocollo ben collaudato per la rilevazione di ampio e specifico dei mammiferi neutrofili nei campioni fissati/permeabilizzate. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la macchiatura diretta neutrofili con MUB40. Utilizzando il protocollo di colorazione del neutrofilo dal vivo, la tempistica e la posizione dell'attivazione dei neutrofili può essere individuati. Questo protocollo è ideale per i ricercatori che desiderano studiare il rilascio dei neutrofili di attivazione o granello. Di là di loro funzioni antimicrobiche, neutrofili sono ora apprezzati come immunomodulatori cellule coinvolte in una vasta gamma di malattie e le risposte immunitarie (innato e adattivo)1,2. I neutrofili sono presenti in tessuti più infiammatori, agli alti numeri nei tessuti infetti, i tumori infiammatori3, durante IBS e di Crohn flare-up4e nelle aree di infiammazione non infettiva quali synovia di artrite reumatoide ( RA) pazienti5. Neutrofili contengono quattro classi di granuli preformati denominato azurophil (α), specifiche (β1), granuli di terziario (β2) e vescicole secretorie (γ)6. Durante la migrazione di un sito infiammatorio, reclutati neutrofili attivati e in sequenza secernono contenuto granello (composto da molecole di immunomodulatori, di adesione e di composti antimicrobici), che promuove ulteriormente reclutamento e contribuisce alla infezione ad alta risoluzione (ma anche a danno di tessuto host)7. Mentre i neutrofili sono considerati un aspetto critico dell'immunità innata, ad oggi vi sono alcuni reagenti di rilevamento disponibili per studiarli, e ancor meno che può essere utilizzato per valutare lo stato di attivazione dei neutrofili vivente.
Attuali metodi di rilevazione dei neutrofili si basano su anticorpi monoclonali generati contro gli antigeni esposti cellula-superficie, ad esempio Ly - 6 G2 o proteine in particolare memorizzati in granuli neutrofili in condizioni basali (ad es., mieloperossidasi lattoferrina). Anticorpi monoclonali vantaggi loro forte legame, sensibilità e versatilità in diverse condizioni di dosaggio. Tuttavia, ci sono diversi aspetti negativi all'utilizzo di anticorpi monoclonali e anti-Ly - 6G in particolare. Questi aspetti negativi includono la specificità, come Ly - 6G è presente sulla maggior parte delle cellule mieloidi nel midollo osseo e su tutti i granulociti compresi gli eosinofilo; decifrare i neutrofili da eosinofilo con questo marcatore richiede pertanto più complessi si avvicina a8. Un altro frequente compromesso con gli anticorpi monoclonali è il loro range di specificità spesso limitata host, rendendo difficili gli studi di confronto con più di una specie animale. Un terzo inconveniente di metodi di rilevazione dell'anticorpo, specialmente quando si utilizzano celle in tensione o in vivo, è il loro potenziale per disturbare la funzione delle cellule o portare alla attivazione delle cellule. Ad esempio, la somministrazione di anti-Ly - 6g ai topi è comunemente applicata allo svuotamento del neutrofilo e neutropenia transitoria9. Inoltre è stato dimostrato che l'iniezione di anticorpi può stimolare funzione antitumorale del neutrofilo10. Infine, rilevazione dell'anticorpo dei neutrofili non rivela lo stato di attivazione della cellula.
Abbiamo identificato un peptide di 40 aminoacidi chiamato MUB40, che può essere utilizzato in un certo numero di saggi per etichettare i neutrofili in condizioni in vitro o in vivo , nonché di analizzare lo stato di attivazione dei neutrofili live11. MUB40 è derivato da MUB7012, un dominio della superficie Lactobacillus reuteri muco-binding protein originariamente descritto per la sua capacità di legare il muco13,14. MUB40 interagisce con lattoferrina glicosilata che è presente in alte concentrazioni nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. MUB40 possono essere esposti a questi granuli attraverso passi di permeabilizzazione standard presenti in istopatologia o fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento protocolli (FACS) per la macchiatura robusta dei neutrofili fissi. Quando i neutrofili dal vivo sono tenuti in uno stato inattivato, il peptide di40 MUB è escluso dal contenuto del granello, e cellule non macchia positive con il marcatore. Al momento dell'attivazione, MUB40 possono associare alla lattoferrina esposta e portare a macchiatura robusta con il peptide. Così, MUB40 può essere utilizzato per determinare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati, che lo rende un marcatore attraente di seguire il processo contagioso. La capacità di legarsi a vivere neutrofili attivati consente inoltre MUB40 essere utilizzato come uno strumento per rilevare le aree di infiammazione del neutrofilo nei modelli animali dal vivo (ad esempio, un mouse artrite modello15). I protocolli in questo dettaglio del manoscritto come fluorescente etichettati MUB40 utilizzabile per rivelare i neutrofili in istologia tessuti e come analizzare l'attivazione dei neutrofili purificati dal vivo in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati esaminati e approvati dalle organizzazioni francese Zinebsbai (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) e CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).
1. colorazione fluorescente neutrofili nel tessuto di istopatologia con etichettati MUB40
- Per ottenere il tessuto per l'istopatologia, Difficoltà sezioni di biopsia del tessuto in un volume adeguato di paraformaldeide al 4% (PFA) per 30 min fino a 4 ore a seconda dello spessore del campione. Posizionare i campioni in frigorifero a 4 ° C durante la fissazione.
Nota: Fissazione alternativi metodi/temporizzazione può essere sostituiti basata su esigenze specifiche dell'utente.- Rimuovere il PFA, aggiungere 16% soluzione di saccarosio con volume sufficiente a coprire completamente il campione e il campione viene posto a 4 ° C per 4 ore fino a notte.
- Rimuovere la soluzione di saccarosio al 16% e aggiungere soluzione di saccarosio al 30% a un volume abbastanza grande da coprire completamente il campione e posizionarlo a 4 ° C per 4 ore fino a notte.
- Rimuovere la soluzione di saccarosio 30% e asciugare fuori della soluzione in eccesso dal tessuto con un tovagliolo di carta. Posizionare la parte di tessuto a media temperatura (OCT) di taglio ottimale e snap-freeze in 2-metilbutano raffreddata in un bagno di ghiaccio secco-etanolo (-72 ° C). Una volta congelato solido (dopo ~ 2 min), rimuovere i blocchi da 2-metilbutano e metterli su ghiaccio secco fino a quando tutti i blocchi sono finiti e pronti per l'archiviazione a lungo termine. Memorizzare i blocchi congelati a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
- La notte prima di blocchi di tessuto devono essere tagliati, rimuoverli dal congelatore-80 ° C e metterli a-20 ° C durante la notte per equilibrare.
- Utilizzando un criostato, tagliare tessuto OCT-incastonato in 10 - 30 μm di spessore fette e adsorbire per lastre di vetro di alta qualità.
Nota: Più spessi o più sottili fette possono essere utilizzati a seconda delle esigenze sperimentali. - Con una penna di cera o altro metodo idrofobo, disegnare una casella intorno alla fetta di tessuto su vetrino e lasciare asciugare.
- Preparare la soluzione colorante eseguendo una diluizione di 1:1,000 di MUB40-Cy5 (o altra versione di40MUB fluorescente, soluzione madre 1 mg/mL) in soluzione di saponina-PBS 0.1%. La concentrazione di40 MUB finale ottimale dovrebbe essere 1 μg/mL.
Nota: Le concentrazioni più basse di finale possono essere utilizzate (0.1-0.01 μg/mL), ma può condurre per abbassare l'intensità del segnale.
Attenzione: La polvere di saponina può causare irritazione di respirazione. Assicurati di pesare saponina in una zona protetta o del gabinetto. Permeabilizzazione alternativi metodi possono essere utilizzati come Tritone. Aggiungere ulteriori indicatori alle concentrazioni consigliate dal produttore (ad es., 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, anticorpi fluorescenti). - Delicatamente immergere il vetrino in una soluzione di saponina-PBS + 0.1% tre volte.
- Accuratamente asciugare il liquido in eccesso lontano intorno alla sezione di tessuto e aggiungere sufficiente soluzione colorante per coprire completamente la sezione del tessuto. Porre il vetrino in una camera umida per evitare l'evaporazione e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Tenerlo al riparo dalla luce.
- Immergere delicatamente il vetrino nella soluzione di saponina-PBS 0.1% 3 x. Quindi, immergete delicatamente il vetrino nella soluzione PBS 3 x. Infine, immergere delicatamente il vetrino in acqua distillata H2O 3 volte. Asciugare accuratamente il liquido in eccesso dalla diapositiva.
- Aggiungere una piccola quantità (~ 20 μL) di mezzo di montaggio (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5% N-propyl gallate, 90% glicerolo) accanto la fetta di tessuto e si sdraiò delicatamente un vetrino coprioggetti sopra il vetrino. Delicatamente e uniformemente premere il coprioggetto sulla sezione del tessuto e, utilizzando un tovagliolo di carta, rimuovere con cura qualsiasi mezzi di montaggio che estrude intorno ai bordi del coprivetrino.
- Porre il vetrino montato in un armadio scuro per 24 h per consentire il supporto di montaggio a solidificare. In alternativa, è possibile porre il vetrino montato a 37 ° C per 1 h.
- Utilizzando un criostato, tagliare tessuto OCT-incastonato in 10 - 30 μm di spessore fette e adsorbire per lastre di vetro di alta qualità.
- Le fette di tessuto su un microscopio a fluorescenza secondo il metodo di acquisizione desiderata dell'immagine.
2. visualizzazione dell'attivazione dei neutrofili con Retro-Inverso-MUB40-Cy5 Peptide
- Ottenere neutrofili umani utilizzando il seguente protocollo. Preparare le seguenti soluzioni e metterli in una notte di governo anossica. L'esposizione all'ossigeno inizierà attivare neutrofili e ulteriormente indurre cellule morte16,17.
Nota: I neutrofili possono essere in alternativa purificati "in panchina" per MUB40-etichettatura esperimenti; Tuttavia, essere consapevoli che l'esposizione all'ossigeno comincerà a influire sull'attivazione dei neutrofili.- Preparare la soluzione seguente:
Soluzione 1 [0,9% di cloruro di sodio (NaCl)]: aggiungere 4,5 g di NaCl a 500 mL di H2O. filtro la soluzione.
Soluzione 2 (destrano 6%): aggiungere 6 g di destrano in soluzione di NaCl 0,9% a 100 mL.
Soluzione 3 (tampone di lavaggio): sciogliere l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS pH 7.2 a una concentrazione finale di EDTA di 2 mM. Immediatamente prima dell'uso, sciogliere albumina di siero bovino (BSA) nella soluzione PBS/EDTA, tale che la concentrazione finale di BSA è 10% w/v. - Centrifugare le provette per prelievo ematico a 650 x g per 20 minuti senza interruzioni.
- Senza interrompere il sangue separati, trasferire i tubi di raccolta del sangue a un frazioni del plasma di armadietto e raccogliere anossico (in alto) in una provetta conica da 50 mL.
- Rimuovere il tubo al plasma contenenti dal governo anossico e centrifugare a 2.900 x g per 20 min con pause per appallottolare le piastrine.
- Senza interrompere le piastrine pellettate, trasferire delicatamente il tubo al plasma nel governo anossico e dispensare il plasma povero di piastrine in una provetta di fresca 50 mL (d'ora in avanti chiamato "plasma").
- Preparare la soluzione seguente:
- Separazione dei globuli rossi dai leucociti
- Usando le provette contenenti i globuli rossi (RBCs) dal punto 2.1.3., combinare i globuli rossi in una provetta conica 50 mL (5 sangue tubo contenuto insieme al tubo da 50 mL).
- Aggiungere NaCl 0,9%, fino a quando il volume totale raggiunge 44 mL. Aggiungere 6 mL di destrano 6% (ultimo).
- Mescolare delicatamente la miscela di sangue/destrano capovolgendo la provetta 10 - 20 volte. Lasciate che il sedimento di tubo per almeno 30 min.
- Mentre avviene la sedimentazione, preparare un gradiente di Percoll aggiungendo 4,2 mL di soluzione di Percoll a 5,8 mL di plasma in una provetta conica da 15 mL e mescolare bene capovolgendo la provetta.
- Raccogliere la frazione superiore del destrano mentre cercava di evitare di pipettaggio globuli rossi.
- Serrare il tappo a vite, rimuovere il tubo di destrano dalla camera anossica e centrifugare la provetta a 300 x g per 10 min con pause.
- Posizionare il tubo indietro nella camera anossica senza disturbare le cellule pellettate e rimuovere il liquido tramite il pipettaggio.
- Delicatamente, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di plasma e aggiungere molto lentamente verso l'alto della soluzione Percoll. Fare attenzione a non indurre miscelazione degli strati quando si pipetta le cellule sulla parte superiore.
- Rimuovere con cautela il tubo di soluzione di Percoll dall'aula anossico (evitando di miscelazione) e centrifuga a 800 x g per 20 minuti senza interruzioni. Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) rimarrà sulla superficie di soluzione di Percoll e neutrofili saranno a pellet con globuli rossi.
- Rimozione di contaminanti RBCs
- Preparare 14 mL di soluzione tampone di lavaggio aggiungendo 700 μL PBS + 10% BSA a 14 mL di tampone di lavaggio.
- Posizionare il tubo di soluzione di Percoll indietro nella camera anossica. Rimuovere il Percoll e PBMCs via pipettaggio e risospendere le cellule pellettate in 1 mL di soluzione tampone di lavaggio. Il pellet di essere ri-sospensione avrà un colore rosso a causa di contaminanti RBCs.
- Aggiungere 200 μL di biglie magnetiche anti-CD235a (glicoforina) alle cellule risospese, mescolare delicatamente e incubare per un minimo di 15 min. Questo passaggio carica il contaminante RBCs con biglie magnetiche in modo che possono essere rimossi.
- Lavare la colonna di separazione con 2 mL di lavaggio tampone x 3.
- Mentre si tiene una provetta conica da 15 mL sotto la colonna di separazione, pipettare lentamente la miscela di neutrofilo/RBC nella parte superiore della colonna. Raccogliere le cellule nel tubo conico da 15 mL come passano attraverso. Il passaggio dovrebbe essere nuvoloso e perdere il suo colore rosso a causa di RBCs restanti associato alla colonna.
- Aggiungere 2 mL di tampone alla parte superiore della colonna di lavaggio e raccogliere nello stesso tubo conico da 15 mL. Entro la fine del lavaggio 2 mL, il flusso continuo dovrebbe essere chiaro, che significa che tutti i neutrofili sono stati raccolti.
- Mescolare delicatamente il tubo per garantire una distribuzione omogenea dei neutrofili e raccogliere 10 μL per conta cellulare. Nota il volume finale per scopi di conteggio delle cellule. Enumerare il numero totale di cellule con qualsiasi cella standard metodo di conteggio.
- Rimuovere il tubo del neutrofilo dalla camera anossica e centrifugare i neutrofili a 300 x g per 20 min con pause.
- Inserire nuovamente i neutrofili sedimentati la camera anossica e rimuovere il tampone di lavaggio tramite il pipettaggio. Risospendere il pellet del neutrofilo nel plasma con una densità massima della cella di 107 PMN/mL.
- Enumerazione dei neutrofili purificati e visualizzazione utilizzando MUB40
- Aggiungere 1 μL di RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) a 1 mL di mezzo di Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 senza rosso fenolo. Mescolare bene il pipettaggio.
- Ai fini del presente protocollo, il risultato è stato delineato come se un potente neutrofilo attivazione reagente, N-formylmethionyl-leucyl-fenilalanina (FMLP), viene aggiunto. Aggiungere 1 μm di FMLP al RPMI/RI-MUB40-Cy5 tubo e mix tramite pipettaggio su e giù.
Nota: Ogni procedura sperimentale sarà diverso da questo punto in avanti, a seconda le questioni affrontate. - Trasferire 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP miscela per un piatto di microscopia di vetro inferiore. Per questo piatto, aggiungere un volume delle cellule purificate, corrispondente a 106 totale neutrofili. Mescolare pipettando delicatamente.
- Mettere la teglia in un microscopio invertito a fluorescenza e avviare l'acquisizione di immagini. Ad esempio, si consiglia di acquisire immagini della linea di base prima dell'aggiunta di un reagente d'attivazione dei neutrofili come FMLP o batteri. In questo esempio, avviare l'acquisizione di RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrofili e ad un determinato timepoint successivo, dispensare il reagente d'attivazione dei neutrofili nel piatto di vetro e continuare l'acquisizione di immagini.
Nota: Le modifiche a queste procedure possono essere fatta base su esigenze scientifiche. - Processo acquisito immagini/time-lapse film come riguarda il microscopio specifico utilizzato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Risultati di MUB40-tessuti macchiati da diapositive di istopatologia tipicamente rivelano cellule singole sparse in tutto il tessuto. MUB40 macchie lattoferrina, che è presente in granuli neutrofili e compartimenti stagni. Così, in genere visto punctate macchiatura o diverse grandi aree separate del segnale proviene da singoli neutrofili (Figura 1). È utile aggiungere un secondo indicatore di cella come DAPI per aiutare co-localizzano il segnale40 MUB con la cella macchiato. Il numero totale di cellule rilevate varia a seconda del numero di neutrofili presenti nel campo visivo e può variare notevolmente in base la fonte e la forza della risposta immunitaria. Immagini rappresentative dai neutrofili umani fissi purificati (Figura 1A) e da una biopsia del tessuto di un paziente di colite ulcerosa (Figura 1B), sono indicate qui. Anche mostrato sono immagini scattate da un livello relativamente basso di neutrofili nei polmoni dei topi infettati con i pneumoniae della Klebsiella (Figura 1,C) e un elevato livello di neutrofili nel colon di un porcellino d'India infettati con Shigella sonnei (Figura 1,D).
Risultati utilizzando live, purificati neutrofili indicano generalmente colorazione in primi momenti poco-a-no cellulare e aumentano gradualmente in RI-MUB40 colorazione nel tempo come più neutrofili attivati. Qui è illustrata una serie di corsi di tempo delle immagini da un esperimento utilizzando purificati neutrofili umani infettati con fluorescente Shigella sonnei (Figura 2). A seconda della forza del segnale attiva, neutrofili possono iniziare macchiatura con MUB40 rapidamente, quindi è consigliato per avviare l'acquisizione delle immagini prima dell'aggiunta di attivatori. Quando le cellule sono attivate e RI-MUB40 positivo, si dovrebbe esibire un profilo di colorazione simile a quella delle cellule fisse e permeabilized, che danno una colorazione punctate. La concentrazione ottimale di MUB40 per entrambi cella dal vivo e fissa la colorazione è di 1 μg/mL (Figura 3). Le concentrazioni più basse (0,1-0,01 μg/mL) può essere utilizzato ma risultato a bassa intensità di segnale. È inoltre consigliabile utilizzare un'immagine DIC o altra macchia di cellule vive per differenziare le celle che vengono visualizzati da un segnale di40 RI-MUB.
Figura 1 : MUB 40 -macchiato neutrofili dell'essere umano, del mouse e cavia origine. (A) rappresentante MUB40 colorazione (verde) dei neutrofili purificati da donatori umani in buona saluti. Nuclei delle cellule sono macchiati con DAPI (blu). (B) colorazione dei neutrofili umani nel tessuto da una biopsia di colite ulcerosa. I neutrofili sono rivelati con MUB40 (verde) e nuclei delle cellule sono macchiati con DAPI (blu). (C) l'istopatologia dal polmone di un mouse infettato con i pneumoniae della Klebsiella. Neutrofili del mouse vengono rivelati nel tessuto utilizzando MUB40 (verde) e nuclei delle cellule sono macchiati con DAPI (blu). (D) l'istopatologia dal colon di un porcellino d'India infettato da Shigella sonnei. Neutrofili risponde all'infezione sono rivelati nel tessuto con MUB40 (verde). S. sonnei batteri (rosso) esprimono la proteina fluorescente dsRED. Nuclei delle cellule sono macchiati con DAPI (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Live neutrofili macchia con MUB 40 solo quando attivato. Immagini selezionate da una serie di lasso di tempo che coinvolgono i neutrofili umani purificati infettati da Shigella sonnei in presenza di RI-MUB40. Nel primo set di immagini (in alto) un neutrofilo incontra un batterio Shigella sonnei (rosso), indicato con una freccia verde. Nel corso del tempo, il batterio è interiorizzato dai neutrofili e digerito. Come i neutrofili viene attivato dai batteri, macchie progressivamente più forte con RI-MUB40. Immagini a sinistra sono fluorescenti canali sovrapposti con immagini DIC. Immagini sulla destra sono solo canali fluorescenti. Immagini sono state scattate a intervalli di 5 min. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Effetto di diversi MUB 40 concentrazioni sulla macchiatura del neutrofilo. Rappresentante la macchiatura dei neutrofili fisso/permeabilizzate con varie concentrazioni di MUB40-Cy5. Neutrofili umani purificati erano fissi e macchiati con le concentrazioni indicate di MUB40-Cy5. Nuclei delle cellule sono macchiati con DAPI (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui, due analisi sono descritti in cui il peptide di40 MUB è usato per studiare l'attivazione e l'infiammazione del neutrofilo. Vi mostriamo come MUB40 può rivelare neutrofili presentano nelle sezioni di istopatologia o mostrano il loro stato di attivazione utilizzando neutrofili purificati dal vivo. I passaggi critici per l'utilizzo di MUB40 come reagente di colorazione sono lo stesso come con qualsiasi altro metodo di rilevazione fluorescente. Cura deve essere presa per assicurare la compatibilità dei segnali fluorescenti e che sono state prese misure adeguate per la pulizia per rimuovere una colorazione di fondo. Le considerazioni più importanti per ottenere buoni risultati di colorazione sono la qualità del microscopio, vetro diapositive/vetrini coprioggetto e le sezioni di tessuto. Quando si visualizzano i neutrofili purificati dal vivo, i passi più importanti sono nel processo di purificazione. I neutrofili sono sensibili e possono essere attivati da un numero di segnali diversi. Al fine di garantire che l'esperimento produce risultati significativi, si deve prestare attenzione mantenere i neutrofili purificati inattivo fino a quando non sono pronti per essere utilizzati. Questo può essere ottenuto eseguendo il protocollo di purificazione del neutrofilo in un'aula anossico per limitare l'esposizione del neutrofilo all'ossigeno.
Vantaggio di MUB40, dipendendo la questione sperimentale affrontata sia una limitazione è che MUB40 sola macchie attivato neutrofili a meno che essi sono in qualche modo permeabilizzate. Questo può essere un enorme vantaggio se l'esperimento chiama per seguente infiammazione in un animale vivo o cellula purificata, ma può essere uno svantaggio se l'esperimento richiede il rilevamento di tutti i neutrofili dal vivo indipendentemente dallo stato di attivazione. Una seconda limitazione potenziale al presente protocollo è il fatto che la lattoferrina è presente in varie secrezioni corporee come lacrime, latte e muco. Per l'istopatologia di colorazione in cui queste secrezioni sono mantenute (ad es., le biopsie coliche in cui lo strato di muco è intatto), MUB40 macchierà anche lo strato di muco insieme a qualsiasi neutrofili presenti. In pratica, questo deve ancora influenzare la nostra analisi, ma va notato come una potenziale fonte di segnale.
Attualmente, MUB40 è il biomarcatore solo del neutrofilo che possa differenziarsi fra neutrofili dal vivo attivati e non attivato. Inoltre, MUB40, a differenza dei metodi di rilevazione dell'anticorpo, non sembra alterare la funzione o la sopravvivenza dei neutrofili in vitro o in vivo. Ad esempio, aggiunta di anticorpi specifici contro i neutrofili dal vivo può essere un segnale di attivazione che interessano la funzione del neutrofilo o sopravvivenza nell'ospite. Questo rende MUB40 un reagente molto utile per la ricerca che coinvolge del neutrofilo attivazione o granello di rilascio in vitro o in vivo. Inoltre, MUB40 ha un'ampia gamma di specificità e possono essere direttamente coniugato di un numero di diversi fluorofori, consentendo un utilizzo in unico passaggio colorazione saggi tra più host. Così, MUB40 macchiatura è paragonabile tra mouse, umano, e altri mammiferi ed è semplifica e riduce il numero dei reagenti necessari per rilevare i neutrofili.
Mentre questo protocollo si focalizza specificatamente sull'istopatologia e live cell imaging utilizzando MUB40, abbiamo con successo anche usato il peptide in FACS ordinamento e vivono animali in vivo imaging. Anticipiamo che MUB40 saranno suscettibili di molti diversi saggi che coinvolgono l'individuazione dei neutrofili o visualizzazione di eventi infiammatori nel corpo, e che gli studi futuri e protocolli saranno sviluppati per ulteriore leva lo spettro di MUB 40 usi, in particolare utilizzando tecniche di imaging non invasivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.S.M. è elencato come MUB40 brevetti:
MUB40: EP11290403.2 di brevetto europeo, 09/09/2011.
RI-MUB40: n ° brevetto europeo EP 17306746.3, 12/11/17.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) e ANR JCJC concede (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
