Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka förekomsten av neutrofiler i fasta/permeabilized histologi sektioner och bedöma aktivering av levande renat neutrofiler. I synnerhet binder SNAJDARN240 peptiden Laktoferrin närvarande i neutrofiler-specifika och tertiär granulat. Exponering av granule innehållet antingen genom permeabilisering eller neutrofil aktivering möjliggör märkning av neutrofiler.
Abstract
Här, tillhandahåller vi ett protokoll som inbegriper användning av SNAJDARN240, en syntetiserade peptid med förmågan att binda glykosylerat Laktoferrin lagras vid höga koncentrationer i specifika och tertiär granulat av neutrofiler. Detta protokolldetaljer hur SNAJDARN240 konjugerat direkt till en fluorophore kan användas för att färga neutrofiler i fasta/permeabilized vävnader samt hur detta kan användas i live-cell imaging till assay för neutrofil aktivering och avinstallation granulering. Neutrofila detekteringsmetoderna är begränsad till artspecifika monoklonala antikroppar, som inte alltid är lämpliga för vissa applikationer. SNAJDARN240 tränger inte cellmembranet och är därmed undantagna från Laktoferrin lagras i icke-aktiverad/icke-permeabilized neutrofiler. SNAJDARN240 har fördelen av att erkänna Laktoferrin från ett brett spektrum, vilket gör det särskilt användbart för att jämföra resultaten i studier med flera forskningsmodeller, att minska antalet duplicerade reagenser och förenkla protokoll genom steg färgning.
Introduction
Neutrofiler är en av de primära vapen av det medfödda immunsystemet och rekryteras rutinmässigt till platser i inflammation runt kroppen. Studien av neutrofilerna har varit i hög grad nedsatt genom sin korta livslängd i vitro (mindre än 8 h) och begränsad identifieringsverktyg under basala förhållanden eller efter aktiveringen. Här presenterar vi en väl testad protokoll för den breda och specifikt påvisande av däggdjur neutrofiler i fasta/permeabilized prover. Vi ger också ett detaljerat protokoll för färgning levande neutrofiler med SNAJDARN240. Genom att använda protokollet för levande neutrofila färgning, kan tidpunkten och platsen för neutrofil aktivering vara identifierat. Detta protokoll är idealisk för forskare som vill studera neutrofil aktivering eller granule release. Bortom deras antimikrobiella funktioner uppskattas nu neutrofiler som immunmodulerande celler involverade i ett stort antal sjukdomar och immunsvar (medfödd och adaptiv)1,2. Neutrofiler är närvarande i den inflammatoriska vävnader, på kicken numrerar i infekterade vävnader, i inflammatoriska tumörer3, under IBS och Crohns flare-ups4, och i områden av icke-infektiös inflammation såsom synovia av reumatoid artrit ( RA) patienter5. Neutrofiler innehåller fyra klasser redan bildade granulat heter azurophil (α), specifika (β1), tertiär (β2) granulat och sekretoriska vesiklar (γ)6. Vid migrering till en inflammatorisk webbplats, rekryteras neutrofiler aktiveras och utsöndrar sekventiellt granule tillfredsställer (bestående av vidhäftning, antimikrobiella föreningar och immunmodulerande molekyler), som främjar ytterligare rekrytering och bidrar till infektion resolution (men även till värd vävnadsskada)7. Medan neutrofiler anses vara en viktig aspekt av den medfödda immuniteten, hittills det är några upptäckt reagenser tillgängliga att studera dem, och ännu färre som kan användas för att bedöma tillståndet aktivering av levande neutrofiler.
Nuvarande metoder för att upptäcka neutrofiler lita på monoklonala antikroppar genereras mot cellytan exponerade antigener, såsom Ly - 6 G2 eller proteiner specifikt lagras i neutrofila granulat under basala förhållanden (t.ex. myeloperoxidas Laktoferrin). Fördelarna med monoklonala antikroppar är deras starka bindning, känslighet och mångsidighet olika assay villkor. Dock finns det flera nackdelar med att använda monoklonala antikroppar och anti-Ly - 6G i synnerhet. Dessa nackdelar inkluderar specificitet, Ly - 6G är närvarande på en majoritet av myeloida celler i benmärgen och på alla granulocyter inklusive eosinofiler; dechiffrera neutrofiler från eosinofiler med denna markör kräver alltså, mer komplex närmar sig8. En annan frekvent nackdelen med monoklonala antikroppar är deras ofta begränsad specificitet spektrum försvårar jämförelsen studier med mer än en djurart. En tredje nackdel av antikropp detektionsmetoder, särskilt när användande levande celler eller in vivo, är deras potential att störa cellernas funktion eller leda till cellaktivering. Exempelvis är administrationen av anti-Ly - 6G till möss vanligen tillämpas på neutrofila utarmning och övergående neutropeni9. Det har dessutom visat att antikroppen injektion kan stimulera neutrofila antitumöreffekt funktion10. Påvisande av antikroppar av neutrofiler avslöjar slutligen inte tillståndet aktivering av cellen.
Vi har identifierat en 40-amino acid peptid som kallas SNAJDARN240, som kan användas i ett antal analyser till etikett neutrofiler in vitro- eller in-vivo villkor samt assay aktiveringen ställningen av levande neutrofiler11. SNAJDARN240 härleds från SNAJDARN27012, en domän av Lactobacillus reuteri ytan slem-bindande protein ursprungligen beskrevs för dess förmåga att binda slem13,14. SNAJDARN240 interagerar med glykosylerat Laktoferrin som är närvarande vid höga koncentrationer i neutrofiler-specifika och tertiär granulat. SNAJDARN240 kan utsättas för dessa granulat genom standard vilket steg i histopatologi eller fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) protokoll för robust färgning av fasta neutrofiler. När levande neutrofiler hålls i ett inaktiverat tillstånd, SNAJDARN240 peptiden utesluts från granule innehållet och celler fläckar inte positivt med markören. Vid aktivering, kan SNAJDARN240 binda till exponerade Laktoferrin och leda till robust färgning med peptiden. SNAJDARN240 kan således användas för att avgöra aktiveringstillstånd för renat neutrofiler, vilket gör det till en attraktiv markör att följa smittsamma processen. Förmågan att binda till live-aktiverade neutrofiler kan också SNAJDARN240 att användas som ett verktyg för att identifiera områden av neutrofil inflammation i levande djurmodeller (t.ex. en mus artrit modell15). Protokollen i denna manuskriptet detalj hur fluorescently märkt SNAJDARN240 kan användas för att avslöja neutrofiler i histologi vävnader och hur till assay aktivering av levande renat neutrofiler i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har granskats och godkänts av de franska organisationerna CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) och CNIL (kommissionen Nationale Informatique et Liberté).
1. färgning neutrofiler i histopatologi vävnad med Fluorescently märkta SNAJDARN240
- För att erhålla vävnad för histopatologi, fixa vävnad/biopsi sektioner i en lämplig volym av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 30 min upp till 4 timmar beroende på tjockleken på provet. Placera proverna i kylskåp 4 ° C under fixering.
Obs: Alternativa fixering metoder/tidsinställningar kan ersättas utifrån användarens unika behov.- Bort PFA, lägga till 16% sackaroslösning med tillräckligt med volym för att helt täcka provet och placera provet vid 4 ° C för 4 h upp till övernattning.
- Ta bort 16% sackaroslösning och lägga till 30% sackaroslösning på en tillräckligt stor volym för att helt täcka provet, och placera den vid 4 ° C för 4 h upp till övernattning.
- Ta bort 30% sackaros lösningen och torka bort överflödig lösning från vävnaden med en pappershandduk. Placera avsnittet vävnad i optimal styckning temperatur (ULT) media och snapin-frysa i 2-methylbutane kyls i badkar torris-etanol (-72 ° C). När frysta fast (efter ~ 2 min), ta bort block från den 2-methylbutane och placera dem på torris tills alla block är färdig och klar för långsiktig lagring. Lagra de frysta block vid-80 ° C för långsiktig lagring.
- Kvällen innan vävnad block kommer att klippa, ta bort dem från frysen-80 ° C och placera dem vid-20 ° C över natten temperera.
- Använder en kryostaten, skär OCT-embedded vävnad i 10 - till 30 μm tjocka skivor och adsorberas till högkvalitativa glasskivor.
Obs: Tjockare eller tunnare skivor kan användas beroende på de experimentella krav. - Med en vax-penna eller andra hydrofoba metod, rita en ruta runt vävnad segmentet i glas bilden och låt torka.
- Förbereda färglösningen genom att utföra en 1:1,000 utspädning av SNAJDARN240-Cy5 (eller andra fluorescerande SNAJDARN240version, 1 mg/mL stamlösning) i lösning 0,1% saponin-PBS. Den optimala slutliga SNAJDARN240 koncentrationen bör 1 μg/mL.
Obs: Lägre slutliga koncentrationer kan användas (0,1-0,01 μg/mL) men kan leda till lägre signalintensitet.
FÖRSIKTIGHET: Saponin pulver kan irritera andning. Se till att väga saponin i ett skåp eller skyddade område. Alternativa permeabilisering metoder kan användas såsom Triton. Lägga till ytterligare markörer vid koncentrationer som tillverkaren rekommenderar (t.ex., 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), phalloidin, fluorescerande antikroppar). - Försiktigt doppa den glass glidbana till en lösning av 0,1% saponin-PBS tre gånger.
- Försiktigt torka bort överflödig vätska runt avsnittet vävnad och tillsätt tillräckligt färglösningen till helt täcka avsnittet vävnad. Placera bilden i en fuktkammare att undvika avdunstning och inkubera det för 1 h i rumstemperatur. Hålla den skyddas från ljus.
- Försiktigt doppa bilden till 0,1% saponin-PBS lösning 3 x. Sedan försiktigt doppa bilden till PBS lösning 3 x. Slutligen försiktigt doppa i bilden i destillerat H2O 3 x. Försiktigt torka överflödig vätska från bilden.
- Tillsätt en liten mängd (~ 20 μL) av monteringsmedium (20 mM Tris pH 8,0, 0,5% N-propylgallat, 90% glycerol) bredvid vävnad slice och försiktigt lägga ner ett täckglas ovanpå glasskiva. Försiktigt och jämnt tryck på täckglas på avsnittet vävnad och använder en pappershandduk, ta försiktigt bort eventuella montering-media som strängpressar runt kanterna på täckglaset.
- Placera den monterade bilden i ett mörkt skåp för 24 h att tillåta montering media att stelna. Alternativt placera den monterade bilden vid 37 ° C i 1 h.
- Använder en kryostaten, skär OCT-embedded vävnad i 10 - till 30 μm tjocka skivor och adsorberas till högkvalitativa glasskivor.
- Bild vävnaden skivor på en fluorescerande Mikroskop enligt önskad förvärvsmetoden.
2. visualisering av neutrofil aktivering med Retro-Inverso-SNAJDARN240-Cy5 peptid
- Erhålla humana neutrofiler använder följande protokoll. Förbered följande lösningar och placera dem i en anoxiska skåp övernattning. Exponering för syre kommer att börja aktivera neutrofiler och ytterligare framkalla cell död16,17.
Obs: Neutrofiler kan alternativt renas ”på bänken” för SNAJDARN240-märkning experiment; var dock medveten om att syrgasexponeringen kommer att börja påverka neutrofil aktivering.- Förbered följande lösning:
Lösning 1 [natriumklorid (NaCl) 0,9%]: Tillsätt 4,5 g NaCl till 500 mL H2O. Filter lösningen.
Lösning 2 (dextran 6%): tillsätt 6 g dextran i NaCl 0,9% lösningen till 100 mL.
Lösning 3 (tvätt buffert): lös etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,2 till en slutkoncentration av 2 mM i EDTA. Lös upp bovint serumalbumin (BSA) i PBS/EDTA-lösningen omedelbart före användning, så att den slutliga BSA-koncentrationen är 10% w/v. - Centrifugera blod insamling rör vid 650 x g i 20 min utan pauser.
- Utan att störa separerade blod, överföra blod insamling rören till en anoxiska skåp och samla plasma bråkdelar (överst) i en 50 mL konisk tub.
- Ta bort plasma-innehållande röret från anoxiska skåp och centrifugera vid 2,900 x g i 20 min med pauser till pellet blodplättarna.
- Utan att störa pelleterat blodplättarna, försiktigt över plasma röret tillbaka in i syrefria skåp och Pipettera trombocytantal fattiga plasma in en färsk 50 mL tub (nedan kallad ”plasma”).
- Förbered följande lösning:
- Separation av röda blodkroppar från leukocyter
- Med hjälp av rören som innehåller röda blodkroppar (RBC) från steg 2.1.3., kombinera de röda blodkropparna i en konisk 50 mL tub (5 blood collection tube innehåll per 50 mL tub).
- Tillsätt NaCl 0,9% tills den totala volymen når 44 mL. Tillsätt 6 mL dextran 6% (sista).
- Blanda försiktigt blod/dextran blandningen genom att invertera röret 10 - 20 gånger. Låt röret sedimenten i minst 30 min.
- Medan sedimentering sker, förbereda Percoll toning genom att lägga till 4,2 mL Percoll lösning 5,8 mL plasma i en 15 mL koniska rör och blanda väl genom att vända tuben.
- Samla in den övre delen av dextran samtidigt försöker undvika pipettering röda blodkroppar.
- Dra åt skruvlocket, avlägsna dextran röret från anoxiska kammaren och centrifugera röret vid 300 x g i 10 min med pauser.
- Noggrant placera röret tillbaka in i syrefria kammaren utan att störa pelleterat cellerna, och ta bort vätskan via pipettering.
- Försiktigt återsuspendering cellpelleten i 1 mL plasma och mycket långsamt lägga till toppen av den Percoll lösningen. Var noga med att inte inducerar blandning av lagren när pipettering cellerna på toppen.
- Ta försiktigt bort Percoll lösning röret från anoxiska kammare (undvika blandning) och centrifugera vid 800 x g i 20 min utan pauser. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) kommer att förbli på Percoll lösning ytan och neutrofiler kommer pellets med de röda blodkropparna.
- Borttagning av kontaminerande röda blodkroppar
- Bereda 14 mL buffert tvättlösningen genom att lägga till 700 μL PBS + 10% BSA 14 mL tvätt buffert.
- Placera Percoll lösning röret tillbaka in i syrefria kammaren. Ta bort Percoll och PBMC via pipettering och Slamma upp cellerna i 1 mL buffert tvättlösningen pelleterat. Pelleten vara åter svävande kommer att ha en röd färg på grund av kontaminerande röda blodkroppar.
- Tillsätt 200 μL av anti-CD235a (glycophorin) magnetiska pärlor till nytt suspenderade celler, blanda försiktigt och inkubera i minst 15 min. Detta steg laddar de kontaminerande röda blodkropparna med magnetiska pärlor så att de kan tas bort.
- Tvätta kolumnen separation med 2 mL tvätt buffert 3 x.
- Medan du håller ett 15 mL koniska rör under kolumnen separation, långsamt Pipettera neutrofiler/RBC blandningen överst i kolumnen. Samla in cellerna i 15 mL koniska röret när de flödar genom. Genomströmmande bör vara grumlig och förlora sin röda färg på grund av de röda blodkropparna återstående bundna till kolumnen.
- Tillsätt 2 mL av tvätt buffert till toppen av kolonnen och samla i samma 15 mL koniska rör. I slutet av 2 mL tvätten, bör genomströmmande vara klar, betecknar att alla neutrofilerna har samlats.
- Blanda försiktigt röret för att säkerställa jämn fördelning av neutrofiler och samla 10 μL för cell inventering. Observera den avslutande volymen för cell räknar ändamål. Räkna upp det totala antalet celler med valfri standard cell räknande metod.
- Ta bort neutrofila röret från anoxiska kammaren och centrifugera neutrofilerna på 300 x g i 20 min med pauser.
- Placera sedimenterade neutrofiler tillbaka in i syrefria kammaren och ta bort tvätt bufferten via pipettering. Re centrifugerade neutrofila i plasma med en maximal cell densiteten av 107 PMN/mL.
- Uppräkning av renat neutrofiler och visualisering med hjälp av SNAJDARN240
- Tillsätt 1 μL av RI-SNAJDARN240-Cy5 (1 mg/mL) 1 ml Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium utan fenolrött. Blanda genom pipettering väl.
- För tillämpningen av detta protokoll skall har resultatet beskrivits som om potenta neutrofiler aktivera reagens, N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanin (FMLP), läggs. Lägg till 1 μm av FMLP till RPMI/RI-SNAJDARN240-Cy5 tube och blanda via pipettering upp och ner.
Obs: Varje experimentella förfarandet kommer att skilja sig från denna punkt framåt, beroende på de frågor som behandlas. - Överför 1 mL RPMI/RI-SNAJDARN240-Cy5/FMLP blandningen till ett glas botten mikroskopi maträtt. Till denna maträtt, lägga till en volym av renat celler motsvarar 106 totala neutrofiler. Blanda genom att försiktigt pipettering.
- Placera skålen i en inverterad fluorescerande Mikroskop och starta bild förvärv. Till exempel rekommenderas att förvärva baslinjen bilder före tillsats av ett antal neutrofila-aktiverande reagens såsom FMLP eller bakterier. I det här exemplet startar förvärvet av RPMI/RI-SNAJDARN240-Cy5/neutrofiler, och vid en senare tidpunkt, Pipettera neutrofiler-aktiverande reagenset i glas skålen och fortsätta bild förvärv.
Obs: Ändringar av dessa steg kan göras utifrån vetenskapliga behov. - Processen förvärvade bilder/tid-lapse filmer som avser specifika mikroskopet används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av SNAJDARN240-färgade vävnader från histopatologi bilder brukar avslöja enskilda celler utspridda i vävnaden. SNAJDARN240 fläckar Laktoferrin, som är närvarande i neutrofila granulat och uppdelade. Således normalt sett punktuell färgning eller flera stora avskilda områden av signal kommer från enskilda neutrofiler (figur 1). Det är bra att lägga till en andra cell markör såsom DAPI att hjälpa Co lokalisera SNAJDARN240 signalen med färgade cellen. Det totala antalet upptäckta celler beror på antalet neutrofiler i synfältet och kan variera kraftigt beroende på källa och styrkan i immunförsvaret. Här visas representativa bilder från renat fast humana neutrofiler (figur 1A) och en vävnad biopsi av en patient med ulcerös kolit (figur 1B). Också visat är bilder tagna från en relativt låg nivå av neutrofiler i lungorna av möss som infekterats med Klebsiella pneumoniae (figur 1C) och en hög nivå av neutrofiler i tjocktarmen av ett marsvin infekterade med Shigella sonnei (Figur 1D).
Resultat med levande, renat neutrofiler visar vanligtvis lite till ingen cell färgning vid tidig tidpunkter, och öka gradvis i RI-SNAJDARN240 färgning över tid som mer neutrofiler aktiveras. Här visas en tid kursen serie bilder från ett experiment med renat humana neutrofiler infekterade med fluorescerande S. sonnei (figur 2). Beroende på styrkan i aktiverande signalen, kan neutrofiler börja färgning med SNAJDARN240 snabbt, så det rekommenderas att starta bilder före tillsats av aktivatorer. När celler aktiveras och RI-SNAJDARN240 positiva, bör de uppvisar en liknande färgning profil som fasta och permeabilized celler, som ger en punktuell färgning. Den optimala koncentrationen av SNAJDARN240 för både levande och fasta cell färgning är 1 μg/mL (figur 3). Lägre koncentrationer (0,1-0,01 μg/mL) kan användas men resultat i lägre signalintensitet. Det rekommenderas också att använda en DIC bild eller andra live-cellen fläcken för att skilja vilka celler visar en RI-SNAJDARN240 signal.
Figur 1 : SNAJDARN2 40 -målat neutrofiler människa, mus och marsvin ursprung. (A) representant MUB40 färgning (grön) av neutrofiler som renats från friska mänskliga donatorer. Cellkärnan är färgade med DAPI (blå). (B) färgningen av humana neutrofiler i vävnad från en ulcerös kolit biopsi. Neutrofiler avslöjas med SNAJDARN240 (grön) och cellkärnorna är fläckade DAPI (blå). (C) histopatologi från lungan av en mus som angripits av Klebsiella pneumoniae. Mus neutrofiler avslöjas i vävnaden med hjälp av SNAJDARN240 (grön) och cellkärnorna är fläckade DAPI (blå). (D) histopatologi från tjocktarmen av ett marsvin som angripits av Shigella sonnei. Neutrofiler svarar på infektionen avslöjas i vävnaden med SNAJDARN240 (grön). S. sonnei bakterier (röd) express proteinet fluorescerande dsRED. Cellkärnan är färgade med DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Live neutrofiler fläcken med SNAJDARN2 40 endast när aktiverad. Utvalda bilder från en tid förfaller serie med renat humana neutrofiler infekterade med S. sonnei i närvaro av RI-SNAJDARN240. I först påträffar uppsättning bilder (överst) neutrofiler en S. sonnei bakterie (röd) visas med en grön pil. Under tiden, är bakterien internaliseras av neutrofila och rötas. Som neutrofila aktiveras från bakterier, fläckar det successivt starkare med RI-SNAJDARN240. Bilderna till vänster är fluorescerande kanaler överdrog med DIC bilder. Bilderna till höger är fluorescerande kanaler bara. Bilder är tagna med 5 minuters mellanrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Effekten av olika SNAJDARN2 40 koncentrationer på neutrofila färgning. Representativa färgning av fast/permeabilized neutrofiler med olika koncentrationer av SNAJDARN240-Cy5. Renat humana neutrofiler var fixeras och färgas med angivna koncentrationerna av SNAJDARN240-Cy5. Cellkärnan är färgade med DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs två analyser där SNAJDARN240 peptiden används för att studera neutrofil inflammation och aktivering. Vi visar hur SNAJDARN240 kan avslöja neutrofiler föreligger i histopatologi sektioner eller visa sin aktiveringstillstånd att använda levande renat neutrofiler. De kritiska steg för att använda SNAJDARN240 som en färgning reagens är samma som med alla andra fluorescerande detektionsmetod. Var noga med att säkerställa kompatibilitet av fluorescerande signaler och att adekvata tvätt steg har tagits bort bakgrundsfärgning. De viktigaste övervägandena att uppnå bra färgning resultat är kvaliteten på mikroskopet, glas diabilder/täckglas och avsnitten vävnad. När du tittar på live renat neutrofiler, är de viktigaste stegen i reningsprocessen själv. Neutrofiler är känsliga och kan aktiveras genom ett antal olika signaler. För att säkerställa att experimentet ger meningsfulla resultat, måste man vara försiktig att hålla renat neutrofilerna inaktiv tills de är redo att användas. Detta kan uppnås genom att utföra protokollet neutrofila rening i en anoxiska kammare begränsa neutrofila exponering för syre.
Både en begränsning och nytta av SNAJDARN240, beroende på den experimentella frågan behandlas, är att SNAJDARN240 bara fläckar aktiverade neutrofiler såvida inte de är på något sätt permeabilized. Detta kan vara en stor fördel om experimentet efterlyser följande inflammation i levande djur eller renat cell, men det kan vara en nackdel om experimentet kräver identifiering av alla levande neutrofiler oavsett aktiveringsläge. En andra potentiella begränsning till detta protokoll är faktumet att Laktoferrin är närvarande i olika kroppssekret som tårar, mjölk och slem. För histopatologi färgning där dessa sekret bibehålls (t.ex. kolonbiopsier som tagits där slem lagret är intakt), färgar SNAJDARN240 också slem lagret tillsammans med alla nuvarande neutrofiler. I praktiken har detta ännu inte påverkar vår analys, men det bör noteras som en potentiell signalkälla.
För närvarande är SNAJDARN240 det endast neutrofila biomarkör som kan skilja mellan aktiverad och icke-aktiverade levande neutrofiler. Dessutom visas SNAJDARN240, till skillnad från antikroppar detektionsmetoder, inte att förändra funktionen eller överlevnad på neutrofiler in vitro eller in vivo. Tillägg av specifika antikroppar mot levande neutrofiler kan till exempel vara en aktiverande signal som påverkar neutrofil funktion eller överlevnad i mottagande. Detta gör SNAJDARN240 en mycket användbar reagens för forskning som inbegriper neutrofil aktivering eller granule release in vitro eller in-vivo. Dessutom SNAJDARN240 har en bred värd Värdspecificitet och kan vara direkt konjugerat med ett antal olika fluorophores, vilket möjliggör användning i steg färgning analyser över flera värdar. SNAJDARN240 färgning är alltså jämförbara mellan mus, mänskliga, och andra däggdjur mål, och det förenklar och minskar antalet reagenser som behövs för att upptäcka neutrofiler.
Medan detta protokoll fokuserar specifikt på histopatologi och levande cell bildåtergivning med SNAJDARN240, vi också framgångsrikt har använt peptiden i FACS sortering och levande djur i vivo imaging. Vi räknar med att SNAJDARN240 kommer att bli föremål för många olika analyser som omfattar påvisande av neutrofiler eller visualisering av inflammatoriska händelser i kroppen, och att framtida studier och protokoll kommer att utvecklas till ytterligare hävstång spectrumen av SNAJDARN2 40 användning, särskilt med icke-invasiv imaging technics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.S.M. är listad som en uppfinnare på SNAJDARN240 patent:
SNAJDARN240: Europeiska Patent EP11290403.2, 2011-09-09.
RI-SNAJDARN240: europeiska patentet EP nr 17306746.3, 11/12/17.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) och ANR JCJC bidrag (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
