Summary
Burada, sabit/permeabilized Histoloji bölümlerde nötrofil var olup olmadığını belirlemek ve canlı arıtılmış nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Özellikle, MUB40 peptid laktoferrin nötrofil özgü ve Tersiyer granül mevcut bağlar. Pozlama permeabilization veya nötrofil harekete geçirmek granül İçindekiler nötrofil işaretleme için sağlar.
Abstract
Burada, biz MUB40, yüksek konsantrasyonlarda nötrofil özel ve Tersiyer granül depolanan glikozile laktoferrin bağlama yeteneği ile sentezlenmiş bir peptid kullanımını içeren bir protokol sağlar. Nasıl Birleşik MUB40 doğrudan bir fluorophore için bu protokolü ayrıntıları bu canlı hücre Imaging'de nötrofil etkinleştirme ve de-granülasyon için tahlil için kullanılabilir ne kadar sabit/permeabilized dokularda de nötrofiller leke için kullanılabilir. Nötrofil algılama yöntemleri her zaman bazı uygulamalar için uygun değildir species-specific monoklonal antikorlar sınırlı olmalıdır. MUB40 hücre zarı nüfuz etmez ve böylece sigara-aktif/sigara-permeabilized nötrofil içinde depolanan laktoferrin üzerinden söz konusu değildir. MUB40 tane laktoferrin geniş ana bilgisayar aralığından, özellikle birden fazla araştırma modeli, ilgili çalışmalarda sonuçları karşılaştırmak için faydalı hale tanıma yararı yinelenen reaktifler sayısını azaltarak ve protokolleri kolaylaştırarak tek adım boyama yoluyla.
Introduction
Nötrofil bir doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil silah ve rutin olarak inflamasyon vücut etrafında siteler için işe. Nötrofil çalışma büyük ölçüde bozulmuş onların kısa ömrü vitro (az 8 h) ve sınırlı algılama araçları bazal koşullar altında veya aktivasyon sonra olmuştur. Burada, sabit/permeabilized örneklerinde memeli nötrofil geniş ve belirli algılanması için iyi sınanmış bir protokol mevcut. Ayrıca canlı nötrofil MUB40ile boyama için detaylı bir protokol sağlar. Canlı nötrofil boyama iletişim kuralını kullanarak, zamanlama ve nötrofil harekete geçirmek konumunu kesin olarak belirlemiş. Bu iletişim kuralı nötrofil harekete geçirmek ya da granül yayın eğitim almak isteyen araştırmacılar için idealdir. Antimikrobiyal işlevlerini, nötrofil şimdi immunomodulatory hücreler çeşitli hastalıklar ve immün yanıt (doğuştan gelen ve edinilmiş)1,2yer olarak takdir edilmektedir. Nötrofil yüksek numaralarından enfekte dokularda, inflamatuar tümörler3, IBS ve Crohn flare-up4sırasında ve romatoid artrit (synovia gibi bulaşıcı olmayan iltihap alanlarında en inflamatuar doku mevcut RA) hastalar5. Nötrofil önceden biçimlendirilmiş granül azurophil (α), özel (β1), Tersiyer (B2) granülleri ve salgı veziküller (γ)6adlı dört sınıfları içerir. Geçiş inflamatuar sitesine üzerine işe nötrofil aktif hale ve sırayla granül içeriği daha fazla istihdamı teşvik ve katkıda bulunur (yapışma, antimikrobiyal bileşikleri ve immunomodulatory molekülleri oluşan), salgılar enfeksiyon çözünürlük (aynı zamanda için ana bilgisayar doku hasarı)7. Nötrofil olarak kabul edilir süre önemli bir özelliği, orada bugüne kadar doğuştan gelen bağışıklık kaç algılama reaktifler onlara eğitim kullanılabilir, ve hatta daha az bu yaşam nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.
Monoklonal antikor Ly - 6 G2 veya özel olarak nötrofil granül bazal koşullar (Örneğin, myeloperoxidase altında depolanan proteinler gibi hücre yüzeyine maruz antijenlere karşı oluşturulan nötrofil tespit geçerli yöntemleri itimat Laktoferrin). Onların güçlü bağlama, ışık hassasiyeti ve çeşitli tahlil koşullarda çok yönlülük monoklonal antikorlar avantajları şunlardır. Ancak, özellikle kullanarak monoklonal antikorlar ve anti-Ly - 6 G birçok downsides vardır. Ly - 6 G mevcut myeloid hücrelerin bir çoğunluğu kemik iliği ve Eozinofiller de dahil olmak üzere tüm granülosit olduğu gibi bu downsides özgüllüğü, içerir; Böylece, nötrofil eozinofil üzerinden bu marker ile deşifre daha fazla kompleksleri yaklaşımlar8gerektirir. Başka bir sık tradeoff monoklonal antikorlar ile birden fazla hayvan türleri ile karşılaştırma çalışmaları zorlaştırıyor onların kez sınırlı ana özgüllük, aralıktır. Üçüncü ise bir antikor algılama yöntemleri özellikle canlı hücreleri veya içinde vivo kullanırken, hücre işlevi bozabilir veya hücre aktivasyonu için kurşun potansiyellerini dezavantajıdır. Örneğin, yönetim, anti-Ly - 6G farelere yaygın nötrofil tükenmesi ve geçici nötropeni9uygulanır. Ayrıca antikor enjeksiyon nötrofil antitümör işlev10teşvik edebilir kanıtlanmıştır. Son olarak, antikor algılama nötrofil hücre etkinleştirme durumunu ortaya koymuyor.
Biz 40-amino asit peptid MUB40deneyleri bir sayısını nötrofil vitro ve in vivo koşulları altında etiket gibi canlı nötrofil11etkinleştirme durumunu tahlil için kullanılabilir, denilen belirledik. MUB40 MUB7012, aslında onun yetenek mukus13,14bağlamak için açıklanan Lactobacillus reuteri yüzey mukus-bağlayıcı proteinin bir etki elde edilir. MUB40 nötrofil özgü ve Tersiyer granül yüksek konsantrasyonlarda bulunur glikozile Laktoferrin ile etkileşim kurar. MUB40 histopatoloji veya floresan aktif hücre sağlam sabit nötrofil boyama için (FACS) iletişim kuralları sıralama mevcut standart permeabilization adımlarda bu tanecikler için gösterilebilir. Canlı nötrofil Inaktif bir durumda tutulur MUB40 peptid granül içeriğinden söz konusu değildir ve hücreleri marker ile pozitif leke değil. Harekete geçirmek MUB40 maruz laktoferrin bağlamak ve sağlam ile peptid boyama için yol. Böylece, MUB40 arıtılmış nötrofil, yapım o bulaşıcı süreci takip etmek çekici bir işaretleyici etkinleştirme durumunu belirlemek için kullanılabilir. Aktif nötrofil yaşamak için bağlama yeteneği aynı zamanda canlı hayvan modellerinde (Örneğin, bir fare artrit modeli15) nötrofil iltihap alanları tespit etmek için bir araç olarak kullanılacak MUB40 sağlar. Bu el yazması ayrıntılı nasıl fluorescently MUB40 etiketli iletişim kuralları nötrofil Histoloji doku ve nasıl canlı arıtılmış nötrofil vitroaktivasyonu tahlil ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada gözden geçirilmiş ve onaylanmış Fransız kuruluşlarca CoRC (Comite de Recherche Clinique), CPP (Comite de koruma des Personnes) ve CNIL (komisyon Nationale Informatique et Liberté).
1. Fluorescently nötrofil histopatoloji doku ile boyama MUB40 etiketli
- Histopatoloji için doku elde etmek için en fazla 4 h örnek kalınlığına bağlı olarak doku/biyopsisi bölümleri % 4 paraformaldehyde (PFA) 30 dk için uygun bir birimdeki düzeltmek. Örnekleri fiksasyon sırasında 4 ° C buzdolabında yerleştirin.
Not: Alternatif fiksasyon yöntemleri/zamanlamaları kullanıcının benzersiz ihtiyaçlarına göre yedek olabilir.- PFA kaldırmak ve örnek 4 gece kadar s için 4 ° C'de yer % 16 sükroz çözüm örnek tamamen karşılamak için yeterli hacim ile ekleyin.
- % 16 sükroz çözüm çıkarın ve % 30 sükroz çözüm örnek tamamen kapsayacak kadar geniş bir ses seviyesinde ekleyin ve 4 gece kadar s için 4 ° C'de yerleştirin.
- % 30 sükroz çözümü kaldırmak ve doku kağıt havlu ile fazla çözümden kapalı leke. Doku bölümü en iyi kesim ısı (OCT) medya yerleştirin ve 2-methylbutane bir kuru buz-etanol banyosunda (-72 ° C) soğutmalı içinde ek-kıpırdama. (~ 2 dakika sonra) donmuş bir kez, 2-methylbutane blokları kaldırmak ve tüm blokları bittiğinde ve uzun süreli depolama için hazır olana kuru buza koyun. Uzun süreli depolama için-80 ° C'de donmuş blok saklayın.
- Kes,-80 ° C dondurucudan çıkarıp ve-20 ° equilibrate için C bir gecede yer onları doku taşlarıdır önceki gece.
- Bir cryostat kullanarak, OCT gömülü doku 10 - 30 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin ve yüksek kaliteli cam slaytlara absorbe.
Not: Kalın veya ince dilimleri deneysel gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir. - Bir balmumu kalem veya diğer hidrofobik yöntemi, cam slayt üzerinde doku dilim çevresinde bir kutu çizin ve kurumaya bırakın.
- 1:1,000 seyreltme MUB40gerçekleştirerek boyama çözüm hazırlamak-Cy5 (ya da Diğer Floresan MUB40yorum, hisse senedi 1 mg/mL solüsyon) % 0,1 saponin PBS çözümde. En iyi son MUB40 konsantrasyon 1 μg/mL olması gerekir.
Not: Son düşük konsantrasyonlarda kullanılabilir (0,1-0,01 μg/mL) ama sinyal yoğunluğu azaltmak için neden olabilir.
Dikkat: Saponin toz nefes tahrişe neden olabilir. Bir kabin veya korumalı alanda saponin tartmak emin olun. Alternatif permeabilization yöntemleri Triton gibi kullanılabilir. Üretici tarafından önerilen konsantrasyonları ek işaretleyicileri ekleyin (Örn., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, floresan antikor). - Yavaşça % 0,1 saponin-PBS çözeltisi içine cam slayt üç kez daldırma.
- Dikkatle doku bölüm etrafında uzak aşırı sıvı leke ve tamamen doku bölümü kapsayacak şekilde boyama yeterli çözüm ekleyin. Slayt buharlaşma önlemek ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya nem odası içine koyun. Işıktan korunan devam et.
- Yavaşça slayt % 0,1 saponin PBS çözüm 3 içine daldırma x. Sonra yavaşça slayt PBS çözüm 3 içine daldırma x. Son olarak, yavaşça daldırma distile H2O slayta 3 x. Dikkatli bir şekilde aşırı sıvı slayt kuru.
- Montaj Orta (20 mM Tris pH 8.0, % 0.5 N-propil gallat, % 90 gliserol) doku dilim yanındaki küçük bir miktar (~ 20 μL) ekleyin ve hafifçe aşağı bir cam coverslip cam slayt üstünde yatıyordu. Yavaşça ve eşit coverslip doku bölümü basın ve bir kağıt havlu kullanarak, dikkatle coverslip kenarları dışarı herhangi bir montaj medyayı çıkarın.
- Bağlı slayt kuvvetlendirmek montaj medya izin vermek 24 h için karanlık bir kabine yerleştirin. Alternatif olarak, bağlı slayt 37 ° C için 1 h yerleştirin.
- Bir cryostat kullanarak, OCT gömülü doku 10 - 30 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin ve yüksek kaliteli cam slaytlara absorbe.
- İstenen edinme yöntemine göre floresan mikroskop doku dilimleri görüntü.
2. görsel olarak nötrofil harekete geçirmek ile Retro-Inverso-MUB40-Cy5 peptid
- İnsan nötrofil aşağıdaki iletişim kuralı kullanılarak elde edilir. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak ve anoksik kabine gece kalmak koyun. Oksijen maruz nötrofil etkinleştirmek ve daha fazla hücre ölüm16,17teşvik etmeye başlayacaktır.
Not: Nötrofiller alternatif olarak "tezgah" MUB40için saf-deneyler; etiketleme Ancak, oksijen pozlama nötrofil harekete geçirmek etkilemeye başlar unutmayın.- Ertesi gün eriyik hazırlayın:
Eriyik 1 [% 0,9 sodyum klorür (NaCl)]: H2O. filtre çözümü 500 mL NaCl 4,5 g ekleyin.
Çözüm 2 (dextran % 6): 6 g dextran için 100 mL NaCl %0.9 çözümde ekleyin.
Çözüm 3 (çamaşır arabellek): bir son 2 mM EDTA konsantrasyon için PBS pH 7.2 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) geçiyoruz. Öyle ki son BSA konsantrasyonu % 10 w/v kullanımdan hemen önce Sığır serum albumin (BSA) PBS/EDTA çözümde geçiyoruz. - 650 x g 20 dk olmadan tatili için de kan toplama tüpler santrifüj kapasitesi.
- Ayrılmış kan aksatmadan, kan toplama tüpler 50 mL konik tüp içinde bir anoksik kabine ve toplamak plazma kesirler (üst) aktarın.
- Plazma içeren tüp anoksik kabine ve trombosit cips sonlarıyla 20 dk santrifüj 2,900 x g de kaldırın.
- Pelleted trombosit aksatmadan, yavaşça plazma tüp anoksik kabine ve damlalıklı trombosit zavallı plazma (bundan sonra "plazma" olarak da adlandırılır) bir taze 50 mL tüp içine içine geri aktarın.
- Ertesi gün eriyik hazırlayın:
- Kırmızı kan hücrelerinin ayrılması lökosit
- 2.1.3. adımdaki kırmızı kan hücreleri (RBCs) içeren borular kullanarak., konik 50 mL tüp (5 kan toplama tüp içeriği 50 mL tüp başına) içine RBCs birleştirmek.
- Toplam hacim 44 mL ulaşıncaya kadar % 0,9 NaCl ekleyin. 6 mL dextran %6 (son) ekleyin.
- 10 - 20 kez tüp ters çevirme tarafından kan/dextran karışımı karışımı yavaşça. Tüp tortu için en az 30 dakika izin ver.
- Sedimantasyon meydana gelen ise 15 mL konik tüp plazmada 5.8 mL 4,2 mL Percoll çözeltisi eklenerek Percoll degrade hazırlamak ve de tüp ters çevirme tarafından karıştırın.
- Dextran üst kısmını pipetting kırmızı kan hücreleri önlemek çalışırken toplamak.
- Vidalı kapak sıkın, anoksik odasından dextran tüpü çıkarması ve 300 x g sonlu 10 dk de tüp santrifüj kapasitesi.
- Dikkatle pelleted hücreleri bozmadan anoksik odasına tüpü yerleştirin ve pipetting yolu ile sıvı kaldırın.
- Yavaşça hücre Pelet yeniden 1 mL plazma askıya alma ve çok yavaş Percoll çözüm en üstüne ekleyin. Hücrelerin üstüne pipetting zaman katmanları karıştırma teşvik değil dikkatli olun.
- Dikkatle Percoll çözüm tüp anoksik odası (karıştırma kaçınarak) ve 800 x g, santrifüj sonları olmadan 20 dk için kaldırın. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) Percoll çözüm yüzeyde kalır ve nötrofil RBCs ile cips.
- RBCs kirletici kaldırma
- Arabellek çözüm 700 μL PBS + % 10 BSA arabellek yıkama 14 mL için ekleyerek yıkama 14 mL hazırlayın.
- Percoll çözüm tüp anoksik odasına koyun. Percoll ve PBMCs pipetting üzerinden kaldırmak ve arabellek Çözüm yıkama 1 mL pelleted hücreleri yeniden askıya alma. Pelet yeniden askıya olmak bulaşıcı RBCs nedeniyle kırmızı bir renk olacak.
- Anti-CD235a (glycophorin) manyetik boncuklar 200 μL yeniden askıya alınmış hücrelere ekleme, karışımı yavaşça ve en az 15 dk için kuluçkaya. Böylece onlar-ebilmek var olmak çıkarmak bu adım manyetik boncuklar ile bulaşıcı RBCs yükler.
- Yıkama yıkama 2 mL ayrılık sütunla tampon 3 x.
- 15 mL konik tüp ayrılık sütununun altında tutarak, sütunun üst nötrofil/RBC karışıma yavaş yavaş pipette. Onlar akışı olarak 15 mL konik tüp hücrelerde toplamak. Akış ile bulutlu olmalı ve kırmızı rengini sütuna bağlı kalan RBCs nedeniyle kaybetmek.
- Arabellek sütunun üst için yıkama 2 mL ekleyin ve aynı 15 mL konik tüp toplamak. 2 mL yıkama yılı sonuna kadar akışı aracılığıyla tüm nötrofil toplanmıştır belirten açık olmalıdır.
- Nötrofil eşit dağılımı sağlamak ve hücre sayımı için 10 μL toplamak için tüp karışımı yavaşça. Amacıyla sayım hücre için son hacim unutmayın. Standart herhangi bir hücreyi sayma yöntemi ile toplam sayısı numaralandırır.
- Nötrofil tüp anoksik odasından kaldırın ve 300 x g sonları ile 20 dk için de nötrofiller santrifüj kapasitesi.
- Posalı nötrofil anoksik odanın içine yerleştirin ve pipetting yolu ile çamaşır arabellek kaldırın. Nötrofil Pelet plazma 10 en fazla hücre yoğunluğu ile yeniden askıya7 PMN/mL.
- Numaralandırma arıtılmış nötrofil ve MUB40 kullanarak görselleştirme
- RI-MUB401 μL eklemek-Cy5 (1 mg/mL) 1 ml Rosewell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta fenol red olmadan. De pipetting tarafından karıştırın.
- Sanki reaktif aktive güçlü bir nötrofil N-formylmethionyl-leucyl-Fenilalanin (FMLP), eklenir bu iletişim kuralının amacı gereği, sonucu açıklanan olmuştur. FMLP 1 mikron RPMI/RI-MUB40' a Ekle-Cy5 tüp ve pipetting ile karışımı yukarı ve aşağı.
Not: Her deneysel işlemin ele alınmaktadır sorular bağlı olarak bu noktadan sonra farklı olacaktır. - 1 mL RPMI/RI-MUB40transfer-Cy5/FMLP karışımı bir cam alt mikroskobu yemek için. Bu yemek için saflaştırılmış hücre 106 toplam nötrofiller için karşılık gelen bir birim eklemek. Pipetting tarafından hafifçe karıştırın.
- Çanak ters bir Floresan Mikroskobu yerleştirin ve resim alma başlatın. Örneğin, bu temel görüntüleri önce nötrofil aktive reaktif FMLP veya bakteri gibi eklenmesi önerilir. Bu örnekte, RPMI/RI-MUB40edinimi başlatmak-Cy5/nötrofil ve bir sonraki timepoint, nötrofil aktive reaktif cam tabak içine pipette ve resim alma devam.
Not: Aşağıdaki adımları için değişiklik bilimsel ihtiyaçlarına göre yapılabilir. - Süreç olarak kullanılan belirli mikroskop ile ilgilidir görüntüleri/zaman-lapse film satın aldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçları MUB40-histopatoloji slaytlardan lekeli dokular genellikle tek tek hücreleri doku dağınık ortaya. MUB40 lactoferrin, nötrofil granül bulunması ve bölümlere olan leke bırakır. Böylece, tipik olarak görülen punctate boyama veya sinyal çeşitli büyük ayrılmış alanlarda bireysel nötrofil (Şekil 1) geliyor. DAPI MUB40 sinyal lekeli hücre ile birlikte yerelleştirilmesine yardımcı gibi ikinci bir hücre işaretçisi eklemek yararlıdır. Toplam sayısı tespit edilen görüş alanı mevcut nötrofil sayısı bağlıdır ve kaynak ve bağışıklık yanıtı gücünü önemli ölçüde bağlı olarak değişebilir. Burada gösterilen temsili saf sabit insan nötrofil (Şekil 1A) ve ülseratif kolit hastada (Şekil 1B) doku biyopsisi görüntülerdir. Ayrıca görüntüleri nötrofil Klebsiella pneumoniae ile (Şekil 1C) enfekte farelerin akciğerlerde nispeten düşük düzeyde alınır ve nötrofil eskiden şiling şimdi domuz kolon yüksek düzeyde Shigella sonnei ile enfekte gösterilen (Şekil 1D).
Canlı, saf nötrofil kullanarak sonuçları genellikle erken zaman noktalarda boyama Hayır küçük cep göster ve daha fazla nötrofil aktif hale gibi zaman içinde boyama RI-MUB40 içinde yavaş yavaş artırın. Burada gösterilen zaman sahası, floresan S. sonnei ile (Şekil 2) enfekte arıtılmış insan nötrofil kullanarak bir deneme görüntülerden dizisidir. Bu yüzden aktivatörleri eklenmesi önce görüntüleri elde etme başlatmak için tavsiye aktive sinyal gücünü bağlı olarak MUB40 ile hızla, boyama nötrofil başlayabilir. Ne zaman hücreleri aktive olur ve RI-MUB40 pozitif, punctate boyama vermek sabit ve permeabilized hücreleri olan için benzer bir boyama profil göstermelidir. En iyi iki canlı ve sabit hücre boyama için MUB40 1 μg/mL (Şekil 3) bölgedir. Düşük konsantrasyonlarda (0,1-0,01 μg/mL) sonucu daha düşük sinyal şiddeti kullanılabilir. Ayrıca DIC görüntü veya diğer canlı-hücre leke hangi hücrelerin bir RI-MUB40 sinyal görüntülemekte olduğunuz ayırt etmek için kullanmak için önerilir.
Resim 1 : MUB 40 -insan nötrofil, fare ve eskiden şiling şimdi domuz kökenli lekeli. (A) temsilcisi MUB40 sağlıklı insan bağışçılardan saf nötrofil (yeşil) boyama. Hücre çekirdeği ile DAPI (mavi) lekeli. (B) Staining ülseratif kolit biyopsi dokudan insan nötrofil. Nötrofil MUB40 ' la (yeşil) ortaya çıkar ve hücre çekirdeği ile DAPI (mavi) lekeli. (C) histopatoloji akciğer üzerinden Klebsiella pneumoniaeile enfekte bir fare. Fare nötrofil MUB40 (yeşil) kullanarak dokusunda ortaya çıkar ve hücre çekirdeği ile DAPI (mavi) lekeli. (D) histopatoloji Shigella sonneiile enfekte bir kobay kolon üzerinden. Enfeksiyon yanıt nötrofil doku MUB40 (yeşil) ile ortaya çıkar. S. sonnei bakteri (kırmızı) hızlı floresan dsRED protein. Hücre çekirdeği ile DAPI (mavi) lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Canlı nötrofil leke MUB ile 40 sadece aktif hale getirildiğinde. Seçilen resimleri RI-MUB40varlığında S. sonnei ile enfekte arıtılmış insan nötrofil içeren bir zaman atlamalı serisi. İlk resim (üst) bir nötrofil dizisini yeşil bir ok ile gösterilen bir S. sonnei bakteri (kırmızı) karşılaşır. Saat boyunca bakteri nötrofil tarafından içselleştirilmiş ve sindirilmiş. Nötrofil bakterilerden aktive olur gibi RI-MUB40ile giderek daha güçlü lekeleri. Soldaki görüntülerdir floresan kanalları DIC görüntüleri ile overlaid. Floresan kanallar yalnızca sağdaki görüntülerdir. Görüntüleri 5 dk aralıklarla alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Farklı MUB etkisini 40 üzerinde nötrofil boyama konsantrasyonları. Temsilcisi sabit/permeabilized nötrofil MUB40çeşitli konsantrasyonları ile boyama-Cy5. Saf insan nötrofil sabit ve MUB40belirtilen konsantrasyonları ile lekeli-Cy5. Hücre çekirdeği ile DAPI (mavi) lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, iki deneyleri MUB40 peptid nötrofil inflamasyon ve harekete geçirmek için kullanılan açıklanır. Biz nasıl MUB40 nötrofil histopatoloji bölümlerde ya da canlı arıtılmış nötrofil kullanarak onların harekete geçirmek durum göstermek-ebilmek açığa vurmak göstermek. MUB40 boyama reaktifi kullanmak için kritik adımlar olarak başka bir floresan algılama yöntemi ile aynıdır. Floresan sinyallerin ve güncelliği ve yeterli çamaşır adımlar arka plan boyama kaldırmak için atılmıştır özen göstermelidir. İyi boyama sonuçları elde etmek için en önemli mikroskop, cam slaytlar/kapak fişleri ve doku bölümleri kalitesini konulardır. Canlı arıtılmış nötrofil görüntülerken, arınma sürecinde en önemli adımlardır. Nötrofil duyarlıdır ve farklı sinyalleri bir dizi tarafından etkinleştirilebilir. Deneme anlamlı sonuçlar yapılmadığından emin olmak için kullanılmak üzere hazır oldukları kadar arıtılmış nötrofil etkin olmayan tutmaya özen göstermelidir. Bu bir anoksik odasında oksijen için nötrofil maruz kalma sınırı nötrofil arıtma Protokolü gerçekleştirerek sağlanabilir.
Bir sınırlama ve MUB40ele alınıyor, deneysel soru üzerine bağlı olarak, avantajlarından olduğunu onlar bir şekilde permeabilized sürece MUB40 tek lekeleri nötrofil aktif. Bu deney bir canlı hayvan veya saf hücre aşağıdaki iltihap için diyor ama deneme etkinleştirme durumu ne olursa olsun tüm canlı nötrofil algılama gerektiriyorsa, bu bir dezavantaj olabilir büyük bir avantaj olabilir. Aslında bu iletişim kuralı için ikinci bir potansiyel kısıtlamadır o laktoferrin gözyaşları, süt ve mukus gibi çeşitli vücut salgıları olan vardır. Bu salgılar (mukus tabakası sağlam olduğuÖrneğin, kolon biyopsi) korunur histopatoloji boyama için MUB40 Ayrıca mukus katmanla birlikte mevcut herhangi bir nötrofil leke. Uygulamada, bu bizim analiz etkiler henüz ancak bu potansiyel bir sinyal kaynağı olarak belirtmek gerekir.
Şu anda, MUB40 aktif ve etkin olmayan canlı nötrofil arasında ayırt sadece nötrofil biyomarker olduğunu. Ayrıca, MUB40, antikor algılama yöntemleri, aksine alter işlev veya nötrofil içinde vitro veya vivo içindeyaşama görünmüyor. Örneğin, ek canlı nötrofil karşı belirli antikorların nötrofil fonksiyon veya ana hayatta etkileyen etkinleştiren bir sinyal olabilir. Bu çok yararlı bir reaktif nötrofil harekete geçirmek ya da granül yayın içinde vitro veya vivo içindeiçeren araştırma MUB40 yapar. Ayrıca, MUB40 geniş ana bilgisayar özgüllük menzili ve doğrudan farklı fluorophores tek adım boyama deneyleri kullanmak için birden çok ana bilgisayarlara izin vererek, bir dizi için Birleşik. Bu nedenle,40 MUB boyama fare arasında insan, karşılaştırılabilir ve diğer memeli hedefleri ve kolaylaştıran ve nötrofil algılamak için gerekli reaktifler sayısını azaltır.
Bu iletişim kuralı özellikle histopatoloji ve canlı hücre görüntüleme MUB40kullanarak üzerinde duruluyor olsa da, biz de başarıyla FACS sıralama içinde peptid kullandık ve canlı hayvan vivo içinde görüntüleme. Biz MUB40 nötrofil tespiti ve vücuttaki inflamatuar olayların görsel öğeler içeren birçok farklı deneyleri için mükellef ve gelecekteki çalışmaları ve iletişim kuralları için daha fazla kaldıraç MUB spektrum geliştirilecektir tahmin 40 anlamları, özellikle non-invaziv görüntüleme teknikleri kullanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.S.M. bir mucit MUB40 patent üzerinde listelenir:
MUB40: Avrupa Patent EP11290403.2, 09/09/2011.
RI-MUB40: Avrupa Patent AP No 17306746.3, 11/12/17.
Acknowledgments
Bu eser Fondation Laurette Fugain (Eğer-2015-15) (B.S.M.) tarafından desteklenen ve ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.) verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
