Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

doi: 10.3791/58369 Published: September 28, 2018

Summary

Протокол для освещения растений тилакоидных белков сложной организацией и композиция с голубой родной полиакриламида гель электрофореза (БН-страница) и описал 2D-SDS-PAGE. Протокол оптимизирован для Arabidopsis thaliana, , но может быть использован для других видов растений с незначительными изменениями.

Abstract

Фотосинтетической электрон передачи цепи (и т.д.) преобразует солнечную энергию в химическую энергию в виде АТФ и НАДФН. Четыре крупных белковых комплексов встроенный в тилакоидной мембраны урожай солнечной энергии поехать NADP+ через двух фотосистем электронов от воды, и использовать созданный протонного градиента для производства АТФ. PSII фотосистемы, PSI, цитохромы b6f (Cyt b6f) и АТФазы являются все multiprotein комплексы с различные ориентации и динамика в тилакоидной мембраны. Можно получить ценную информацию о составе и взаимодействия белковых комплексов в тилакоидной мембране, растворяющие комплексы от целостности мембраны, мягкими моющими средствами, следуют электрофоретического разделения родной гель комплексы. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является аналитический метод, используемый для разделения белковых комплексов в их родной и функциональной форме. Этот метод может использоваться для сложных очищение протеина для более детального анализа структурных, но он также предоставляет инструмент для того чтобы рассечь динамического взаимодействия между белковых комплексов. Метод был разработан для анализа митохондриальной дыхательных белковых комплексов, но с тех пор были оптимизированы и улучшены для рассечения тилакоидов белковых комплексов. Здесь мы предоставляем подробную обновленную протокол для анализа лабильной фотосинтетической белковых комплексов и их взаимодействия в проростках Arabidopsis thaliana.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Большие multisubunit белка комплексы фотосистем PSI и PSII, Cyt b6f и АТФазы координировать производства АТФ и НАДФН в фотосинтетических реакциях свет. В высших растений хлоропластов комплексы расположены в тилакоидной мембране, который является структурно гетерогенных мембраны структурой, включающей прижаты Грана и тилакоидов стромы не прижаты. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является широко используемым методом при анализе больших multisubunit белковых комплексов в их родной и биологически активной форме. Этот метод был создан для рассечения митохондриальной мембраны белковых комплексов1, но позже был настроен для разделения белковых комплексов в тилакоидной мембраны сети3. Этот метод подходит (i) для очистки отдельных тилакоидов белковых комплексов для структурного анализа, (ii) для определения собственных взаимодействий между белковых комплексов и (iii) для анализа общей организации белковых комплексов После изменения окружающей среды подсказки.

До разделения белковых комплексов изолированы от мембраны с тщательно подобранными неионогенных моющих средств, которые, как правило, мягкая и сохранения родной структуры белковых комплексов. Моющие средства содержат гидрофобных и гидрофильных сайты и стабильные формы мицеллы выше определенной концентрации, называется критической концентрации мицеллярный (CMC). Повышение концентрации моющего средства над результатами CMC, в нарушение взаимодействия липидов липидов и солюбилизация белковых комплексов. Выбор моющего средства зависит от стабильности белкового комплекса интереса и солюбилизация количество моющего средства. Регулярно используются моющие средства включают α/β-додецил maltoside и digitonin. После солюбилизация белковых комплексов в их родном государстве нерастворимый материал удаляется путем центрифугирования. В высших растений мембрана тилакоида весьма неоднороден в структуре и некоторые моющие средства (например, digitonin) избирательно солюбилизировать последнего только конкретную часть мембраны3. Таким образом чтобы характеризовать организации сложных белков или взаимодействия между белковых комплексов, важно всегда определить мощность солюбилизация выбранного моющего средства, определяя содержание хлорофилла и хлорофилла a/b отношение супернатант для оценки урожайности и представлены тилакоид (суб) домена, соответственно, растворимых дроби. Хлорофилл a/b в нетронутыми тилакоидов роста свет акклиматизации растений составляет обычно около 3, тогда как chl / значение b тилакоидных фракций обогащенный либо в Грано или тилакоидов стромы падает ниже (~ 2.5) или превышает значение общего (~ 4.5) Тилакоиды, соответственно.

Чтобы обеспечить отрицательный заряд для белковых комплексов, Кумасси блестящий синий краситель (НБР) добавляется растворимых образца. Из-за смены заряда белковых комплексов мигрируют к аноду и отделены с уклоном акриламида (АА), по словам их молекулярной массе и форме. Эффективное и высоким разрешением разделение достигается с помощью градиента концентрации линейных акриламида. Во время электрофореза белковых комплексов мигрируют к аноду до тех пор, пока они достигают их размер зависит от размера пор предел. Размер поры геля полиакриламида зависит от (i Общая акриламида /бис- акриламид концентрация (T) и (ii) на крест-компоновщик бис- акриламид мономера концентрации (C) по отношению к общей мономеров4. После разделения с БН-страницы белковых комплексов можно далее подразделить их индивидуальных белковых субъединиц, второй измерение (2D) - SDS - PAGE. Здесь мы описываем подробный протокол для анализа тилакоидной мембраны белковых комплексов по БН-страница/2D-SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка млрд лари1,2,3

  1. Настройка гель заклинателя плитами 8 x 10 см (прямоугольные стекла и пластина зубчатая глинозема) согласно инструкциям производителя, используя распорки 0,75 мм.
  2. Место градиент миксера на тарелку, перемешать и подключить его с перистальтических насосов, труб. Прикрепите иглой шприца в другой конец трубки и поместите иглу между стекла и алюминиевых пластины. Магнитная мешалка место для «тяжелых» (H)-камеры.
  3. Подготовьте 3,5% (v/v) и 12,5% (v/v) акриламида (АА) решения в 15 мл конические пробирок для разделения гель градиента (см. рецепты в таблице 1). Во избежание преждевременной полимеризации, держите пробирок на льду при подготовке решений.
    Предупреждение: Акриламид является нейротоксического и канцерогенными, носить защитную одежду и перчатки.
  4. Добавьте 5% APS и TEMED прямо перед закупорить решения градиент миксера. Накапайте 12,5% раствора H-камере.
    1. Удаления пузырьков воздуха из канал, соединяющий «свет» (L) и H-палата, открыв клапан, соединяющий две камеры, позволяя решение вступить в L-камеру. Закройте клапан и пипетки следы решения обратно к H-камере.
    2. Наконец накапайте 3,5% раствор L-камере.
  5. Переключение на магнитной мешалкой (скорость перемешать не является критической, но она должна обеспечивать надлежащее смешивание тяжелых и легких решений), откройте клапаны и включите перистальтического насоса. Позволяют решения гелем между стекла и алюминиевых пластины, расхода должна быть примерно 0,5 мл/мин. Игла должна быть выше жидкости все время, она может быть присоединена к верхней части стеклянной пластины с ленты.
  6. Когда камеры H - и L-опустели, заполнить их с ультрачистая вода и позволить воде нежно наложение на поверхность геля. Полимеризации геля занимает около 1-2 часа на RT.
  7. Приготовляют раствор акриламида 3% (см. рецепт в таблице 1) для укладки гель на RT. Накапайте штабелируя гель на вершине полимеризованной разделение геля (перед заливкой штабелируя гель, удалить воду, наложение на поверхность геля) и поместите образец гель гребень между стекла и алюминиевых пластины избегая пузырьки воздуха.
    1. Позвольте полимеризоваться 30-60 мин на RT. Remove гребень мягко под ультрачистая вода. Храните гель на + 4 градусов.
      Паузы точки. Гель может храниться при + 4 ° c на несколько дней. Геля должны храниться в влажных условиях во избежание высыхания поверхности геля и колодцы.

2. тилакоид солюбилизация1,2,3

Примечание: Все шаги должны выполняться под очень тусклый свет. Храните образцы и буферы на льду.

  1. Разбавьте изолированных тилакоидов с ледяной 25BTH20G буфер для окончательного хлорофилл концентрации 1 мг/мл. Для 2D-BN-SDS-PAGE анализ примерно 4-8 мкг хлорофилла / образец подходит.
    Примечание: Тилакоиды, используемых в экспериментах должны быть изолированы от свежих листьев (для протокола тилакоидов изоляции, см3)
  2. Добавить равный объем моющего средства буфера, т.е. 2% β-DM (w/v) или 2% digitonin (w/v). Осторожно перемешать моющего средства для тилакоидов образца с кончиком пипетки и избежать воздушных пузырей. Конечная концентрация моющего средства — 1% и что тилакоидов 0,5 мг Chl/мл.
    1. Солюбилизировать последнего тилакоидов 2 мин на льду (β-DM) или 10 минут на RT с непрерывной нежный смешивания на Рокер/шейкер (digitonin).
      Примечание: Digitonin и β-DM обычно используются для солюбилизация белковых комплексов в тилакоидной. Если используются другие неионных моющих средств, концентрации моющего средства и время солюбилизация должны быть сначала оптимизированы. Обычно диапазон концентрации моющего средства от 0,5% - 5% (v/v).
      Предупреждение: Digitonin это токсичные, носите защитную одежду и перчатки
  3. Удалите insolubilized материал центрифугированием на 18,000 x g для 20 минут, на + 4 градусов.
  4. Супернатант передать новой 1,5 мл трубки и добавить 1/10 (v/v) CBB буфера выборки.
    Примечание: Когда рассматривается общий состав тилакоидной мембраны белковых комплексов, определения урожайности и представлены тилакоидов домен растворимых фракций рекомендуется. Чтобы определить доходность растворимых материалов, принять 5 мкл супернатант новой трубки (перед добавлением CBB) и измерить содержание хлорофилла и Chl / b коэффициент5.

3.2,1,BN-страница3

  1. Настройка гель для системы вертикального электрофореза (например, 250 SE Хофер). Заполните палата верхней буфера с голубой катод буфера (см. таблицу 1) и залить Анодный буфер в нижнюю палату буфера.
  2. Загрузить тилакоидов выборки (например, 5 мкг хлорофилла) в скважинах.
  3. Электрофорез и постепенно увеличивайте напряжение: напряжение 75 В течение 30 мин, 100 V 30 мин, 125 V 30 мин, V 1 h 150 и 175 V до комплексов были разделены полностью. Запустите геля на + 4˚C, либо с помощью холодной комнате или корректировке температуры гель с системой охлаждения.
    Примечание: Измените буфере синий катод ясно катод буфер когда образец фронт мигрировало около одной трети от геля.
  4. После электрофореза запуска сканирования гель с photoscanner для архивирования изображений.

4. 2D-SDS-PAGE

  1. Соберите систему вертикального электрофореза (гель размер 16 x 20 см). Используйте прокладки 1 мм.
  2. Подготовьте стандартные геля SDS (12% акриламида, 6 M мочевины, рецепт см. в таблице 2) с 2D-гребень (одной большой хорошо для газа и один стандартный хорошо для маркер молекулярного веса).
  3. Вырежьте полосу от БН гель и поместите его в трубу (5 мл). Добавить 2 мл буфер Лэмли (содержащие 5% β-меркаптоэтанол) и инкубировать газа для 45 мин с нежным встряхивания на RT.
  4. Поместите полосу, с помощью например, распорки, поверх геля, избегая пузырьков воздуха.
  5. Накапайте 5 мкл маркер молекулярного веса на узкий кусок фильтровальной бумаги и место бумаги к стандарту хорошо.
  6. Для герметизации полосы BN-гель и маркер бумаги, залить сверху полосе гель агарозы 0,5% (в снаряженном буфера) и позволяют укрепить.
  7. Провести электрофорез по стандартным протоколам. После электрофореза, визуализируйте белки с например, пятно Sypro Ruby или серебряный пятнать по6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Представительной системы 2D-BN/SDS-PAGE в Рисунок 1 демонстрирует разделение digitonin и белковых комплексов в тилакоидной β-DM-солюбилизирован и их состав Субблок подробные белка. Сложный узор Белки тилакоидов digitonin солюбилизирован (горизонтальные лари на верхней части верхней части рис. 1A) содержит PSII-LHCII-PSI Мегакомплекс, два больших PSII-LHCII supercomplexes (sc), ПСИ-LHCII supercomplex, PSI мономера (м), PSII м/Cyt b6f, слабо связанными (L)-тример LHCII (рис. 1A). Немного сильнее моющего средства, β-DM, solubilizes весь тилакоидной мембраны (горизонтальные лари на вершине рис. 1B), но не может сохранить слабого взаимодействия между белковых комплексов. Солюбилизация тилакоид с β-DM обычно производит четыре supercomplexes PSII-LHCII (с разным количеством LHCII антенны прилагается), PSII димер (d) и PSI м АТФазы, PSII и Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII и LHCII мономера (рис. 1B). В отличие от β-DM digitonin производит только незначительные количества LHCII мономера. Сложный узор белка может отличаться в зависимости от подверженности растений в различных условиях освещения и также могут отличаться между мутантных линий, поскольку комплекс взаимодействий протеина динамический и зависит от т.е. фосфорилирование белков. Гели SDS-PA ниже полосы родной гель в Рисунок 1 A и B представляют собой состав полипептидных каждый комплекс белков первоначально солюбилизирован с digitonin или β-DM.

Figure 1
Рисунок 1. Двумерный BN-страница/SDS-страница Arabidopsis тилакоидов. Белковых комплексов в тилакоидной солюбилизирован с (A) 1% digitonin и (B) 1% β-DM и сначала разделенных 1D-BN-страница (полос сверху) и впоследствии на 2D-SDS-PAGE для демонстрации отдельных белка состав каждого комплекса. Благодаря инкубации BN-полоски с денатурации буфер Лэмли белковых субъединиц каждого комплекса (в полосе млрд) отделить и отделены в вертикальной линии во время 2D-SDS-PAGE. Идентификация белка основывается на анализе масс-спектрометрии, представлены в ссылки7,,8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Буфер Содержание Комментарии
3,5 гель акриламида (АА) BN разделения % (T) 48% АА, 1,5% бис AA: 148 мкл
3xGel буфера: 700 мкл
Глицерин 75% (w/v): 140 мкл
Сверхчистый H2O: 1092 мкл
5% APS: 15 МКЛ
TEMED 3 МКЛ
Примечание: Акриламид является нейротоксичным. Добавление APS и TEMED непосредственно перед использованием. Рецепт является достаточным для литья один небольшой млрд лари.
12,5 гель акриламида (АА) BN разделения % (T) 48% АА, 1,5% бис AA: 530 мкл
3xGel буфера: 700 мкл
Глицерин 75% (w/v): 560 мкл
Сверхчистый H2O: 290 мкл
5% APS: 11 МКЛ
TEMED 2ΜL
Примечание: Акриламид является нейротоксичным. Добавление APS и TEMED непосредственно перед использованием. Рецепт является достаточным для литья один небольшой млрд лари.
Гель акриламида (АА) BN укладки 3% (T) AA на 20%, 5% бис AA: 180 мкл
3xGel буфера: 500 мкл
Сверхчистый H2O: 800 мкл
5% APS: 30 МКЛ
TEMED 3 МКЛ
Примечание: Акриламид является нейротоксичным. Добавление APS и TEMED непосредственно перед использованием. Рецепт является достаточным для одной небольшой млрд лари.
3 x гель буфера 1.5 М ACA
150 мм BisTris/HCl (рН 7,0)
Хранить при + 4 градусов.
CBB буфер 100 мм BisTris/HCl (рН 7,0) 0,5 М ACA
Сахароза 30% (w/v)
50 мг/мл Serva синий G
Хранить при + 4 ° c
Анодный буфер 50 мм BisTris/HCl (рН 7,0) Хранить при + 4 градусов. Буфер может быть подготовлен как 10 x Стоковый раствор
Катод буфер 50 мм Трицин
15 мм BisTris
0.01% Serva синий G
Хранить при + 4 градусов. Буфер может быть подготовлен как 10 x Стоковый раствор, добавить краситель решение 1 x
25BTH20G 25 мм BisTris/HCl (рН 7,0)
Глицерин 20% (w/v)
0,25 мг/мл Pefabloc (добавить свежие)
10 мм NaF (добавить свежие)
Буфер может быть подготовлен как 2 X Стоковый раствор (хранить при + 4 ° c), но добавить Pefabloc и NaF свеже
Стиральный порошок буфер 2% β-додецил maltoside/Digitonin (w/v)
25 мм BisTris/HCl (рН 7,0)
20% (w/v) глицерина и
0,25 мг/мл Pefabloc (добавить свежие из Стоковый раствор)
10 мм NaF (добавить свежие)
Моющие средства могут быть подготовлены как 5-10% акций решения (в воде). Если используются другие моющие средства, конечной концентрации моющего средства должен быть оптимизированы.

Таблица 1. Буферы и решения для родной гель-электрофорез

Буфер Содержание Комментарии
Буфер Лэмли 138 мм трис/HCL рН 6,8
6M мочевины
22,2 глицерин % (v/v)
4,4% SDS
Ссылка: 9
12% акриламида, 6M мочевины SDS разделение геля 50% AA, 1,33% бис AA: 10,5 мл
20% SDS: 0,7 мл
1.5 М трис-HCl (рН 8,8): 8.05 мл
Мочевины: 12.6 г
MQ-H2O: 6.16 мл
10% APS: 200 МКЛ
TEMED 28 МКЛ
Примечание: Акриламид является нейротоксичным. Рецепт подходит для литья один большой SDS-гель.
6% акриламида, 6M мочевины SDS укладка гель 50% AA, 1,33% бис AA: 1,2 мл
20% SDS: 0,2 мл
0.5 М трис-HCl (рН 6,8): 2,5 мл
Мочевины: 3.6 г
MQ-H2O: 3.45 мл
10% APS: 100 МКЛ
TEMED 10 МКЛ
Примечание: Акриламид является нейротоксичным.
SDS работает буфер 19 мм трис
2.5 мм глицин
0.01% SDS

Таблица 2. Буферы для 2D-SDS-страницы

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Механизм преобразования фотосинтетической энергии состоит из крупных multisubunit белковых комплексов, которые внедряются в тилакоидной мембраны. Этот протокол описывает основной метод для анализа растений тилакоидов белковых комплексов от Arabidopsis thaliana с БН-страницы в сочетании с 2D-SDS-PAGE. Протокол также подходит для анализа тилакоидов белковых комплексов от табака и шпинат Тилакоиды, но может потребоваться небольшие корректировки.

Для солюбилизация мембраны белковых комплексов неионогенные моющие средства обычно используются для их способности сохранить комплексов в их родной форме. Здесь были применены два часто используемых моющих β-DM и digitonin. Додециловый maltoside solubilizes отдельных белковых комплексов, тогда как digitonin может использоваться для анализа более сложных сборок белков10. Громоздкие структурированной digitonin не подходят для плотно прижаты Грана разделов и поэтому solubilizes только не прижаты районы тилакоидной мембраны3,11. Поэтому он подходит для анализа стромы тилакоидов и Грана поля. Однако когда digitonin используется совместно с Аминокапроновая кислота (ACA), комбинация solubilizes весь тилакоидной мембраны, включая также прижаты Грана тилакоидов12. Через механизм неизвестного ACA позволяет digitonin иметь доступ к секции разрыв между смежными Грана мембраны слои. Важно отметить, что digitonin сохраняет лабильной взаимодействия белковых комплексов и поэтому может использоваться для анализа лабильной белка супер- и мегакомплексов, которые являются наиболее распространенными в регионах не прижаты тилакоидов8. Необходимо отметить, что моющие средства всегда вмешиваться с некоторыми из лабильных взаимодействия белковых комплексов, и поэтому это не представляется возможным отделить полностью нетронутыми сети белковых комплексов. Некоторые из комплексов являются диссоциации продуктов, которые были отсоединены от больших белка сложных ассоциаций во время тилакоидов солюбилизация и электрофорез. Качество BN-страница разделения зависит не только на подготовку образца (комплекс солюбилизация белка), но и на качество изоляции тилакоидов, что должно быть сделано из свежих листьев. Если особое внимание не будет принято, PSII-LHCII supercomplexes обычно ухудшить течение солюбилизация β-DM.

BN-страница поддерживает целостность растворимых белковых комплексов. Разделение потенциала млрд лари зависит от акриламида градиент, и градиент должен быть оптимизирован на основе комплексов протеина интереса. Поры геля полиакриламида может быть изменен путем изменения градиента концентрации (всего акриламида концентрации, T) или регулируя бис- акриламид концентрации (C) относительно общего количества мономеров акриламида4. BN-PA гель градиент, используемый здесь оптимизирован и хорошо подходит для анализа больших белка супер - и мегакомплексов3. Важно отметить, что размер пор штабелируя гель должен быть большим, чтобы разрешить все комплексы ввести разделение геля. После белка комплекс разделения с БН-страницы, состав или структуры каждой группы комплекс индивидуальных белков могут быть далее проанализированы. Для структурного анализа белка комплекса интереса должны быть этого eluted от геля и наиболее лабильным комплексы могут быть уничтожены во время элюции. Таким образом градиент плотности сахарозы чаще используется для сложных очищение протеина структурного анализа. Для анализа спектральные свойства белковых комплексов в геле ясно родной страница должны использоваться вместо BN-страницы, так как краска Кумасси вмешивается в такие измерения. Для анализа состава Субблок белковых комплексов денатурируя 2D-SDS-PAGE описано здесь. Подразделения каждого комплекса отделены в вертикальной линии и может быть легко идентифицирован. Стоит отметить, что некоторые белки могут присутствовать в одном месте и субблоки на одной вертикальной линии могут принадлежать отдельные комплексы совместно мигрируют в БН-страницы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Это исследование было финансовой поддержке Академии Финляндии (номера проектов 307335 и 303757) и солнечной энергии биомассы (SE2B) Марии Склодовской-Кюри Грант соглашение (675006). Протокол основан на ссылка3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter