Summary
Un protocolo para la aclaración de planta tilacoides proteína compleja organización y composición con poliacrilamida nativa azul gel electroforesis (BN-PAGE) y 2D-SDS-PAGE se describe. El protocolo está optimizado para Arabidopsis thaliana, , pero puede ser utilizado para otras especies de plantas con modificaciones menores.
Abstract
Cadena de transferencia de electrones fotosintética (ETC) convierte energía solar en energía química en forma de NADPH y ATP. Cuatro grandes complejos integrados en la energía solar de la cosecha la membrana del thylakoid para conducir electrones del agua al NADP+ a través de dos fotosistemas y el gradiente del protón creada para la producción de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) y ATPasa son todos los complejos de multiproteínas con distinta orientación y dinámica de la membrana del thylakoid. Puede obtenerse información valiosa sobre la composición e interacciones de los complejos de proteína en la membrana del thylakoid solubilizando los complejos de la integridad de la membrana por detergentes suaves, seguidos por separación electroforética gel nativo de la complejos. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método analítico utilizado para la separación de complejos de proteína en su forma nativa y funcional. El método puede ser utilizado para la purificación de complejos de proteínas para análisis estructural más detallado, pero también proporciona una herramienta para analizar las interacciones dinámicas entre los complejos de proteína. El método fue desarrollado para el análisis de los complejos respiratorios mitocondriales, pero desde entonces ha optimizado y mejorado para la disección de los complejos de proteína de tilacoides. Presentamos un protocolo actualizado detallado para el análisis de los complejos fotosintéticos lábil y sus interacciones en Arabidopsis thaliana.
Introduction
Grande multisubunit proteína complejos fotosistema PSI y PSII, Cyt b6f y ATPasa coordinan la producción de NADPH y de ATP en las reacciones de luz fotosintéticas. En cloroplastos de plantas superiores, los complejos se encuentran en la membrana del thylakoid, que es una estructura de membrana estructuralmente heterogéneo, compuesto por Appresso grana y tilacoides de estroma no appressed. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método ampliamente utilizado en el análisis de complejos de grande multisubunit proteína en su forma natural y biológicamente activo. El método se estableció para la disección de la membrana mitocondrial proteínas complejos1, pero más tarde se ha personalizado para la separación de complejos de la proteína de la membrana de tilacoides red3. El método es adecuado (i) para la purificación de complejos proteicos de tilacoides individuales para análisis estructural, (ii) para determinar las interacciones nativas entre complejos de la proteína y (iii) para el análisis de la organización general de los complejos de la proteína a cambio de señales ambientales.
Antes de la separación, complejos de la proteína están aislados de la membrana con cuidada detergentes no iónicos, que son generalmente leves y preservar la estructura de los complejos de la proteína nativa. Los detergentes contienen hidrófobos y sitios hidrofílicos y micelas estable forma por encima de cierta concentración, llamada concentración micelar crítica (CMC). Aumento de la concentración de detergente sobre los resultados de la CMC en la interrupción de las interacciones lípido lípido y en la solubilización de complejos de la proteína. La elección del detergente depende la estabilidad de la proteína de interés y de la capacidad de solubilización del detergente. Detergentes usados habitualmente son α/β-dodecil-maltoside y digitonin. Después de la solubilización de complejos de proteína en su estado nativo, material insoluble se elimina por centrifugación. En las plantas superiores, la membrana del thylakoid es altamente heterogénea en la estructura y algunos detergentes (por ejemplo, digitonin) solubilizan selectivamente sólo una fracción específica de la membrana3. Por lo tanto, para caracterizar la organización compleja de la proteína o las interacciones entre los complejos de proteínas, es crucial determinar siempre la capacidad de solubilización del detergente solicitada por determinar el contenido de clorofila y la clorofila a/b proporción de sobrenadante para evaluar el rendimiento y el dominio mentionada tilacoides (sub), respectivamente, de la fracción solubles. La relación clorofila a/b en tilacoides intacto de luz de crecimiento plantas aclimatadas es típicamente alrededor de 3, mientras que la chl un / b el valor de fracciones de tilacoides en grana enriquecido o tilacoides de estroma inferior (~ 2,5) o superior (~ 4.5) el valor del total tilacoides, respectivamente.
Para proporcionar carga negativa a los complejos de proteínas, colorante de (CBB) de azul brillante de Coomassie se agrega a la muestra solubilizada. Debido al cambio de carga, complejos de proteínas migran hacia el ánodo y se separan en un gradiente de acrilamida (AA) según su masa molecular y la forma. Eficaz y de alta resolución de la separación se logra utilizando un gradiente de concentración de acrilamida lineal. Durante la electroforesis, los complejos de proteínas migran hacia el ánodo hasta llegar a su límite de tamaño de poro de tamaño dependiente. El tamaño del poro del gel de poliacrilamida depende de (i) el total acrilamida /bis- acrilamida concentración (T) y (ii) en la vinculante bis- acrilamida monómero concentración (C) en relación con los monómeros total4. Después de la separación con la página de la BN, los complejos de proteína pueden subdividirse aún más en sus subunidades de la proteína individual por segunda dimensión (2D) - SDS - PAGE. Aquí, describimos un protocolo detallado para el análisis de complejos de la proteína de la membrana del thylakoid por BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparación de BN Gel1,2,3
- Configurar la rueda de gel con las placas de 8 x 10 cm (rectangular de vidrio y placa de alúmina con muescas) según instrucciones del fabricante utilizando a espaciadores de 0,75 mm.
- Poner un mezclador de gradiente sobre una placa de agitación y conectar con la bomba peristáltica por una tubería. Coloque una aguja de jeringa en el otro extremo de la tubería y colocar la aguja entre la placa de vidrio y aluminio. Agitador magnético de lugar a la "pesada" (H)-cámara.
- Preparar el 3,5% (v/v) y el 12,5% (v/v) soluciones de acrilamida (AA) en tubos de centrífuga cónico de 15 mL para el gradiente del gel de separación (ver recetas en el cuadro 1). Para evitar la polimerización prematura Mantenga los tubos de la centrífuga en el hielo mientras se preparan las soluciones.
PRECAUCIÓN: La acrilamida es guantes y ropa protectora neurotóxico y cancerígeno, desgaste. - Añadir 5% APS y TEMED la derecha antes de pipetear las soluciones al mezclador de gradiente. Pipeta de la solución de 12,5% a la cámara de H.
- Quite las burbujas de aire del canal de conexión de la "luz" (L) y H-cámara abriendo la válvula que conecta las dos cámaras que permite la solución entrar a la cámara de L. Cierre la válvula y pipetee que los rastros de solución hacia H-cámara.
- Por último, pipeta de la solución 3.5% para la cámara de L.
- Encender el agitador magnético (la velocidad de la agitación no es crítica, pero debe asegurar una mezcla adecuada de las soluciones ligeras y pesadas), abrir las válvulas y del interruptor de la bomba peristáltica. Que las soluciones de gel fluya entre la placa de vidrio y el aluminio, el caudal debe ser aproximadamente 0,5 mL/min. La aguja debe estar por encima el líquido todo el tiempo, se puede conectar a la parte superior de la placa de cristal con una cinta.
- Cuando las cámaras H y L estén vacíos, llenarlos con agua ultrapura y agua a cubrir suavemente la superficie del gel. La polimerización del gel toma alrededor de 1-2 horas a TA.
- Preparar la solución de acrilamida del 3% (ver receta en la tabla 1) para el apilamiento de gel en RT. Pipetee el gel de apilamiento en la parte superior del gel polimerizado separación (antes de emitir el gel de apilamiento, retire el agua de la superficie del gel de sobreposición) y coloque un peine de gel muestra entre el vidrio y el aluminio la placa evitando las burbujas de aire.
- Dejar para polimerizar 30-60 min en RT. quitar el peine suavemente bajo el agua ultrapura. Guarde el gel en el ° c + 4.
Punto de pausa. El gel puede almacenarse a + 4 ° c por unos días. El gel se debe mantener en condiciones de humedad para evitar que se sequen los pozos y la superficie del gel.
- Dejar para polimerizar 30-60 min en RT. quitar el peine suavemente bajo el agua ultrapura. Guarde el gel en el ° c + 4.
2. tilacoides solubilización1,2,3
Nota: Todas las medidas deben realizarse bajo luz muy tenue. Mantener las muestras y tampones en el hielo.
- Tilacoides aislados diluida con buffer 25BTH20G helada a una concentración de clorofila final de 1 mg/mL. Para análisis 2D-BN-SDS-PAGE aproximadamente 4-8 μg de clorofila muestra es adecuada.
Nota: Los tilacoides utilizadas en los experimentos deben estar aislada de las hojas frescas (para protocolo de aislamiento de tilacoides, ver3) - Añadir un volumen igual de buffer detergente, es decir, 2% β-DM (w/v) o 2% digitonin (w/v). Mezcle el detergente a la muestra de tilacoides suavemente con la punta de la pipeta y evitar burbujas de aire. La concentración final del detergente es 1% y la de los tilacoides 0.5 mg Chl/mL.
- Solubilizar los tilacoides por 2 min en hielo (β-DM) o 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla suave continuo en una mecedora shaker (digitonin).
Nota: Digitonin y β-DM se utilizan generalmente para la solubilización de complejos de proteína de tilacoides. Si se utilizan detergentes no iónicos, la concentración de detergente y el tiempo de solubilización deben optimizarse primero. Generalmente el concentración de detergente van de 0.5-5% (v/v).
PRECAUCIÓN: Digitonin es tóxico, llevar ropa protectora y guantes
- Solubilizar los tilacoides por 2 min en hielo (β-DM) o 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla suave continuo en una mecedora shaker (digitonin).
- Retire el material insolubilized por centrifugación a 18.000 x g por 20 min, a + 4 ° c.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL y añadir 1/10 (v/v) de tampón de enganche a la muestra.
Nota: Cuando se examina la composición general de los complejos de proteínas de membrana de tilacoides, determinar el rendimiento y el dominio de tilacoides mentionada de fracción solubilizado se recomienda. Para determinar el rendimiento del material solubilizado, tomar 5 μl del sobrenadante a un tubo nuevo (antes de agregar el CBB) y medir el contenido de Chl y Chl un / b cociente5.
3. BN-PAGE1,2,3
- Configurar el gel a un sistema de electroforesis vertical (por ejemplo, Hoefer SE 250). Llene la cámara de amortiguación superior con tampón de cátodo azul (ver tabla 1) y verter buffer ánodo a la cámara inferior del tampón.
- Carga de tilacoides muestra (por ejemplo, 5 μg de clorofila) en los pocillos.
- La electroforesis y aumente gradualmente la tensión: 75 V durante 30 minutos, 100 V durante 30 minutos, 125 V por 30 min, 150 V durante 1 h y 175 V hasta los complejos se han separado completamente. Correr el gel a + 4, uso de cuarto frío o ajustar la temperatura del gel con un sistema de refrigeración.
Nota: Cambiar el búfer del cátodo azul a un búfer de cátodo claro cuando el frente de la muestra ha emigrado cerca de un tercio del gel. - Después del análisis electroforético, escanear el gel con un escáner fotográfico de archivo de imagen.
4. 2D-SDS-PAGE
- Montar el sistema de electroforesis vertical (gel tamaño 16 cm x 20 cm). Usar a separadores de 1 mm.
- Preparación estándar del gel de SDS (12% de acrilamida, 6 M Urea, ver las recetas en el cuadro 2) con un peine de 2D (solo gran bien para la tira y bien estándar para el marcador de peso molecular).
- Cortar el carril de BN-gel y colocar en un tubo (5 mL). Añadir 2 mL de Tampón Laemmli (contiene 5% β-mercaptoetanol) e incubar a la franja de 45 min con agitación suave a TA.
- Coloque el carril, con la ayuda de por ejemplo, un separador, en la parte superior del gel, evitando burbujas de aire.
- Pipeta de 5 μl del marcador de peso molecular en una estrecha franja de papel de filtro y coloque el papel para el estándar bien.
- Para sellar la tira BN-gel y el papel del marcador, vierte agarosa 0.5% (en buffer de marcha) en la parte superior la tira de gel y dejar para solidificar.
- Realizar electroforesis según protocolos estándar. Después de la electroforesis, visualizar las proteínas con p. ej., tinción Sypro Ruby o coloración según6de plata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE en la figura 1 muestra la separación de digitonin y complejos de la proteína β-DM-solubilizado tilacoides y su composición de la subunidad de proteína detallada. El patrón complejo de proteína de digitonin solubilizado tilacoides (gel horizontal en la parte superior la parte superior de la figura 1A) contiene el PSII-LHCII-PSI megacomplex, dos grandes supercomplexes de PSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LHCII, monómero (m) de la PSI, PSII m/Cyt b6f, ligada (L)-trímero LHCII (figura 1A). El detergente ligeramente más fuerte, β-DM, solubiliza la membrana del thylakoid todo (gel horizontal en la parte superior figura 1B), pero es incapaz de conservar las interacciones débiles entre complejos de la proteína. Solubilización de tilacoides con β-DM produce típicamente cuatro supercomplexes de PSII-LHCII (con diferentes cantidad de antena LHCII conectada), dímero PSII (d) y PSI m, ATPasa, PSII m y Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII y LHCII monómero (figura 1B). A diferencia de la β-DM, digitonin produce sólo menor cantidad de monómero LHCII. El patrón complejo de proteína puede variar dependiendo de la exposición de la planta a diferentes condiciones de luz y también puede diferir entre las líneas mutantes, ya que las interacciones complejas de proteína son dinámicos y dependen de la fosforilación de la proteína , es decir . Geles de SDS-PA por debajo de las tiras de gel nativo en la figura 1 A y B representan la composición de polipéptido de cada complejo de la proteína solubilizada inicialmente con digitonin o β-DM.
Figura 1. Un bidimensional BN-PAGE/SDS-PAGE de tilacoides de Arabidopsis. Complejos de tilacoides proteína solubilizada con (A) 1% digitonin y (B) 1% β-DM y separaron primero por D 1-BN-PAGE (los carriles en la parte superior) y posteriormente en 2D-SDS-PAGE para demostrar la composición individual de proteínas de cada complejo. Debido a la incubación de las tiras de BN con Tampón Laemmli la desnaturalización, las subunidades de proteína de cada complejo (en la franja de BN) se disocian y se separan en una línea vertical en el 2D-SDS-PAGE. La identificación de proteínas se basa en el análisis de espectrometría de masas en referencias7,8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tampón de | Contenido | Comentarios |
| 3,5 gel de la acrilamida (AA) BN separación de % (T) | 48% AA, 1,5% bis-AA: 148 μl 3xGel Buffer: 700 μl glicerol del 75% (w/v): 140 μl Ultrapura H2O: 1092 μl 5% APS: 15 ΜL ΜL DE TEMED 3 |
Nota: La acrilamida es neurotóxica. Añadir APS y TEMED inmediatamente antes del uso. La receta es suficiente para lanzar un pequeño gel BN. |
| 12,5 gel de la acrilamida (AA) BN separación de % (T) | 48% AA, 1,5% bis-AA: 530 μl 3xGel Buffer: 700 μl glicerol del 75% (w/v): 560 μl Ultrapura H2O: 290 μl 5% APS: 11 ΜL TEMED 2ΜL |
Nota: La acrilamida es neurotóxica. Añadir APS y TEMED inmediatamente antes del uso. La receta es suficiente para lanzar un pequeño gel BN. |
| Gel de acrilamida (AA) BN apilado de 3% (T) | 20% AA, 5% bis-AA: 180 μl 3xGel Buffer: 500 μl Ultrapura H2O: 800 μl 5% APS: 30 ΜL ΜL DE TEMED 3 |
Nota: La acrilamida es neurotóxica. Añadir APS y TEMED inmediatamente antes del uso. La receta es suficiente para un pequeño gel BN. |
| 3 x buffer Gel | 1.5 ACA DE M 150mM BisTris/HCl (pH 7.0) |
Tienda a + 4 ° c. |
| Buffer CBB | 100 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 0,5 M ACA 30% (p/v) de sacarosa Serva de 50 mg/ml azul G |
Tienda a + 4 ° c |
| Buffer de ánodo | 50 mM BisTris/HCl (pH 7.0) | Tienda a + 4 ° c. Buffer se puede preparar solución stock de 10 x |
| Buffer de cátodo | 50 mM tricino 15 mM BisTris Serva de 0.01% azul G |
Tienda a + 4 ° c. Buffer puede ser preparado como 10 x solución, añadir el colorante a la solución 1 x |
| 25BTH20G | 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0) glicerol al 20% (w/v) 0.25 mg/ml Pefabloc (agregar recién) 10 mM NaF (agregar recién) |
Buffer puede ser preparado como 2 X solución stock (almacén a + 4 ° c), pero añadir Pefabloc y NaF recién |
| Tampón de detergente | 2% β-dodecyl maltoside/Digitonin (w/v) 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0) glicerol al 20% (p/v) y 0.25 mg/ml Pefabloc (agregar recién a partir de la solución stock) 10 mM NaF (agregar recién) |
Detergentes pueden prepararse como soluciones 5-10% (en agua). Si se utilizan detergentes, la concentración final de detergente debe ser optimizado. |
Tabla 1. Buffers y soluciones para la electroforesis nativa
| Tampón de | Contenido | Comentarios |
| Tampón Laemmli | pH de 138 mM Tris/HCL 6.8 Urea de 6 M 22.2% (v/v) de glicerol 4.4% SDS |
Referencia: 9 |
| 12% de acrilamida, gel de la separación de 6M Urea SDS | 50% AA, 1,33% bis-AA: 10,5 mL SDS 20%: 0,7 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8): mL 8,05 Urea: 12,6 g MQ-H2O: mL 6,16 APS 10%: 200 ΜL ΜL DE TEMED 28 |
Nota: La acrilamida es neurotóxica. La receta es conveniente para un gel de SDS grandes del bastidor. |
| 6% acrilamida, gel de Urea SDS apila de 6M | 50% AA, 1.33% bis-AA: 1,2 mL 20% SDS: 0,2 mL 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8): 2,5 mL Urea: 3,6 g MQ-H2O: mL 3,45 APS 10%: 100 ΜL ΜL DE TEMED 10 |
Nota: La acrilamida es neurotóxica. |
| Tampón de correr de SDS | 19 mM Tris 2,5 mM glicina 0.01% SDS |
Tabla 2. Tampones para 2D-SDS-PAGE
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El mecanismo de conversión de energía fotosintética está compuesto por complejos de grande multisubunit proteína, que se incrustan en la membrana de los tilacoides. Este protocolo describe un método básico para el análisis de los complejos de proteína de tilacoides plantas de Arabidopsis thaliana con BN-PAGE junto con 2D-SDS-PAGE. El protocolo también es adecuado para el análisis de los complejos de la proteína del thylakoid de tilacoides tabaco y espinacas, pero puede necesitar pequeños retoques.
Para la solubilización de complejos de proteínas de membrana, detergentes no iónicos se usan por su capacidad para preservar los complejos en su forma nativa. Aquí, se aplicaron dos detergentes utilizado β-DM y digitonin. Maltoside Dodecyl solubiliza complejos individuales, mientras que digitonin puede ser utilizado para el análisis de los más grandes conjuntos complejos de proteína10. Lo voluminoso digitonin estructurado es incapaz de adaptarse a las particiones de grana firmemente appressed y solubiliza por lo tanto, sólo las regiones no Appresso del thylakoid membrana3,11. Por lo tanto es adecuado para el análisis de los márgenes de estroma tilacoides y grana. Sin embargo, cuando digitonin se utiliza junto con el ácido aminocaproico (ACA), la combinación solubiliza la membrana del thylakoid toda, incluyendo también la de tilacoides de grana Appresso12. A través de un mecanismo desconocido, el ACA permite digitonin tener acceso a la brecha de partición entre las capas de la membrana adyacente de grana. Importante, digitonin conserva lábiles interacciones entre complejos de la proteína y por lo tanto puede ser utilizado para el análisis de proteínas lábiles super y megacomplexes, que son más abundantes en los tilacoides no Appresso regiones8. Debe ser observado que detergentes siempre interfieren con algunas de las interacciones lábiles entre los complejos de proteína y por lo tanto no es posible aislar completamente intacto red de complejos de la proteína. Algunos de los complejos son productos de la disociación que han sido desconectados de grandes asociaciones complejas de proteína durante la solubilización de los tilacoides y la electroforesis. La calidad de la separación de BN-PAGE depende no sólo en la preparación de la muestra (solubilización complejos de proteínas), sino también en la calidad del aislamiento de tilacoides, que se debe hacer de hojas frescas. Si no se tiene especial cuidado, los supercomplexes de PSII-LHCII típicamente degradan durante la solubilización de la β-DM.
BN-PAGE mantiene la integridad de los complejos de proteínas solubilizadas. La capacidad de separación del gel BN depende del gradiente de acrilamida, y el gradiente debe ser optimizado basada en los complejos de la proteína de interés. El tamaño del poro del gel de poliacrilamida se puede modificar cambiando el gradiente de concentración (concentración total de acrilamida, T) o ajustando la bis- acrilamida concentración (C) en relación con la cantidad total de acrilamida monomers4. El gradiente de gel BN PA utilizado aquí es optimizado y muy adecuado para el análisis de proteína grande super y megacomplexes3. Lo importante, tamaño del poro del gel de apilamiento debe ser grande para permitir que todos los complejos entrar en el gel de separación. Después de proteína compleja separación con BN-PAGE, la composición o estructura de cada banda complejos de proteínas individuales puede ser analizada aún más. Para el análisis estructural de la proteína complejo de interés debe ser eluido del gel y más lábiles complejos pueden ser destruidos durante la elución. Por lo tanto, la gradiente de densidad de sacarosa más a menudo se utiliza para la purificación complejos de proteínas para análisis estructural. Para el análisis de las propiedades espectroscópicas de los complejos de proteína en el gel, la página de claro-nativo se debe usar en lugar de página de la BN, ya que el tinte Coomassie interfiere con tales medidas. Para el análisis de la composición de subunidades de los complejos de proteínas, desnaturalización 2D-SDS-PAGE se describe aquí. Las subunidades de cada complejo se separan en una línea vertical y pueden ser fácilmente identificadas. Debe tenerse en cuenta que varias proteínas pueden estar presentes en un solo punto y que pertenezcan a las subunidades de la misma línea vertical para separar complejos Co migrar en BN-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada financieramente por la Academia de Finlandia (números de proyecto 307335 y 303757) y la energía Solar en convenio de subvención de biomasa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). El protocolo se basa en la referencia3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
