Summary
本文介绍了用蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 和2维 SDS 页对植物囊体蛋白复合组织和成分进行澄清的一种协议。该协议是对拟南芥的优化, 但可以用于其他植物物种的小修改。
Abstract
光合电子传递链 (等) 将太阳能转化为化学能和 ATP 的形式。四大蛋白复合物嵌入囊体膜收获太阳能, 以驱动电子从水到 NADP+ 通过两个-高等植物, 并使用创建的质子梯度生产 ATP。光系统 ii PSII, PSI, 细胞色素 b6f (Cyt b6f) 和 atp 酶是所有复合配合物, 具有明显的方向和动力学在囊体膜。用温和洗涤剂将复合物从膜的完整性中溶出, 然后用本机凝胶电泳分离, 可获得有关类囊体膜中蛋白质复合物组成和相互作用的宝贵信息。配合 物。蓝色本机聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 是一种分析方法, 用于分离蛋白质复合物在其本机和功能形式。该方法可用于蛋白质复合纯化, 更详细的结构分析, 但也提供了一种解剖蛋白质复合物间动态相互作用的工具。该方法是为分析线粒体呼吸蛋白复合物而开发的, 但从那时起对囊体蛋白复合物的解剖进行了优化和改进。在此, 我们提供了一个详细的最新的协议, 以分析不稳定的光合蛋白复合物及其相互作用的拟南芥。
Introduction
大 multisubunit 蛋白配合物光系统 ii PSI 和 PSII, Cyt b6f 和 atp 酶在光合光反应中协调和 atp 的生产。在高等植物叶绿体中, 复合物位于类囊体膜中, 它是一种结构上的异质膜结构, 包括贴伏粒和非贴伏基质类囊体。蓝原体聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 是一种广泛应用的方法, 用于分析大型 multisubunit 蛋白复合物的原生和生物活性形态。建立了线粒体膜蛋白配合物1的解剖方法, 但后来又自定义为分离出囊体膜网络3的蛋白质复合物。该方法适用于 (i) 纯化单个囊体蛋白复合物进行结构分析, (ii) 确定蛋白质复合体之间的本机相互作用和 (iii) 分析蛋白质复合物的整体组织在变化的环境线索。
在分离之前, 蛋白质复合体是从膜中分离出来的, 经过精心挑选的非离子洗涤剂, 一般都是温和的, 保存着蛋白质复合体的原生结构。洗涤剂含有疏水性和亲水性的场所, 形成稳定的胶束在一定浓度之上, 称为临界胶束浓度 (CMC)。增加在 CMC 以上的洗涤剂浓度, 导致脂质脂相互作用的破坏和蛋白质复合物的增溶。洗涤剂的选择取决于感兴趣的蛋白质复合体的稳定性和洗涤剂的增溶能力。常规使用的洗涤剂包括α/β-月桂-maltoside 和 digitonin。随着蛋白质复合物在其原生状态下的溶解, 不溶性物质被离心去除。在高等植物中, 囊体膜在结构上高度异, 某些洗涤剂 (如digitonin) 选择性地溶解了膜3的特定部分。因此, 要确定蛋白质复合组织的特征或蛋白质复合物之间的相互作用, 必须通过确定叶绿素含量和叶绿素 a/b 来测定所选洗涤剂的增溶能力。上清比对可溶性分数的产量和所代表的囊体 (子) 域分别进行评估。生长光驯化植物完整类囊体中叶绿素 a/b 的比值通常在3左右, 而在粒或基质中富集的类囊体分数的值低于 (~ 2.5) 或超过 (~ 4.5) 总的值类囊体, 分别。
为了向蛋白质复合体提供负电荷, 考马斯蓝 (CBB) 染料添加到可溶性样品中。由于电荷转移, 蛋白质复合物向阳极迁移, 并根据分子质量和形状在丙烯酰胺 (AA) 梯度上分离。采用线性丙烯酰胺浓度梯度, 实现了高效、高分辨率分离。在电泳过程中, 蛋白质复合体向阳极迁移, 直到达到其大小依赖性的孔隙大小限制。聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于 (i) 总丙烯酰胺/双丙烯酰胺浓度 (T) 和 (ii) 对交叉连接器双丙烯酰胺单体浓度 (C) 相对于总单体4。与 BN 页分离后, 蛋白质复合物可进一步细分为各自的蛋白质亚基, 第二维 (2 d)-SDS 页。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以分析的囊状体膜蛋白配合物的 BN-PAGE/2D-SDS-PAGE。
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Protocol
1. 制备 BN 凝胶1,2,3
- 根据制造商的说明使用0.75 毫米垫片, 设置8厘米 x 10 厘米板 (矩形玻璃和缺口氧化铝板) 的凝胶脚轮。
- 将渐变搅拌机放在搅拌板上, 用油管将其与蠕动泵连接。将注射器针连接到油管的另一端, 将针头放在玻璃和铝板之间。将磁力搅拌器放到 "重" (H) 室。
- 准备 3.5% (v/v) 和 12.5% (v/v) 丙烯酰胺 (AA) 溶液在15毫升锥形离心机管为分离凝胶梯度 (参见食谱在表 1)。为防止过早聚合, 在准备溶液时, 将离心管放在冰上。
注意: 丙烯酰胺是神经毒性和致癌物质, 穿戴防护服和手套。 - 在吹打渐变混合器的解决方案之前, 先添加5% 个 ap 和 TEMED。吸管12.5% 溶液的 H 室。
- 从连接 "光" (L) 和 H 室的通道中取出气泡, 方法是打开连接两个腔的阀门, 使溶液进入 L 室。关闭阀门, 吸管溶液的痕迹回 H 室。
- 最后, 吸管了3.5% 解的 L 室。
- 开关磁搅拌器 (搅拌速度不关键, 但应确保重和轻溶液的适当混合), 打开阀门和开关的蠕动泵。允许凝胶溶液在玻璃和铝板之间流动, 流量应约为0.5 毫升/分钟。针必须一直在液体的上方, 它可以用胶带附着在玻璃盘子的上部。
- 当 H 和 L 室清空后, 用超纯水填充, 并允许水轻轻地覆盖凝胶表面。凝胶聚合需要大约1-2 小时在 RT。
- 准备3% 丙烯酰胺溶液 (见表 1中的配方), 用于在 RT 上堆积凝胶. 吸管在聚合分离凝胶的顶部堆积凝胶 (在浇铸堆积凝胶之前, 去除水覆盖凝胶表面) 和放置一个样品凝胶梳子在玻璃和铝板之间避免气泡。
- 允许在 RT 聚合30-60 分钟. 在超纯水下轻轻取下梳子。将凝胶贮存在 +4 ˚C。
暂停点。凝胶可以储存在 +4 ˚C 几天。凝胶应保持在潮湿的条件, 以避免干燥的水井和凝胶表面。
- 允许在 RT 聚合30-60 分钟. 在超纯水下轻轻取下梳子。将凝胶贮存在 +4 ˚C。
2. 类囊体增溶1、2、3
注意: 所有步骤都应在非常昏暗的光线下执行。把样品和缓冲器放在冰上。
- 稀释孤立类囊体与冰冷25BTH20G 缓冲到最后的叶绿素浓度为1毫克/毫升。对于2维 BN-SDS 页面分析大约4-8 µg 叶绿素/样品是合适的。
注: 实验中使用的类囊体必须与新鲜的叶子分离 (对于囊体分离的协议, 见3) - 添加相同体积的洗涤剂缓冲液,即2% β DM (w/v) 或 2% digitonin (w/v)。用吸管尖轻轻地将洗涤剂与类囊体样品混合, 避免制造气泡。洗涤剂的最后集中是1% 和那类囊体0.5 毫克智利或 mL。
- 溶解类囊体为2分钟在冰 (β DM) 或10分钟在 RT 以连续的温和的混合在摇摆物或振动筛 (digitonin)。
注: Digitonin 和β DM 通常用于囊体蛋白复合物的增溶。如果使用其他非离子洗涤剂, 必须首先优化洗涤剂浓度和溶解时间。通常洗涤剂的浓度范围从 0.5%-5% (v/v)。
注意: Digitonin 有毒, 穿防护服和手套
- 溶解类囊体为2分钟在冰 (β DM) 或10分钟在 RT 以连续的温和的混合在摇摆物或振动筛 (digitonin)。
- 将 insolubilized 材料离心 1.8万 x 克, 20 分钟, +4 ˚C。
- 将上清液转移到新的1.5 毫升管, 并将 CBB 缓冲器的 1/10 (v/v) 添加到样品中。
注: 当检查类囊体膜蛋白配合物的整体组成时, 建议确定可溶性分数的产量和所代表的囊状体域。为了确定可溶性材料的收率, 将上清的5µL 到新管 (加入 CBB 之前), 测量叶绿素含量和叶绿素 a/b 比值5。
3. BN-页1,2,3
- 将凝胶设置为垂直电泳系统 (例如, Hoefer SE 250)。用蓝色阴极缓冲器填充上部缓冲腔 (见表 1), 并将阳极缓冲液倒入下部缓冲室。
- 加载类囊体样品 (例如, 5 µg 叶绿素) 进入水井。
- 开始电泳并逐步增加电压:75 V 为30分钟, 100 v 为30分钟, 125 v 为30分钟, 150 v 为 1 h 和 175 v, 直到复合体完全分离为止。在 + 4˚C 上运行凝胶, 或者使用冷室或用冷却系统调节凝胶温度。
注: 当样品前端迁移了大约三个凝胶时, 将蓝色阴极缓冲器更改为透明阴极缓冲器。 - 在电泳运行后, 用 photoscanner 扫描凝胶以进行图像存档。
4. 2 d-SDS 页
- 组装垂直电泳系统 (凝胶尺寸16厘米 x 20 厘米)。使用1毫米垫片。
- 准备标准 SDS 凝胶 (12% 丙烯酰胺, 6 M 尿素, 看见食谱在表 2) 与 2 d 梳子 (单大井为条和一个标准井为分子量标记)。
- 切断从 BN 凝胶的车道, 并把它放在一个 (5 毫升) 管。加入2毫升的 Laemmli 缓冲液 (含5% β巯基乙醇), 并在 RT 中进行温和摇动, 孵化45分钟的带状。
- 在胶圈的帮助下, 将车道放在一个隔板上, 避免气泡。
- 吸管5µL 分子量标记在一条狭窄的滤纸上, 将纸张放在标准井上。
- 要封住 BN 凝胶条和标记纸, 在凝胶条顶部倒入0.5% 琼脂糖 (在运行缓冲器中), 并允许凝固。
- 根据标准协议进行电泳。电泳运行后, 可视化的蛋白质, 如,正如人体细胞红宝石染色或银染色根据6。
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Representative Results
图 1中有代表性的2维 BN/SDS 页系统显示了 digitonin 和β-DM-可溶性囊体蛋白复合物的分离及其详细的蛋白质亚基组成。digitonin 可溶性类囊体的蛋白质复合模式 (图 1A顶部的水平凝胶) 包含 PSII LHCII-PSI megacomplex、两个大型 PSII LHCII supercomplexes (sc)、psi LHCII supercomplex、PSI 单体 (m)、PSII m/Cytb6f, 松散约束 (L)-LHCII 三聚体 (图 1A)。稍微强的洗涤剂, β DM, solubilizes 整个囊体膜 (水平的凝胶在图 1B的顶部), 但不能保持在蛋白质复合体之间的弱相互作用。用β DM 增溶的类囊体通常产生四 PSII-LHCII supercomplexes (附有不同数量的 LHCII 天线)、PSII 二聚体 (d) 和 PSI m、atp 酶、PSII m 和 Cytb6f、m LHCII、l-LHCII 和 LHCII 单体 (图 1B)。与β DM 不同, digitonin 只产生少量的 LHCII 单体。由于蛋白质复合作用是动态的, 依赖于即蛋白质磷酸化,蛋白质复合模式可能会因不同光照条件下的植物暴露而不同。在图 1 A 和 B 的本机凝胶条下面的 SDS-PA 凝胶代表了每个蛋白质复合体的多肽组成, 最初可溶性与 digitonin 或β DM。
图 1。拟南芥类囊体的二维 BN 页/SDS 页。囊体蛋白复合物可溶性与 (A) 1% digitonin 和 (B) 1% β DM 并且首先分离了 1 d BN 页 (在上面的车道) 和随后在 2 d-SDS 页显示每个复杂的各自的蛋白质构成。由于具有变性 Laemmli 缓冲的 BN 带的孵化, 每个复合体的蛋白质亚基 (在 bn 带) 离解, 并在2维 SDS 页的垂直线分离。蛋白质鉴定是基于质谱分析的参考文献7,8。请单击此处查看此图的较大版本.
| 缓冲区 | 内容 | 评论 |
| 3.5% (T) 丙烯酰胺 (AA) BN 分离凝胶 | 48% aa, 1.5% 双 aa: 148 µL 3xGel 缓冲器: 700 µL 75% (瓦特/v) 甘油: 140 µL 超纯 H2O: 1092 µL 5% APS:15 µL TEMED 3 µL |
注: 丙烯酰胺是神经毒性。在使用前立即添加 ap 和 TEMED。该配方是足够的铸造一个小 BN 凝胶。 |
| 12.5% (T) 丙烯酰胺 (AA) BN 分离凝胶 | 48% aa, 15% 双 aa: 530 µL 3xGel 缓冲器: 700 µL 75% (瓦特/v) 甘油: 560 µL 超纯 H2O: 290 µL 5% APS:11 µL TEMED 2µL |
注: 丙烯酰胺是神经毒性。在使用前立即添加 ap 和 TEMED。该配方是足够的铸造一个小 BN 凝胶。 |
| 3% (T) 丙烯酰胺 (AA) BN 堆积凝胶 | 20% aa, 5% 双 aa: 180 µL 3xGel 缓冲器: 500 µL 超纯 H2O: 800 µL 5% APS:30 µL TEMED 3 µL |
注: 丙烯酰胺是神经毒性。在使用前立即添加 ap 和 TEMED。该配方是足够的一个小 BN 凝胶。 |
| 3x 凝胶缓冲器 | 1.5M ACA 150mM BisTris/HCl (pH 7.0) |
存储在 + 4 ˚C。 |
| CBB 缓冲区 | 100毫米 BisTris/HCl (pH 7.0) 0.5 米 ACA 30% (w/v) 蔗糖 50毫克/毫升 Serva 蓝 G |
存储在 + 4 ˚C |
| 阳极缓冲器 | 50毫米 BisTris/HCl (pH 7.0) | 存储在 + 4 ˚C。缓冲器可作10x 库存解决方案 |
| 阴极缓冲器 | 50毫米 Tricine 15毫米 BisTris 0.01% Serva 蓝 G |
存储在 + 4 ˚C。缓冲器可作为10x 库存解决方案, 添加染料到1x 溶液中 |
| 25BTH20G | 25毫米 BisTris/HCl (pH 7.0) 20% (瓦特/v) 甘油 0.25 毫克/毫升 Pefabloc (新鲜添加) 10毫米 NaF (新鲜添加) |
缓冲器可以作为2X 库存解决方案 (存储在4˚C), 但添加 Pefabloc 和 NaF 新鲜 |
| 洗涤剂缓冲器 | 2% β-月桂 maltoside/Digitonin (w/v) 25毫米 BisTris/HCl (pH 7.0) 20% (w/v) 甘油和 0.25 毫克/毫升 Pefabloc (添加新鲜的股票解决方案) 10毫米 NaF (新鲜添加) |
洗涤剂可以作为5-10% 库存解决方案 (在水中)。如果使用其他洗涤剂, 最终的洗涤剂浓度必须进行优化。 |
表1。本机凝胶电泳的缓冲器及解决方案
| 缓冲区 | 内容 | 评论 |
| Laemmli 缓冲区 | 138毫米三/HCL pH 值6。8 6M 尿素 22.2% (v/v) 甘油 4.4% SDS |
参考: 9 |
| 12% 丙烯酰胺, 6M 尿素 SDS 分离凝胶 | 50% aa, 133% 双 aa: 10.5 毫升 20% SDS: 0.7 毫升 1.5 米三盐酸盐 (pH 8.8): 8.05mL 尿素: 12.6 克 MQ-H2O: 6.16 毫升 10% APS: 200 µL TEMED 28 µL |
注: 丙烯酰胺是神经毒性。该配方适用于铸造一个大的 SDS 凝胶。 |
| 6% 丙烯酰胺, 6M 尿素 SDS 堆积凝胶 | 50% aa, 1.33% 双 aa: 1.2 毫升 20% SDS: 0.2 毫升 0.5 米三盐酸 (pH 6.8): 2.5 毫升 尿素: 3.6 克 MQ-H2O: 3.45 毫升 10% APS: 100 µL TEMED 10 µL |
注: 丙烯酰胺是神经毒性。 |
| 部署缓冲区 | 19毫米三 2.5 毫米甘氨酸 0.01% SDS |
表2。2维-SDS 页的缓冲区
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Discussion
光合能量转换机械由大型 multisubunit 蛋白复合物组成, 嵌在囊体膜中。该协议描述了一个基本的方法来分析的植物囊体蛋白复合物从拟南芥与 2 d-SDS 页结合。该协议也适用于分析烟草和菠菜类囊体类囊体蛋白复合物, 但可能需要小的调整。
对于膜蛋白复合物的增溶, 非离子洗涤剂通常用于保存其原生形式的复合物的能力。这里使用了两种常用的洗涤剂β DM 和 digitonin。月桂 maltoside solubilizes 个体蛋白复合物, 而 digitonin 可用于分析较大的蛋白质复杂组件10。笨重的结构化 digitonin 无法适应严格贴伏粒分区, 因此 solubilizes 类囊体膜3,11的非贴伏区域。因此适合于分析基质类囊体和粒的边缘。然而, 当 digitonin 与ε-酸 (ACA) 一起使用时, 组合 solubilizes 整个囊体膜, 包括贴伏粒类囊体12。通过一个未知的机制, ACA 允许 digitonin 能够访问相邻粒膜层之间的分割间隙。重要的是, digitonin 保留蛋白质复合物之间的不稳定的相互作用, 因此可以用于分析不稳定的蛋白超级和 megacomplexes, 这是最丰富的非贴伏囊体区8。必须指出的是, 洗涤剂总是干扰蛋白复合物之间的一些不稳定的相互作用, 因此不可能分离完全完整的蛋白质复合体网络。其中一些配合物是分离产物, 在囊体增溶和电泳过程中与较大的蛋白质复合物的关联分离。BN 页分离的质量不仅取决于样品的制备 (蛋白质复合物的增溶性), 而且依赖于囊体分离的质量, 这必须从新鲜的叶子做起。如果不采取特殊护理, PSII-LHCII supercomplexes 通常会降低β DM 的增溶。
BN 页保持可溶性蛋白复合物的完整性。BN 凝胶的分离能力取决于丙烯酰胺的梯度, 而梯度应根据感兴趣的蛋白质复合物进行优化。聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小可以通过改变浓度梯度 (总丙烯酰胺浓度, T) 或调整双丙烯酰胺浓度 (C) 相对于丙烯酰胺单体的总用量4来进行修改。在这里使用的 BN-PA 凝胶梯度是最优化的, 很适合分析大蛋白超和 megacomplexes3。重要的是, 堆积凝胶的孔径必须大到允许所有的配合物进入分离凝胶。在蛋白质复合体与 BN 页分离后, 可以进一步分析各个蛋白质复合带的组成或结构。对于结构分析, 所需的蛋白质复合物必须从凝胶中洗脱, 并且在洗脱过程中可能会破坏最不稳定的络合物。因此, 蔗糖密度梯度更常用于蛋白质复合纯化的结构分析。为了分析凝胶中蛋白质复合物的光谱特性, 必须使用清晰本机页代替 BN 页, 因为考马斯染料会干扰这种测量。为了分析蛋白质复合体的亚单位组成, 本文介绍了变性 2 d-SDS 页。每个复合体的亚基在一条垂直线上分离, 可以很容易地识别出来。必须指出的是, 几种蛋白质可能存在于一个单一的地方, 同一垂直线上的亚基可能属于独立的复合体, 共同迁移在 BN 页。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了芬兰科学院 (项目编号307335和 303757) 和太阳能成生物量 (SE2B) 玛丽居里夫人-居里赠款协议 (675006) 的资助。该协议基于参考3。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
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