Summary
Un protocole pour l’élucidation de l’usine de thylakoïdes organisation complexe de protéines et la composition avec bleu natif polyacrylamide gel électrophorèse (BN-PAGE) et 2D-SDS-PAGE est décrite. Le protocole est optimisé pour l' Arabidopsis thaliana, , mais peut être utilisé pour d’autres espèces de plantes avec des modifications mineures.
Abstract
Chaîne de transfert d’électrons photosynthétiques (etc.) convertit l’énergie solaire en énergie chimique sous forme d’ATP et de NADPH. Quatre complexes de grandes protéines incorporées dans le thylakoïdes membrane récolte l’énergie solaire pour conduire des électrons de l’eau à NADP+ via deux photosystèmes, utilisez le gradient de protons créé pour la production d’ATP. Photosystème PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) et ATPase sont tous des complexes multiprotéiques avec orientation distincte et dynamique dans la membrane des thylakoïdes. On trouvera des informations précieuses sur la composition et les interactions entre les complexes de protéine dans la membrane des thylakoïdes par solubilisation des complexes de l’intégrité de la membrane par des détergents doux, suivies de la séparation par électrophorèse de gel natif du complexes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode d’analyse utilisée pour la séparation des complexes protéiques sous leur forme native et fonctionnelle. La méthode peut être utilisée pour la purification des protéines complexes pour l’analyse structurale plus détaillée, mais il fournit également un outil pour disséquer les interactions dynamiques entre les complexes de protéine. La méthode a été développée pour l’analyse des complexes de protéine respiratoire mitochondriale, mais depuis a été optimisée et améliorée pour la dissection des complexes protéine thylakoïdes. Ici, nous fournissons un protocole à jour détaillé pour l’analyse des complexes de protéine photosynthétique labile et leurs interactions chez Arabidopsis thaliana.
Introduction
Grandes sous-unités protéiques complexes photosystème PSI et PSII, Cyt b6f et ATPase coordonnent la production de NADPH et d’ATP dans les réactions photosynthétiques de lumière. Dans les chloroplastes de plantes supérieures, les complexes sont situés dans la membrane des thylakoïdes, qui est une structure de membrane structurellement hétérogène, composée de grana accollées et non accolées stroma thylakoïdes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode largement utilisée dans l’analyse des grandes sous-unités protéiques complexes dans leur forme native et biologiquement active. La méthode a été établie pour la dissection de la membrane mitochondriale protéine complexes1, mais plus tard a été personnalisée pour la séparation des complexes protéiques de la membrane thylakoïde réseau3. La méthode est appropriée (i) pour la purification de complexes protéiques thylakoïdes individuels pour l’analyse structurale, (ii) pour determiner natives interactions complexes protéiques et (iii) l’analyse de l’ensemble de l’Organisation des complexes protéiques sur l’évolution des signaux environnementaux.
Avant la séparation, complexes protéiques sont isolées de la membrane avec des détergents non ioniques soigneusement choisis, qui sont généralement bénins et de préserver la structure native des complexes protéiques. Détergents contiennent hydrophobes et hydrophiles sites et micelles stable forme au-dessus d’une certaine concentration, appelée une concentration micellaire critique (CMC). Augmentation de la concentration de détergent au-dessus des résultats de CMC dans la perturbation des interactions lipides-lipides et la solubilisation des complexes protéiques. Le choix du détergent dépend la stabilité de la protéine complexe d’intérêt et les capacités de solubilisation du détergent. Les détergents utilisés couramment sont α/β-dodécyl-maltoside et digitonine. Suite à la solubilisation des complexes de protéines dans leur état natif, matériel insoluble est enlevé par centrifugation. Chez les plantes supérieures, la membrane thylakoïde est hautement hétérogènes dans la structure et certains détergents (p. ex., la digitonine) solubilisent sélectivement seulement une fraction spécifique de la membrane3. Par conséquent, afin de caractériser l’organisation complexe de la protéine ou les interactions entre les complexes de protéine, il est essentiel de toujours déterminer les capacités de solubilisation du détergent choisi par la détermination de la teneur en chlorophylle et la chlorophylle a/b ratio de surnageant pour évaluer le rendement et le domaine représenté thylakoïdes (void), respectivement, de la fraction solubilisée. Le ratio de la chlorophylle a/b dans les thylakoïdes intacts des plantes acclimatées croissance-lumière est généralement autour de 3, alors que la chl un / valeur b des thylakoïdes fractions enrichies en grana ou stroma thylakoïdes inférieure (~ 2,5) ou est supérieure à la valeur du total (~ 4,5) les thylakoïdes, respectivement.
Pour fournir une charge négative pour les complexes de protéine, colorant (CBB) bleu brillant de Coomassie est ajoutée à l’échantillon solubilisé. En raison de l’évolution de la charge, des complexes de protéines migrent vers l’anode et sont séparés sur un gradient d’acrylamide (AA) selon leur masse moléculaire et de la forme. La séparation efficace et à haute résolution est obtenue en utilisant un gradient de concentration d’acrylamide linéaire. Lors de l’électrophorèse, les complexes de protéines migrent vers l’anode jusqu'à ce qu’ils atteignent leur limite de taille de pore dépendant de la taille. Dépend de la taille des pores du gel de polyacrylamide (i) l’acrylamide total / concentration debis- acrylamide (T) et (ii) sur la réticulant bis- acrylamide monomère concentration (C) par rapport à des monomères total4. Après la séparation avec BN-PAGE, les complexes de protéine peuvent être subdivisés en leurs sous-unités de protéine individuelle par seconde dimension (2D) - SDS - PAGE. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’analyse des complexes de protéine de membrane de thylakoid de BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. préparer le BN Gel1,2,3
- Mettre en place le lanceur de sorts de gel avec des plaques de 8 x 10 cm (verre rectangulaire et plaque d’alumine cranté) selon les instructions du fabricant à l’aide de cales d’espacement 0,75 mm.
- Placer une table de mixage dégradé sur une plaque de remuer et raccorder avec la pompe péristaltique par un tube. Attacher une aiguille de seringue à l’autre extrémité du tuyau et placez l’aiguille entre la plaque de verre et d’aluminium. Agitateur magnétique de place pour le « heavy » (H)-chambre.
- Préparer les 3,5 % (v/v) et 12,5 % (v/v) des solutions d’acrylamide (AA) dans des tubes à centrifuger coniques 15 mL pour le gradient de gel de séparation (voir la recette dans le tableau 1). Pour empêcher la polymérisation prématurée, garder les tubes à centrifuger sur glace tout en préparant les solutions.
ATTENTION : L’Acrylamide est neurotoxique et cancérigène, portez des vêtements protecteurs et gants. - Ajouter 5 % APS et TEMED droit avant de pipetage les solutions à la table de mixage dégradé. Pipette de la solution de 12,5 % à la chambre d’H.
- Enlever les bulles d’air du canal reliant la « lumière » (L) et H-chambre en ouvrant la vanne reliant les deux chambres permettant la solution entrer à la chambre de L. Fermer la vanne et la pipette que les traces de solution retour à H-chambre.
- Enfin, la solution de 3,5 % à la chambre de L pipette.
- Basculez sur l’agitateur magnétique (la vitesse de l’agitation n’est pas critique, mais il doit obtenir un bon mélange des solutions lourdes et légères), ouvrir les vannes et de mettre en marche la pompe péristaltique. Permettre les solutions gel de s’écouler entre la plaque de verre et l’aluminium, le débit devrait être à peu près 0,5 mL/min. L’aiguille doit être au-dessus du liquide tout le temps, il peut être attaché à la partie supérieure de la plaque de verre avec un ruban.
- Lorsque le H - et L-chambres sont vides, les remplir avec de l’eau ultrapure et laissez l’eau à superposer délicatement la surface du gel. La polymérisation du gel prend environ 1 à 2 heures à température ambiante.
- Préparer la solution à 3 % d’acrylamide (voir la recette dans le tableau 1) pour l’empilage de gel à RT. pipette le gel de concentration sur le dessus du gel de séparation polymérisé (avant de lancer le gel de concentration, retirez l’eau recouvrant la surface du gel) et placez un échantillon gel peigne entre les verre et l’aluminium plaque éviter bulles d’air.
- Laisser pour polymériser 30-60 min à RT. Remove le peigne doucement sous l’eau ultrapure. Stocker le gel à + 4 ° c.
Point de pause. Le gel peut être conservé à + 4 ° c pendant quelques jours. Le gel doit être conservé dans des conditions humides pour éviter l’assèchement des puits et la surface du gel.
- Laisser pour polymériser 30-60 min à RT. Remove le peigne doucement sous l’eau ultrapure. Stocker le gel à + 4 ° c.
2. thylakoïdes solubilisation1,2,3
Remarque : Toutes les étapes devraient être effectuées sous très faible éclairage. Conserver les échantillons et les tampons sur la glace.
- Diluer les thylakoïdes isolés avec tampon 25BTH20G glacée à une concentration de chlorophylle finale de 1 mg/mL. Pour l’analyse 2D-BN-SDS-PAGE à peu près 4-8 µg de chlorophylle / échantillon est approprié.
Remarque : Les thylakoïdes utilisés dans les expériences doivent être isolés à partir des feuilles fraîches (pour protocole d’isolement de thylakoïdes, voir3) - Ajouter un volume égal de détergent tampon, c'est-à-dire 2 % β-DM (p/v) ou 2 % digitonine (p/v). Mélanger le détergent à l’échantillon de thylakoïdes doucement avec le bout de la pipette et éviter de faire des bulles d’air. La concentration finale du détergent est de 1 % et celle des thylakoïdes 0,5 mg Chl/mL.
- Solubiliser les thylakoïdes pendant 2 min sur glace (β-DM) ou 10 minutes à RT avec un mélange doux continu sur un rocker/shaker (digitonine).
Remarque : La digitonine et β-SM sont généralement utilisés pour la solubilisation des complexes protéiques thylakoïdes. Si autres détergents non ioniques sont utilisés, la concentration du détergent et l’heure de solubilisation doivent être tout d’abord optimisés. Habituellement la plage de concentration de détergent de 0,5 à 5 % (v/v).
ATTENTION : La digitonine est toxique, portez des vêtements protecteurs et gants
- Solubiliser les thylakoïdes pendant 2 min sur glace (β-DM) ou 10 minutes à RT avec un mélange doux continu sur un rocker/shaker (digitonine).
- Retirez le matériau insolubilized par centrifugation à 18 000 x g pendant 20 min, à + 4 ° c.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajouter 1/10 (v/v) de tampon de CBB à l’échantillon.
Remarque : Quand on examine la composition globale des complexes de protéine membrane thylakoïde, déterminer le rendement et le domaine de thylakoïdes représenté de fraction solubilisée est recommandé. Pour déterminer le rendement du matériel solubilisé, prendre 5 µL de surnageant dans un nouveau tube (avant d’ajouter le CBB) et mesurer la teneur en Chl et Chl a / b ratio5.
3. BN-PAGE1,2,3
- Mettre en place le gel pour un système d’électrophorèse verticale (par exemple, 250 SE Hoefer). Remplir la chambre de mémoire tampon supérieure avec un tampon bleu cathode (voir tableau 1) et versez le tampon de l’anode à la chambre basse de la mémoire tampon.
- Charger l’échantillon de thylakoïdes (p. ex., 5 µg de chlorophylle) dans les puits.
- Commencez l’électrophorèse et augmentez graduellement la tension : 75 V pendant 30 min, 100 V pendant 30 min, 125 V pendant 30 min, 150 V pendant 1 h et 175 V jusqu'à ce que les complexes ont été complètement séparés. Exécutez le gel à + 4 ° c, soit à l’aide d’une chambre froide ou réglage de la température de gel avec un système de refroidissement.
Remarque : Changer le tampon bleu cathode dans un buffer de cathode clair lorsque le front de l’échantillon a migré à environ un tiers du gel. - Après la manche électrophorétique, scannez le gel avec un photoscanner pour l’archivage des images.
4. 2D-SDS-PAGE
- Assembler le système d’électrophorèse verticale (gel dimensions 16 cm x 20 cm). Utiliser des cales d’espacement 1 mm.
- Préparer standard gel SDS (12 % d’acrylamide, 6 M urée, voir recette dans le tableau 2) avec un peigne-2D (single grand bien pour la bande et un puits standard pour marqueur de poids moléculaire).
- Couper la voie de BN-gel et le placer dans un tube (5 mL). Ajouter 2 mL de tampon de Laemmli (contenant 5 % de β-mercaptoéthanol) et incuber la bande pendant 45 min avec agitant doucement à température ambiante.
- Placez la voie, avec l’aide de par ex., une entretoise, surface du gel en évitant les bulles d’air.
- Pipette 5 µL de marqueur de poids moléculaire sur une pièce de papier filtre et place le document à la norme bien étroite.
- Pour sceller la bande BN-gel et le papier de marqueur, verser 0,5 % d’agarose (dans la mémoire tampon en cours d’exécution) sur le dessus de la bande de gel et laisser pour solidifier.
- Effectuer l’électrophorèse conformément aux protocoles standards. Après exécution de l’électrophorèse, visualiser les protéines avec par exemple, tache Sypro Ruby ou coloration selon6à l’argent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un système représentatif de 2D-BN/SDS-PAGE à la Figure 1 illustre la séparation de la digitonine et complexes de protéine β-DM-solubilisée thylakoïdes et leur composition de sous-unité protéique détaillée. Le profil complexe protéique de thylakoïdes (gel horizontal en haut sur le dessus de la Figure 1 a) de la digitonine solubilisée contient la mégastructure PSII-LHCII-PSI, deux grandes supercomplexes de PSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LHCII, monomère lb/po2 (m), PSII m/Cyt f6b, faiblement lié (L)-trimère LHCII (Figure 1 a). Le détergent légèrement plus fort, la β-DM, solubilise la membrane thylakoïde ensemble (gel horizontal sur le dessus de la Figure 1 b), mais est incapable de préserver des interactions faibles entre les complexes protéiques. Solubilisation de thylakoïdes avec β-DM en général produit quatre supercomplexes PSII-LHCII (avec une quantité différente d’antenne LHCII attaché), dimère PSII (d) et PSI m, ATPase, PSII m et Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII et LHCII monomère (Figure 1 b). Contrairement aux β-DM, digitonine produit seulement faible quantité du monomère LHCII. Le modèle complexe de protéines peut être différent selon l’exposition des plantes à différentes conditions de luminosité et peut également différer entre lignées mutantes, étant donné les interactions complexes de protéine sont dynamiques et dépendent de la phosphorylation des protéines c'est-à-dire . Gels de SDS-PA sous les bandes de gel natif dans la Figure 1 A et B représentent la composition polypeptidique de chaque complexe de protéine solubilisée initialement avec la digitonine ou β-DM.
La figure 1. Une bidimensionnelle BN-PAGE/SDS-PAGE des thylakoïdes Arabidopsis. Thylakoïde complexes de protéine solubilisent avec (A) 1 % digitonine et (B) 1 % β-DM et séparant d’abord par 1D-BN-PAGE (les voies sur le dessus) et par la suite sur le 2D-SDS-PAGE à démontrer la composition en protéines individuelles de chaque complexe. En raison de l’incubation de BN-bandes avec tampon de Laemmli de dénaturation, les sous-unités de protéine de chaque complexe (dans la bande de BN) se dissocient et sont séparées dans une ligne verticale au cours de la 2D-SDS-PAGE. L’identification des protéines repose sur l’analyse de spectrométrie de masse présentée dans références7,8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Mémoire tampon | Contenu | Commentaires |
| 3,5 gel d’Acrylamide (AA) BN séparation de % (T) | AA 48 %, 1,5 % bis-AA : 148 µL 3xGel tampon : 700 µL 75 % (p/v) de glycérol : 140 µL Ultrapure H2o : 1092 µL 5 % APS : 15 ΜL TEMED 3 ΜL |
Remarque : L’Acrylamide est neurotoxique. Ajouter APS et TEMED immédiatement avant l’emploi. La recette est suffisante pour effectuer le cast un petit gel de BN. |
| 12,5 gel d’Acrylamide (AA) BN séparation de % (T) | AA 48 %, 1,5 % bis-AA : 530 µL 3xGel tampon : 700 µL 75 % (p/v) de glycérol : 560 µL Ultrapure H2o : 290 µL 5 % APS : 11 ΜL TEMED 2 |
Remarque : L’Acrylamide est neurotoxique. Ajouter APS et TEMED immédiatement avant l’emploi. La recette est suffisante pour effectuer le cast un petit gel de BN. |
| Gel d’Acrylamide (AA) BN empilement de 3 % (T) | AA 20 %, 5 % bis-AA : 180 µL 3xGel tampon : 500 µL Ultrapure H2o : 800 µL 5 % APS : 30 ΜL TEMED 3 ΜL |
Remarque : L’Acrylamide est neurotoxique. Ajouter APS et TEMED immédiatement avant l’emploi. La recette est suffisante pour un petit gel BN. |
| 3 x tampon Gel | 1,5 ACA M 150mM BisTris/HCl (pH 7,0) |
Conserver à + 4 ° c. |
| Tampon CBB | 100 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 0,5 M ACA saccharose 30 % (p/v) 50 mg/ml Serva bleu G |
Conserver à + 4 ° c |
| Tampon de l’anode | 50 mM BisTris/HCl (pH 7,0) | Conserver à + 4 ° c. Mémoire tampon peut se transformer en solution stock de 10 x |
| Tampon de cathode | 50 mM Tricine 15 mM BisTris 0,01 % Serva bleu G |
Conserver à + 4 ° c. Mémoire tampon peuvent être préparés comme 10 x solution mère, ajoutez le colorant à la solution de 1 x |
| 25BTH20G | 25 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 20 % (p/v) de glycérol 0,25 mg/ml Pefabloc (Ajouter fraîchement) 10 mM NaF (Ajouter fraîchement) |
Mémoire tampon peut être préparé comme 2 X solution mère (conserver à + 4 ° c), mais ajouter Pefabloc et NaF fraîchement |
| Tampon de détergent | 2 % β-dodecyl maltoside/digitonine (p/v) 25 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 20 % (p/v) de glycérol et 0,25 mg/ml Pefabloc (Ajouter fraîchement de la solution mère) 10 mM NaF (Ajouter fraîchement) |
Détergents peuvent se transformer en solutions mères de 5 à 10 % (en eau). Si les autres détergents sont utilisés, la concentration finale de détergent doit être optimisé. |
Le tableau 1. Tampons et solutions pour l’électrophorèse sur gel natif
| Mémoire tampon | Contenu | Commentaires |
| Tampon de Laemmli | 138 mM Tris/HCL, pH 6,8 Urée 6M 22,2 glycérol de % (v/v) 4,4 % SDS |
Référence : 9 |
| 12 % d’Acrylamide, gel de séparation de 6M urée SDS | 50 % AA, 1,33 % bis-AA : 10,5 mL 20 % SDS : 0,7 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) : 8,05 mL Urée : 12,6 g MQ-H2o : 6,16 mL APS 10 % : 200 ΜL TEMED 28 ΜL |
Remarque : L’Acrylamide est neurotoxique. La recette est adaptée pour effectuer le cast un grand gel SDS. |
| 6 % d’Acrylamide, 6M urée SDS Stacking gel | 50 % AA, 1,33 % bis-AA : 1,2 mL 20 % SDS : 0,2 mL 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) : 2,5 mL Urée : 3,6 g MQ-H2o : 3,45 mL APS 10 % : 100 ΜL TEMED 10 ΜL |
Remarque : L’Acrylamide est neurotoxique. |
| Tampon de SDS en cours d’exécution | 19 mM Tris 2,5 mM Glycine 0,01 % SDS |
Le tableau 2. Tampons pour 2D-SDS-PAGE
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les machines de conversion d’énergie photosynthétique sont composé de complexes de grandes sous-unités protéiques, qui sont incorporées dans la membrane des thylakoïdes. Ce protocole décrit une méthode de base pour l’analyse des complexes de protéine thylakoïdes plante Arabidopsis thaliana avec BN-PAGE combiné avec 2D-SDS-PAGE. Le protocole est également adapté pour l’analyse des complexes protéiques thylakoïdes des thylakoïdes du tabac et les épinards, mais pourrait nécessiter des petits ajustements.
Pour la solubilisation des complexes de protéines membranaires, les détergents non ioniques sont couramment utilisés pour leur capacité à préserver les complexes sous leur forme native. Ici, deux détergents courants β-DM et digitonine ont été appliqués. Dodécyl maltoside solubilise complexes de protéines individuelles, tandis que la digitonine peut être utilisée pour l’analyse des assemblages complexes de protéine plus10. La digitonine structurée volumineuse est incapable de s’adapter aux partitions grana étroitement accolées et solubilise donc seules les régions non accolées des membranes thylakoïdes3,11. Il est donc adapté pour l’analyse des marges de thylakoïdes et grana stroma. Toutefois, lorsque la digitonine est utilisée conjointement avec l’acide aminocaproïque (ACA), la combinaison solubilise la membrane thylakoïde entière, y compris aussi le grana apprimés thylakoïdes12. Par un mécanisme inconnu, ACA permet digitonine d’avoir accès à l’écart de la partition entre les couches de membrane grana adjacents. Ce qui est important, la digitonine préserve labiles interactions complexes protéiques et peut donc être utilisée pour l’analyse des protéines labiles super et megacomplexes, qui sont les plus abondants dans les régions non accolées thylakoïdes8. Il est à noter que les détergents toujours interfèrent avec certaines des interactions entre les complexes protéines labiles et il n’est donc pas possible d’isoler complètement intact réseau de complexes protéiques. Certains des complexes sont produits de dissociation qui ont été déconnectés de grandes associations complexes de protéine pendant la solubilisation de thylakoïdes et l’électrophorèse. La qualité de la séparation de la BN-PAGE repose non seulement sur la préparation de l’échantillon (solubilisation complexe de protéines), mais aussi sur la qualité de l’isolement de thylakoïdes, qui doit être fait de feuilles fraîches. Si on ne prend pas soin, les supercomplexes PSII-LHCII se dégradent généralement lors de la solubilisation de β-DM.
BN-PAGE maintient l’intégrité des complexes protéine solubilisée. La capacité de séparation du gel BN dépend du gradient de l’acrylamide, et la pente doit être optimisée basé sur les complexes de protéine d’intérêt. La taille des pores du gel polyacrylamide peut être modifiée en changeant le gradient de concentration (concentration d’acrylamide total, T) ou en ajustant la bis- acrylamide concentration (C) par rapport à la quantité totale de monomères de l’acrylamide4. Le gradient de gel BN-PA utilisé ici est optimisé et adapté pour l’analyse des protéines grande super - et megacomplexes3. Ce qui est important, pores du gel empilement doit être grande pour permettre à tous les complexes d’entrer au gel de séparation. Après la protéine complexe séparation avec BN-PAGE, la composition ou la structure de chaque bande de complexes de protéines individuelles peut être analysée plus loin. Pour l’analyse structurale des protéines complexes d’intérêt doit être élués du gel et plus labiles complexes peuvent être détruits pendant l’élution. Par conséquent, le gradient de densité de saccharose est plus souvent utilisé pour la purification de protéines complexes pour l’analyse structurale. Pour l’analyse des propriétés spectroscopiques des complexes protéiques dans le gel, la PAGE clear-native doit être utilisée au lieu de BN-PAGE, car le colorant bleu de Coomassie interfère avec ces mesures. Pour l’analyse de la composition de la sous-unité des complexes de protéine, une dénaturation 2D-SDS-PAGE est décrite ici. Les sous-unités de chaque complexe sont séparées dans une ligne verticale et peuvent être facilement identifiées. Il est à noter que plusieurs protéines peuvent être présents dans un seul endroit et les sous-unités dans la même ligne verticale peuvent appartenir pour séparer les complexes co migration dans BN-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par l’Académie de Finlande (numéros de projet 307335 et 303757) et l’énergie solaire dans la Convention de subvention de la biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Le protocole est basé sur la référence3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
