Summary
Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.
Abstract
Photosynthetische Electron Transfer Kette (usw.) wandelt Sonnenenergie in chemische Energie in Form von NADPH und ATP. Vier große Proteinkomplexe eingebettet in die Thylakoidmembran Membran Ernte Solarenergie Elektronen aus dem Wasser auf NADP+ über zwei photosysteme zu fahren, und die erstellten Proton Steigung für Produktion von ATP. Photosystem PSII, PSI, Cytochrom b6f (Cyt b6d) und ATPase sind alle Multi-komplexe mit eindeutigen Ausrichtung und Dynamik in der Thylakoidmembran Membran. Wertvolle Informationen über die Zusammensetzung und die Interaktionen der Proteinkomplexe in der Thylakoidmembran Membran erhalten Sie durch Gefäss-komplexe aus der Membran Integrität von Feinwaschmittel gefolgt von native Gel elektrophoretische Trennung von der -komplexe. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine analytische Methode für die Trennung der Proteinkomplexe in ihrer nativen und funktionale Form verwendet. Die Methode eignet sich für komplexe Proteinreinigung für genauere strukturelle Analyse, sondern es bietet auch ein Werkzeug, um die dynamischen Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu sezieren. Die Methode wurde entwickelt für die Analyse der mitochondrialen Atmung Proteinkomplexe, aber seitdem optimiert und verbessert für die Zerlegung der Thylakoidmembran Proteinkomplexe. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll auf dem neuesten Stand für die Analyse der labile photosynthetischen Proteinkomplexe und ihrer Wechselwirkungen in Arabidopsis Thaliana.
Introduction
Großen speziellen Protein-komplexe Photosystem PSI und PSII, Cyt b6f und ATPase koordinieren die Herstellung von NADPH und ATP in photosynthetischen Licht Reaktionen. In höheren Pflanzen Chloroplasten die komplexe in der Thylakoidmembran Membran befinden sich ein strukturell heterogenen Membran-Struktur, bestehend aus anliegenden Grana und nicht anliegenden Stroma Thylakoids. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine extensiv genutzte Methode bei der Analyse von großen speziellen Proteinkomplexe in ihrer nativen und biologisch aktive Form. Die Methode wurde für die Zerlegung des Mitochondrien-Membran-Protein-komplexe1, aber später für die Trennung von Proteinkomplexen aus der Thylakoidmembran Membran Netzwerk3angepasst wurde. Die Methode eignet sich (i) für die Reinigung der einzelnen Thylakoidmembran Proteinkomplexe für Baustatik, (Ii) zur Bestimmung der native Interaktionen zwischen Proteinkomplexe und (Iii) für die Analyse der Gesamtorganisation der Proteinkomplexe nach dem ändern ökologische Hinweise.
Vor der Trennung sind Proteinkomplexe isoliert von der Membrane mit sorgfältig ausgewählten nichtionische Reinigungsmitteln, die in der Regel mild und bewahren die native Struktur der Protein-komplexe. Waschmittel enthalten hydrophoben und hydrophilen Seiten und Form stabilen Micellen ab einer gewissen Konzentration genannt eine kritische Mizellen Konzentration (CMC). Erhöhung der Waschmittel Konzentration über den CMC-Ergebnissen in Störungen der Lipid-Lipid-Interaktionen und die Solubilisierung von Proteinkomplexen. Die Wahl des Waschmittels hängt von der Stabilität des Proteins von Interesse und die Solubilisierung Kapazität des Waschmittels. Routinemäßig verwendeten Reinigungsmittel sind α/β-Dodecyl-maltosid und Digitonin. Im Anschluss an die Solubilisierung Proteinkomplexe in ihrem nativen Zustand wird unlöslichen Material durch Zentrifugieren entfernt. In höheren Pflanzen die Thylakoidmembran Membran ist sehr heterogene Struktur und einige Reinigungsmittel (z. B. Digitonin) anderweitig selektiv nur einen bestimmten Bruchteil der Membran3. Um die Protein-komplexe Organisation oder die Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu charakterisieren, ist es daher entscheidend, die Solubilisierung Kapazität des gewählten Waschmittels bestimmen Sie immer durch die Bestimmung der Chlorophyllgehalt und Chlorophyll A/b Verhältnis der überstand den Ertrag und die vertretenen Thylakoidmembran (Sub) Domain bzw. der solubilized Fraktion bewerten. Das Chlorophyll A/b-Verhältnis in intakten Thylakoids Wachstum-Licht gewöhnt Pflanzen ist in der Regel etwa 3, während die Chl ein / b-Wert der Thylakoidmembran Fraktionen bereichert entweder in Grana oder Stroma Thylakoids (~ 2,5) unterschreitet oder überschreitet (~ 4,5) den Wert des gesamten Thylakoids, beziehungsweise.
Um negative Ladung, die Proteinkomplexe zu bieten, wird die solubilized Beispiels Coomassie brillianter blau (CBB) Farbstoff hinzugefügt. Durch die Verschiebung kostenlos Proteinkomplexe in Richtung Anode Wandern und auf einer Steigung von Acrylamid (AA) entsprechend ihrer molekularen Masse und Form getrennt sind. Effektive und hochauflösende Trennung wird mithilfe einer linearen Acrylamid Konzentration Steigung erreicht. Während der Elektrophorese Wandern die Proteinkomplexe in Richtung der Anode bis sie ihre größenabhängige Porengröße Grenze erreichen. Die Porengröße der Polyacrylamid-Gel hängt (i) die gesamte Acrylamid /BIZAcrylamid - Konzentration (T) und (Ii) auf den Vernetzer bis- Acrylamid monomerkonzentration (C) im Verhältnis zu den gesamten Monomere4. Nach der Trennung mit BN-Seite können die Proteinkomplexe weiter durch die zweite Dimension (2D) - SDS - PAGE in ihre einzelnen Protein-Untereinheiten unterteilt werden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch BN-Seite/2D-SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung BN Gel1,2,3
- Richten Sie die Gel-Caster mit 8 x 10 cm-Platten (rechteckige Glas- und gekerbten Aluminiumoxid Platte) nach Herstellerangaben mit 0,75 mm spacer.
- Legen Sie einen Gradienten Mischer auf einen rühren Teller und verbinden Sie es mit der peristaltischen Pumpe durch ein Rohr. Das andere Ende des Schlauches eine Spritzennadel beimessen und die Nadel zwischen Glas und Aluminium Platte platzieren. Magnetrührer Ort zu "schwer" (H)-Kammer.
- Bereiten Sie die 3,5 % (V/V) und 12,5 % (V/V) Acrylamid (AA) Lösungen in 15 mL konische Zentrifuge Röhren für die Trennung Gel Steigung (siehe Rezepte in Tabelle 1). Zur Vermeidung von vorzeitigen Polymerisation halten Sie die Zentrifuge Rohre auf dem Eis während der Vorbereitung der Lösungen.
Achtung: Acrylamid ist neurotoxisch und krebserregend, schützende Kleidung und Handschuhe. - Fügen Sie 5 % APS und TEMED direkt vor dem pipettieren der Lösungen für den Farbverlauf Mixer hinzu. Pipettieren der 12,5 % Lösung für die H-Kammer.
- Der Kanal verbindet das "Licht" (L) und H-Kammer durch Öffnen des Ventils zwischen die beiden Kammern, so dass Lösung an die L-Kammer betreten entfernen Sie Luftblasen. Schließen Sie das Ventil und pipettieren, die die Spuren der Lösung zur H-Kammer zurück.
- Zu guter Letzt die 3,5 % ige Lösung an die L-Kammer pipettieren.
- Schalten Sie den Magnetrührer (die Geschwindigkeit der Aufregung ist nicht kritisch, aber sie sollten sicherstellen, richtige Mischung der schweren und leichten Lösungen), öffnen Sie die Ventile und Peristaltische Pumpe einschalten. Die Gel-Lösungen zwischen Glas und Aluminium Platte fließen lassen, den Durchfluß sollte etwa 0,5 mL/min. Die Nadel muss oberhalb der Flüssigkeit ständig, es kann in den oberen Teil der Glasplatte mit einem Band befestigt werden.
- Wenn die H und L-Kammern geleert haben, füllen sie mit Reinstwasser und lassen Sie Wasser sanft die Geloberfläche überlagern. Die Gel-Polymerisation dauert etwa 1-2 Stunden bei RT
- Bereiten Sie die 3 % Acrylamid-Lösung (siehe Rezept in Tabelle 1) für das Stapeln gel bei RT pipettieren stapelnde Gel auf das polymerisierte Trennung Gel (vor dem Gießen des stapelnden Gels, entfernen Sie das Wasser, die Überlagerung der Geloberfläche) und legen Sie einen Probe Gel Kamm zwischen Glas und Aluminium Platte Vermeidung von Luftblasen.
- 30-60 min bei RT. entfernen Sie den Kamm sanft unter Reinstwasser polymerisieren lassen. Speichern Sie das Gel bei + 4 ° c.
Pausenpunkt. Das Gel kann ein paar Tage bei + 4 ° c aufbewahrt werden. Das Gel sollte in den feuchten Bedingungen zu vermeiden, Trocknen von den Brunnen und die Geloberfläche gehalten werden.
- 30-60 min bei RT. entfernen Sie den Kamm sanft unter Reinstwasser polymerisieren lassen. Speichern Sie das Gel bei + 4 ° c.
(2) Thylakoidmembran Solubilisierung1,2,3
Hinweis: Unter sehr schwachem Licht sollten alle Schritte durchgeführt werden. Halten Sie Proben und Puffer auf Eis.
- Isolierte Thylakoids mit eiskalten 25BTH20G Puffer zu einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von 1 mg/mL zu verdünnen. Für 2D-BN-SDS-PAGE-Analyse etwa 4 bis 8 µg des Chlorophylls / Probe eignet.
Hinweis: Die Thylakoids, die in den Experimenten verwendet muss von frischen Blätter (für Protokoll der Thylakoidmembran Isolation, siehe3) isoliert werden. - Fügen Sie ein gleiches Volumen an Waschmittel Puffer, d. h. 2 % β-DM (w/V) oder 2 % Digitonin (w/V). Mischen Sie das Waschmittel in die Thylakoidmembran Probe vorsichtig, mit der Spitze pipettieren und verhindern Sie, dass Luftblasen. Die letztendliche Konzentration des Reinigungsmittels ist 1 % und der Thylakoids 0,5 mg Chl/mL.
- Lösen Sie die Thylakoids für 2 min auf Eis (β-DM) oder 10 min bei RT mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einer Wippe/Shaker (Digitonin).
Hinweis: Digitonin und β-DM sind in der Regel für die Solubilisierung der Thylakoidmembran Proteinkomplexe verwendet. Wenn andere nicht-ionische Reinigungsmittel verwendet werden, müssen die Waschmittel Konzentration und die Solubilisierung Zeit zunächst optimiert werden. In der Regel die Waschmittel Konzentrationsbereich zwischen 0,5 % und 5 % (V/V).
Achtung: Digitonin ist giftig, tragen Sie schützende Kleidung und Handschuhe
- Lösen Sie die Thylakoids für 2 min auf Eis (β-DM) oder 10 min bei RT mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einer Wippe/Shaker (Digitonin).
- Entfernen Sie das insolubilized Material durch Zentrifugation bei 18.000 x g für 20 min bei + 4 ° c.
- Übertragen Sie den überstand auf eine neue 1,5 mL Tube und fügen Sie 1/10 (V/V) von CBB Puffer zur Probe.
Hinweis: Bei der Prüfung der Gesamtkomposition der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe Bestimmung der Ertrag und die vertretenen Thylakoidmembran Domäne solubilisiert Fraktion empfiehlt. Um die Rendite des solubilized Materials zu bestimmen, nehmen Sie 5 µL des Überstands zu einem neuen Schlauch (vor dem Hinzufügen von CBB) und messen die Chl Inhalt und Chl eine / b-Verhältnis5.
(3) BN-Seite1,2,3
- Richten Sie das Gel zu einem vertikalen Elektrophorese-System (z. B. Hoefer SE 250). Die oberen Sperrkammer mit blauen Kathode Puffer füllen (siehe Tabelle 1) und Anode Puffer für das Unterhaus Puffer zu gießen.
- Thylakoidmembran Probe (z. B. 5 µg des Chlorophylls) in die Vertiefungen zu laden.
- Die Elektrophorese zu beginnen und schrittweise Erhöhung der Spannung: 75 V für 30 min, 100 V für 30 min, 125 V für 30 min, 150 V für 1 h und V 175 bis die komplexe wurden vollständig getrennt. Führen Sie das Gel bei + 4˚C, entweder mit einem kalten Raum oder Temperaturstellung Gel mit einem Kühlsystem.
Hinweis: Ändern des blauen Kathode Puffers auf einen klaren Kathode Puffer, wenn die Probe Front etwa ein Drittel des Gels migriert hat. - Scannen Sie nach dem elektrophoretischen Lauf das Gel mit einem Photoscanner für Bildarchivierung.
(4) 2D-SDS-PAGE
- Montieren Sie das vertikale Elektrophorese-System (Gel Größe 16 x 20 cm). Verwenden Sie 1 mm spacer.
- Bereiten Sie standard SDS-Gel (12 % Acrylamid, 6 M Harnstoff, Rezept siehe Tabelle2) mit einem 2D-Kamm (einzigen großen gut für den Strip und eine standard für Molekulargewicht Marker).
- Schneiden Sie die Spur von BN-Gel und legen Sie sie in einem Rohr (5 mL). Fügen Sie 2 mL Laemmli-Puffer (mit 5 % β-Mercaptoethanol) und inkubieren Sie den Streifen für 45 min mit sanft schütteln bei RT
- Legen Sie die Spur mit Hilfe von z. B. einen Spacer auf das Gel Luftblasen zu vermeiden.
- Pipettieren 5 µL Molekulargewicht Marker auf einem schmalen Stück Filterpapier und legen Sie das Papier auf den Standard gut.
- Zur Abdichtung der BN-Gel-Streifen und das Marker-Papier, 0,5 % Agarose (im laufenden Puffer) auf dem Gel-Strip Gießen und erstarren lassen.
- Durchführen Sie Elektrophorese nach Standardprotokollen. Nachdem die elektrophoretische ausgeführt, visualisieren Sie die Proteine mit z. B. Sypro Ruby Fleck oder Silber Färbung nach6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein repräsentatives 2D-BN/SDS-PAGE-System in Abbildung 1 zeigt die Trennung von Digitonin und β-DM-solubilisiert Thylakoidmembran Proteinkomplexe und ihre detaillierte Proteinzusammensetzung Untereinheit. Das Protein komplexe Muster der Digitonin solubilisiert Thylakoids (horizontale Gel oben auf der Spitze Figur 1A) enthält die PSII LHCII PSI Megacomplex, zwei große PSII LHCII Supercomplexes (sc), PSI-LHCII Supercomplex, PSI Monomer (m), PSII m/Cyt b6f, locker gebunden (L)-LHCII Trimer (Abbildung 1A). Die etwas stärkere Reinigungsmittel, β-DM solubilisiert die gesamte Thylakoidmembran Membran (horizontale Gel oben auf Abbildung 1 b), aber ist nicht in der Lage, schwachen Wechselwirkungen zwischen Proteinkomplexe zu bewahren. Thylakoidmembran Solubilisierung mit β-DM produziert in der Regel vier PSII LHCII Supercomplexes (mit unterschiedlichen Menge LHCII Antenne befestigt), PSII Dimer (d) und PSI m, ATPase, PSII m und Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII und LHCII Monomer (Abbildung 1 b). Im Gegensatz zu β-DM produziert Digitonin nur geringe Menge an LHCII Monomer. Das Protein komplexe Muster kann je nach Pflanze Exposition gegenüber verschiedenen Lichtbedingungen und unterscheiden auch zwischen mutierten Zeilen, da die Protein-komplexen Wechselwirkungen dynamisch und abhängig von z.B. Protein Phosphorylierung sind. SDS-PA Gele unter die native Gel-Streifen in Abbildung 1 A und B stellen die Polypeptid Zusammensetzung der einzelnen Proteinkomplex solubilisiert zunächst mit Digitonin oder β-DM.
Abbildung 1. Ein zweidimensionales BN-Seite/SDS-PAGE von Arabidopsis Thylakoidmembran. Thylakoidmembran Proteinkomplexe mit (A) 1 % Digitonin und (B) 1 % β-DM solubilisiert und zuerst durch 1D-BN-Seite (die Bahnen an der Spitze) und anschließend auf 2D-SDS-PAGE zeigen die einzelnen Proteinzusammensetzung von jeder Anlage getrennt. Durch die Inkubation von BN-Streifen mit Denaturierung Laemmli-Puffer die Protein-Untereinheiten von jeder Anlage (im BN-Streifen) distanzieren und sind während der 2D-SDS-PAGE in eine vertikale Linie getrennt. Die Proteinidentifikation basiert auf Massenspektrometrie Analyse in Referenzen7,8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Puffer | Inhalt | Kommentare |
| 3,5 % (T) Acrylamid (AA) BN Trennung gel | 48 % AA, 1,5 % BIZ-AA: 148 µL 3xGel Puffer: 700 µL 75 % (w/V) Glycerin: 140 µL Hochreine H2o: 1092 µL 5 % APS: 15 ΜL ΜL TEMED 3 |
Hinweis: Acrylamid ist neurotoxisch. APS und TEMED unmittelbar vor der Anwendung hinzufügen. Das Rezept ist ausreichend für das casting eine kleine BN-Gel. |
| 12,5 % (T) Acrylamid (AA) BN Trennung gel | 48 % AA, 1,5 % BIZ-AA: 530 µL 3xGel Puffer: 700 µL 75 % (w/V) Glycerin: 560 µL Hochreine H2o: 290 µL 5 % APS: 11 ΜL TEMED 2ΜL |
Hinweis: Acrylamid ist neurotoxisch. APS und TEMED unmittelbar vor der Anwendung hinzufügen. Das Rezept ist ausreichend für das casting eine kleine BN-Gel. |
| 3 % (T) Acrylamid (AA) BN Stapeln gel | 20 % AA, 5 % Bis-AA: 180 µL 3xGel Puffer: 500 µL Hochreine H2o: 800 µL 5 % APS: 30 ΜL ΜL TEMED 3 |
Hinweis: Acrylamid ist neurotoxisch. APS und TEMED unmittelbar vor der Anwendung hinzufügen. Das Rezept reicht für eine kleine BN-Gel. |
| 3 x Gel-Puffer | 1,5 M ACA 150mM BisTris/HCl (pH 7,0) |
Bei + 4 ° c. |
| CBB-Puffer | 100 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 0,5 M ACA 30 % (w/V) Saccharose 50 mg/ml Serva blau G |
Bei + 4 ° c |
| Anode Puffer | 50 mM BisTris/HCl (pH 7,0) | Bei + 4 ° c. Puffer kann als 10 X Stammlösung hergestellt werden |
| Kathode-Puffer | 50 mM Tricine 15 mM BisTris 0,01 % Serva blau G |
Bei + 4 ° c. Puffer kann wie 10 x Stammlösung vorbereitet, den Farbstoff der 1 X Projektmappe hinzufügen |
| 25BTH20G | 25 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 20 % (w/V) Glycerin 0,25 mg/ml Pefabloc (frisch hinzufügen) 10 mM NaF (frisch hinzufügen) |
Puffer kann vorbereitet werden, da 2 X Stammlösung (bei + 4 ° c), aber Pefabloc und NaF frisch hinzufügen |
| Waschmittel-Puffer | 2 % β-Dodecyl maltosid/Digitonin (w/V) 25 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 20 % (w/V) Glycerin und 0,25 mg/ml Pefabloc (frisch aus der Stammlösung hinzufügen) 10 mM NaF (frisch hinzufügen) |
Reinigungsmittel können als 5-10 % Stammlösungen (im Wasser) zubereitet werden. Wenn andere Reinigungsmittel verwendet werden, muss die Endkonzentration Waschmittel optimiert werden. |
Tabelle 1. Puffer und Lösungen für gebürtige Gelelektrophorese
| Puffer | Inhalt | Kommentare |
| Laemmli-Puffer | 138 mM Tris/HCL pH 6,8 6M Harnstoff 22,2 % (V/V) Glycerin 4,4 % SDS |
Referenz: 9 |
| 12 % Acrylamid, 6M Harnstoff SDS Trennung gel | 50 % AA, 1,33 % BIZ-AA: 10,5 mL 20 % SDS: 0,7 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8): 8,05 mL Harnstoff: 12,6 g MQ-H2o: 6,16 mL 10 % APS: 200 ΜL ΜL TEMED 28 |
Hinweis: Acrylamid ist neurotoxisch. Das Rezept eignet sich für das casting eine große SDS-Gel. |
| 6 % Acrylamid, 6M Harnstoff SDS Stacking gel | 50 % AA, 1,33 % BIZ-AA: 1,2 mL 20 % SDS: 0,2 mL 0,5 M Tris-HCl (pH 6.8): 2,5 mL Harnstoff: 3,6 g MQ-H2o: 3,45 mL 10 % APS: 100 ΜL TEMED 10 ΜL |
Hinweis: Acrylamid ist neurotoxisch. |
| SDS laufen Puffer | 19 mM Tris 2,5 mM Glycin 0,01 % SDS |
Tabelle 2. Puffer für 2D-SDS-PAGE
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die photosynthetische Energie Umwandlung Maschinen besteht aus großen speziellen Proteinkomplexe, die in die Thylakoidmembran Membran eingebettet sind. Dieses Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode zur Analyse der Pflanze Thylakoidmembran Proteinkomplexe von Arabidopsis Thaliana mit BN-Seite zusammen mit 2D-SDS-PAGE. Das Protokoll eignet sich auch für die Analyse der Thylakoidmembran Proteinkomplexe aus Tabak und Spinat Thylakoids, aber kleine Anpassungen erfordern.
Für die Solubilisierung von Membran-Protein-komplexe sind nichtionische Detergentien allgemein für ihre Fähigkeit verwendet, um die komplexe in ihrer nativen Form zu bewahren. Hier wurden zwei häufig verwendete Reinigungsmittel β-DM und Digitonin angewendet. Dodecyl-maltosid solubilisiert einzelne Protein-komplexe, während Digitonin für die Analyse von größeren Protein komplexe Baugruppen10benutzt werden kann. Die sperrige strukturierte Digitonin ist nicht in der Lage, den eng anliegenden Grana Partitionen passen und deshalb solubilisiert nur nicht anliegenden Regionen der Thylakoidmembran Membran3,11. Es eignet sich deshalb für die Analyse von Stroma Thylakoids und Grana Margen. Jedoch wenn Digitonin zusammen mit Aminocapronsäure (ACA) verwendet wird, solubilisiert die Kombination die gesamten Thylakoidmembran Membran, darunter auch die anliegenden Grana Thylakoids12. Durch einen unbekannten Mechanismus ermöglicht ACA Digitonin Zugriff auf die Partition-Lücke zwischen benachbarten Grana Membran Schichten haben. Wichtig ist, Digitonin labile Interaktionen zwischen Proteinkomplexe bewahrt und kann daher verwendet werden, für die Analyse der labile Protein Super und Megacomplexes, die am häufigsten in die Thylakoidmembran nicht anliegenden Regionen8sind. Beachten ist, dass Waschmittel immer einige der labilen Interaktionen zwischen der Proteinkomplexe stören und daher es nicht möglich ist, völlig intakten Netzwerk von Proteinkomplexen isolieren. Einige der Anlagen sind Dissoziation Produkte, die von größeren Protein Komplex Verbände während der Thylakoidmembran Solubilisierung und die Elektrophorese getrennt wurden. Die Qualität der Trennung BN-Seite richtet sich nicht nur auf die Probenvorbereitung (Protein Komplex Solubilisierung), sondern auch auf die Qualität der Thylakoidmembran Isolierung, die aus frischen Blättern erledigt werden müssen. Wenn nicht geachtet wird, beeinträchtigt die PSII LHCII Supercomplexes in der Regel während β-DM Solubilisierung.
BN-Seite bewahrt die Integrität der solubilisiert Proteinkomplexe. Die Abscheideleistung des BN Gels hängt von der Acrylamid-Gradient und die Steigung sollten optimiert werden, basierend auf der Proteinkomplexe von Interesse. Die Porengröße der Polyacrylamid-Gel kann durch das Konzentrationsgefälle (total Acrylamid Konzentration, T) ändern oder Anpassen der BIZ- Acrylamid-Konzentration (C) bezogen auf die Gesamtmenge von Acrylamid Monomeren4geändert werden. Der BN-PA Gel Farbverlauf verwendet hier optimiert und gut geeignet für die Analyse von großen Protein Super und Megacomplexes3. Wichtig ist, muss Porengröße des stapelnden Gels groß, alle Anlagen, um die Trennung Gel einzugeben. Nach Protein kann komplexe Trennung mit BN-Seite, die Zusammensetzung oder Struktur der jedes einzelne Protein-komplexe-Band weiter analysiert werden. Für die Strukturanalyse der Protein Komplex von Interesse aus dem Gel eluiert werden muss und die labile komplexe während der Elution zerstört werden. Daher ist Saccharose dichtegradient öfter für komplexe Proteinreinigung für die Strukturanalyse verwendet. Für die Analyse der spektroskopischen Eigenschaften der Proteinkomplexe in das Gel muss klar-Native Seite anstelle BN-Seite verwendet werden, da solche Messungen der Farbstoff Coomassie stört. Für die Analyse der Untereinheit Zusammensetzung der Proteinkomplexe ist hier eine denaturierenden 2D-SDS-PAGE beschrieben. Die Untereinheiten von jeder Anlage sind in eine vertikale Linie getrennt und leicht erkennbar. Es muss darauf hingewiesen werden, dass mehrere Proteine an einem einzigen Ort anwesend sein können und die Untereinheiten in der gleichen vertikalen Linie können um komplexe Co Migration in BN-Seite zu trennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Academy of Finland (Projekt-Nummern 307335 und 303757) und Sonnenenergie in Biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung (675006) finanziell unterstützt. Das Protokoll basiert auf Referenz3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
