Summary
संयंत्र thylakoid प्रोटीन जटिल संगठन और ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-पेज) और 2d-एसडीएस-पृष्ठ के साथ संरचना के elucidation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । प्रोटोकॉल Arabidopsis थालियानाके लिए अनुकूलित है, लेकिन छोटे संशोधनों के साथ अंय प्रजातियों के पौधे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
संश्लेषक इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण श्रृंखला (आदि) NADPH और एटीपी के रूप में रासायनिक ऊर्जा के लिए सौर ऊर्जा धर्मांतरित । चार बड़े प्रोटीन परिसरों thylakoid झिल्ली फसल सौर ऊर्जा में एंबेडेड के लिए पानी से इलेक्ट्रॉनों ड्राइव करने के लिए NADP+ दो photosystems के माध्यम से, और एटीपी के उत्पादन के लिए बनाया प्रोटॉन ढाल का उपयोग करें । Photosystem PSII, साई, cytochrome बी6एफ (Cyt बी6एफ) और ATPase multiprotein झिल्ली में अलग अभिविंयास और गतिशीलता के साथ सभी thylakoid परिसरों हैं । संरचना और thylakoid झिल्ली में प्रोटीन परिसरों की बातचीत के बारे में बहुमूल्य जानकारी के देशी जेल electrophoretic जुदाई के बाद हल्के डिटर्जेंट द्वारा झिल्ली अखंडता से परिसरों solubilizing द्वारा प्राप्त किया जा सकता परिसरों. ब्लू देशी polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-पृष्ठ) एक विश्लेषणात्मक उनके मूल और कार्यात्मक रूप में प्रोटीन परिसरों की जुदाई के लिए इस्तेमाल किया विधि है । विधि प्रोटीन जटिल शोधन के लिए और अधिक विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी प्रोटीन परिसरों के बीच गतिशील बातचीत काटना करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है । विधि mitochondrial श्वसन प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया था, लेकिन बाद से अनुकूलित और thylakoid प्रोटीन परिसरों के विच्छेदन के लिए सुधार किया गया है । यहां, हम labile संश्लेषक प्रोटीन परिसरों और Arabidopsis थालियानामें उनकी बातचीत के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत अप-टू-डेट प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Introduction
बड़े multisubunit प्रोटीन परिसरों photosystem PSI और PSII, Cyt बी6एफ और ATPase NADPH प्रकाश प्रतिक्रियाओं में संश्लेषक और एटीपी के उत्पादन में समंवय । उच्च संयंत्र chloroplasts में, परिसरों thylakoid झिल्ली में स्थित हैं, जो एक संरचनात्मक रूप से विषम झिल्ली संरचना, appressed grana और गैर appressed स्ट्रोमा thylakoids शामिल है । ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-PAGE) अपने देशी और जैविक रूप से सक्रिय रूप में बड़े multisubunit प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के विश्लेषण में एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया विधि है । विधि mitochondrial झिल्ली प्रोटीन परिसरों के विच्छेदन के लिए स्थापित किया गया था1, लेकिन बाद में thylakoid झिल्ली नेटवर्क3से प्रोटीन परिसरों की जुदाई के लिए अनुकूलित किया गया है । विधि उपयुक्त है (मैं) संरचनात्मक विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत thylakoid प्रोटीन परिसरों की शुद्धि के लिए, (द्वितीय) प्रोटीन परिसरों और (iii) प्रोटीन परिसरों के समग्र संगठन के विश्लेषण के लिए के बीच देशी बातचीत का निर्धारण करने के लिए पर्यावरण cues बदलने पर ।
जुदाई से पहले, प्रोटीन परिसरों सावधानी से चुना ईओण डिटर्जेंट, जो आम तौर पर हल्के और प्रोटीन परिसरों की मूल संरचना की रक्षा कर रहे है के साथ झिल्ली से अलग कर रहे हैं । डिटर्जेंट hydrophobic और हाइड्रोफिलिक साइटों और एक निश्चित एकाग्रता के ऊपर फार्म स्थिर micelles होते हैं, एक महत्वपूर्ण micellar एकाग्रता (सीएमसी) कहा जाता है । लिपिड के विघटन में सीएमसी परिणामों के ऊपर डिटर्जेंट एकाग्रता में वृद्धि-लिपिड बातचीत और प्रोटीन परिसरों के solubilization में. डिटर्जेंट का चुनाव ब्याज की प्रोटीन परिसर की स्थिरता और डिटर्जेंट की solubilization क्षमता पर निर्भर करता है । नियमित रूप से इस्तेमाल किया डिटर्जेंट α/β-dodecyl-maltoside और digitonin शामिल हैं । उनके पैतृक राज्य में प्रोटीन परिसरों के solubilization के बाद, अघुलनशील सामग्री केंद्रापसारक द्वारा निकाल दिया जाता है । उच्च संयंत्रों में, thylakoid झिल्ली संरचना में अत्यधिक heterogenic है और कुछ डिटर्जेंट (जैसे, digitonin) चुनिंदा solubilize केवल झिल्ली3के एक विशिष्ट अंश । इसलिए, प्रोटीन जटिल संगठन या प्रोटीन परिसरों के बीच बातचीत को चिह्नित करने के लिए, यह हमेशा क्लोरोफिल सामग्री का निर्धारण करके चुना डिटर्जेंट की solubilization क्षमता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है और क्लोरोफिल a/ supernatant का अनुपात उपज और प्रतिनिधित्व thylakoid (उप) डोमेन, क्रमशः solubilized अंश का आकलन करने के लिए । क्लोरोफिल एक/विकास के बरकरार thylakoids में बी अनुपात-प्रकाश आदत संयंत्रों आम तौर पर 3 के आसपास है, जबकि chl thylakoid अंश का एक/बी मूल्य या तो grana या स्ट्रोमा thylakoids में नीचे गिर जाता है (~ २.५) या जादा (~ ४.५) कुल का मूल्य thylakoids, क्रमशः ।
प्रोटीन कॉंप्लेक्स के लिए नकारात्मक प्रभारी प्रदान करने के लिए, Coomassie प्रतिभाशाली नीले (CBB) डाई solubilized नमूना करने के लिए जोड़ा गया है । प्रभारी पाली के कारण, प्रोटीन परिसरों anode की ओर पलायन और एक acrylamide (एए) ढाल पर अपने आणविक द्रव्यमान और आकार के अनुसार अलग कर रहे हैं । प्रभावी और उच्च संकल्प जुदाई एक रैखिक acrylamide एकाग्रता ढाल का उपयोग करके हासिल की है । ट्रो के दौरान, प्रोटीन परिसरों anode की ओर पलायन जब तक वे अपने आकार निर्भर ताकना आकार सीमा तक पहुंचने । polyacrylamide जेल का ताकना-आकार पर निर्भर करता है (i) कुल acrylamide/बीआईएस-acrylamide एकाग्रता (टी) और (ii) क्रॉस-linker बीआईएसपर-acrylamide मोनोमर एकाग्रता (C) सापेक्ष कुल मोनोमर4. बीएन-पृष्ठ के साथ जुदाई के बाद, प्रोटीन परिसरों आगे दूसरे आयाम (2d) द्वारा अपने व्यक्तिगत प्रोटीन उपइकाईयों में विभाजित किया जा सकता है-एसडीएस-पृष्ठ । यहां, हम बीएन द्वारा thylakoid झिल्ली प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन-पृष्ठ/2d-एसडीएस-पृष्ठ ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. बीएन जेल की तैयारी1,2,3
- ०.७५ mm स्पेसर्स का उपयोग करते हुए निर्माता के निर्देशों के अनुसार 8 सेमी x 10 सेमी प्लेट्स (आयताकार ग्लास और पायदान्ड एल्यूमिना प्लेट) के साथ जेल कास्टर सेट करें ।
- एक हलचल प्लेट पर एक ढाल मिक्सर प्लेस और यह एक टयूबिंग द्वारा सिकुड़नेवाला पंप के साथ कनेक्ट । टयूबिंग के दूसरे छोर पर एक सिरिंज सुई देते हैं और कांच और एल्यूमीनियम प्लेट के बीच सुई जगह है. "भारी" (एच)-चैंबर के लिए चुंबकीय सरगर्मी प्लेस ।
- ३.५% (v/v) और १२.५% (v/v) acrylamide (AA) समाधान 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूबों में पृथक्करण जेल ढाल के लिए तैयार ( तालिका 1में व्यंजनों को देखें) । असामयिक बहुलकीकरण को रोकने के लिए, जबकि समाधान की तैयारी बर्फ पर केंद्रापसारक ट्यूबों रखो ।
सावधानी: Acrylamide neurotoxic और यलो है, सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनें । - ग्रेडिएंट मिक्सर के समाधानों को pipetting करने से पहले 5% अनुप और TEMED सही जोड़ें । प्लास्टिक एच-चैंबर को १२.५% समाधान ।
- "प्रकाश" (एल) को जोड़ने चैनल से हवा के बुलबुले को हटाने और एल-चैंबर में प्रवेश करने के लिए समाधान की अनुमति दो कक्षों को जोड़ने वाल्व खोलने के द्वारा एच चैंबर. वाल्व बंद करें और समाधान के निशान प्लास्टिक एच के लिए वापस चैंबर ।
- अंत में, प्लास्टिक एल चैंबर के लिए ३.५% समाधान ।
- चुंबकीय सरगर्मी पर स्विच (हलचल की गति महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन यह उचित भारी और प्रकाश समाधान के मिश्रण सुनिश्चित करना चाहिए), वाल्व खोलने और सिकुड़नेवाला पंप पर स्विच । जेल समाधान कांच और एल्यूमीनियम प्लेट के बीच प्रवाह करने की अनुमति दें, flowrate लगभग ०.५ मिलीलीटर होना चाहिए/ सुई तरल हर समय ऊपर होना चाहिए, यह एक टेप के साथ कांच की थाली के ऊपरी भाग के लिए संलग्न किया जा सकता है ।
- जब एच और एल चैंबर खाली कर दिया है, उंहें ultrapure पानी के साथ भरने और पानी धीरे जेल की सतह ओवरले के लिए अनुमति देते हैं । जेल बहुलकीकरण आरटी पर 1-2 घंटे के आसपास लेता है ।
- 3% acrylamide समाधान तैयार करें ( 1 तालिकामें देखें नुस्खा) RT. प्लास्टिक पर स्टैकिंग जेल के लिए स्टैकिंग जेल (स्टैकिंग जेल कास्टिंग से पहले, जेल की सतह ओवरले पानी को हटाने) और एक नमूना जेल कंघी की जगह पर stacking जेल के शीर्ष पर कांच और एल्यूमीनियम प्लेट हवा के बुलबुले से परहेज के बीच ।
- RT पर 30-60 मिनट polymerize करने के लिए अनुमति दें कंघी धीरे ultrapure पानी के तहत निकालें । + 4 ˚ C पर जेल का संग्रह ।
बिंदु रोकें । जेल कुछ दिनों के लिए + 4 ˚ सी पर संग्रहित किया जा सकता है । कुओं और जेल की सतह के सूखने से बचने के लिए जेल को नम परिस्थितियों में रखा जाना चाहिए ।
- RT पर 30-60 मिनट polymerize करने के लिए अनुमति दें कंघी धीरे ultrapure पानी के तहत निकालें । + 4 ˚ C पर जेल का संग्रह ।
2. Thylakoid Solubilization1,2,3
नोट: सभी कदम बहुत मंद प्रकाश के तहत किया जाना चाहिए । बर्फ पर नमूने और बफ़र्स रखें ।
- एक अंतिम क्लोरोफिल एकाग्रता के लिए बर्फ ठंडा 25BTH20G बफर के साथ अलग thylakoids पतला 1 मिलीग्राम/ 2d-बीएन-एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए मोटे तौर पर 4-8 µ जी का क्लोरोफिल/नमूना उपयुक्त है ।
नोट: प्रयोगों में इस्तेमाल किया thylakoids ताजा पत्तियों से अलग किया जाना चाहिए (thylakoid अलगाव के प्रोटोकॉल के लिए,3देखें) - डिटर्जेंट बफर की एक बराबर मात्रा जोड़ें, यानी, 2% β-डीएम (डब्ल्यू/वी) या 2% digitonin (डब्ल्यू/ प्लास्टिक टिप के साथ धीरे thylakoid नमूना को डिटर्जेंट मिश्रण और हवा के बुलबुले बनाने से बचें । डिटर्जेंट की अंतिम एकाग्रता 1% है और thylakoids ०.५ मिलीग्राम Chl/एमएल ।
- Solubilize बर्फ पर 2 मिनट के लिए thylakoids (β-डीएम) या एक झूली कुरसी पर लगातार कोमल मिश्रण के साथ आरटी पर 10 मिनट/
नोट: Digitonin और β-डीएम आम तौर पर thylakoid प्रोटीन परिसरों के solubilization के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । यदि अंय गैर ईओण डिटर्जेंट उपयोग किया जाता है, डिटर्जेंट एकाग्रता और solubilization समय पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए । आमतौर पर डिटर्जेंट एकाग्रता सीमा से 0.5%-5% (v/
चेतावनी: Digitonin विषाक्त है, सुरक्षात्मक कपड़े पहनते है और दस्ताने
- Solubilize बर्फ पर 2 मिनट के लिए thylakoids (β-डीएम) या एक झूली कुरसी पर लगातार कोमल मिश्रण के साथ आरटी पर 10 मिनट/
- १८,००० x g पर 20 मिनट के लिए, + 4 ˚ C पर केंद्रापसारक द्वारा insolubilized सामग्री निकालें
- supernatant एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और 1/10 (v/v) नमूने के लिए CBB बफ़र जोड़ें ।
नोट: जब thylakoid झिल्ली प्रोटीन परिसरों की समग्र संरचना की जांच की है, उपज का निर्धारण और solubilized अंश का प्रतिनिधित्व thylakoid डोमेन की सिफारिश की है । solubilized सामग्री की उपज निर्धारित करने के लिए, एक नई ट्यूब के लिए supernatant के 5 µ एल ले लो (CBB जोड़ने से पहले) और Chl सामग्री और Chl a/
3. बीएन-पेज1,2,3
- एक ऊर्ध्वाधर ट्रो प्रणाली के लिए जेल सेट (जैसे, Hoefer एसई २५०) । नीले कैथोड बफर के साथ ऊपरी बफर चैंबर भरें ( तालिका 1देखें) और कम बफर चैंबर के लिए anode बफर डालो ।
- कुओं में thylakoid नमूना (जैसे, क्लोरोफिल के 5 µ जी) लोड ।
- ट्रो शुरू करो और धीरे-धीरे वृद्धि वोल्टेज: ७५ वी के लिए 30 मिनट, १०० वी के लिए 30 मिनट, १२५ वी के लिए 30 मिनट, १५० वी के लिए 1 एच और १७५ वी जब तक परिसरों पूरी तरह से अलग किया गया है । + 4 ˚ सी पर जेल भागो, या तो एक ठंडा कमरे का उपयोग कर या एक शीतलन प्रणाली के साथ जेल के तापमान को एडजस्ट ।
नोट: एक स्पष्ट कैथोड बफर करने के लिए नीले कैथोड बफर बदलें जब नमूना सामने जेल की एक तिहाई के बारे में स्थानांतरित कर दिया है । - electrophoretic चलाने के बाद, छवि संग्रह के लिए एक photoscanner के साथ जेल स्कैन ।
4.2d-एसडीएस-PAGE
- ऊर्ध्वाधर ट्रो प्रणाली (जेल आकार 16 सेमी x 20 सेमी) इकट्ठा । 1 मिमी स्पेसिंग का उपयोग करें ।
- मानक एसडीएस जेल तैयार (12% acrylamide, 6 एम यूरिया, 2 तालिकामें नुस्खा देखें) एक 2d कंघी (एक अच्छी तरह से पट्टी और एक अच्छी तरह से आणविक वजन मार्कर के लिए मानक के लिए) के साथ ।
- बीएन जेल से लेन में कटौती और यह एक (5 मिलीलीटर) ट्यूब में जगह है । Laemmli बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें (5% β-mercaptoethanol युक्त) और आरटी पर कोमल मिलाते के साथ ४५ मिनट के लिए पट्टी की मशीन ।
- लेन प्लेस, जैसे, एक स्पेसर की मदद से, हवा बुलबुले से परहेज जेल के शीर्ष पर ।
- प्लास्टिक फ़िल्टर कागज के एक संकीर्ण टुकड़े पर आणविक वजन मार्कर के 5 µ एल और मानक अच्छी तरह से कागज जगह है ।
- बीएन जेल पट्टी और मार्कर कागज सील करने के लिए, जेल पट्टी के शीर्ष पर ०.५% agarose (बफर चल में) डालो और जमना के लिए अनुमति देते हैं ।
- मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रो निष्पादित करें । electrophoretic चलाने के बाद, उदाहरण के साथ प्रोटीन की कल्पना , Sypro रूबी दाग या6के अनुसार चांदी धुंधला ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एक प्रतिनिधि 2d-बीएन/एसडीएस-पृष्ठ सिस्टम में चित्र 1 digitonin और β-DM-solubilized thylakoid प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और उनके विस्तृत प्रोटीन उप इकाई संरचना की जुदाई प्रदर्शित करता है । digitonin solubilized thylakoids के प्रोटीन कॉम्प्लेक्स पैटर्न ( चित्रा 1aके शीर्ष पर शीर्ष पर क्षैतिज जेल) शामिल हैं PSII-LHCII-psi megacomplex, दो बड़े PSII-LHCII supercomplexes (sc), psi-LHCII supercomplex, psi मोनोमर (एम), PSII m/Cyt बी6एफ, ढीला बंधे (एल)-LHCII ट्रिमर (आंकड़ा 1a) । थोड़ा मजबूत डिटर्जेंट, β-डीएम, solubilizes पूरे thylakoid झिल्ली ( चित्र 1bके शीर्ष पर क्षैतिज जेल), लेकिन प्रोटीन परिसरों के बीच कमजोर बातचीत का संरक्षण करने में असमर्थ है । β-डीएम के साथ Thylakoid solubilization आमतौर पर चार PSII-LHCII supercomplexes (LHCII एंटीना संलग्न की अलग मात्रा के साथ), PSII डिमर (डी) और साई एम, ATPase, PSII एम और Cytb6एफ, एम-LHCII, एल-LHCII और LHCII मोनोमर (आंकड़ा 1b) पैदा करता है । β-डीएम के विपरीत, digitonin LHCII मोनोमर की केवल मामूली राशि पैदा करता है । प्रोटीन जटिल पैटर्न अलग प्रकाश स्थितियों के लिए संयंत्र प्रदर्शन के आधार पर अलग हो सकता है और भी उत्परिवर्ती लाइनों के बीच अलग हो सकता है, क्योंकि प्रोटीन जटिल बातचीत गतिशील और पर निर्भर कर रहे है अर्थात्, प्रोटीन फास्फारिलीकरण । चित्रा 1 ए और बी में देशी जेल स्ट्रिप्स नीचे एसडीएस पीए जैल digitonin या β-डीएम के साथ solubilized शुरू में प्रत्येक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के पॉलीपेप्टाइड संरचना का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
चित्र 1. एक दो आयामी बीएन-page/एसडीएस-Arabidopsis thylakoid के पृष्ठ । Thylakoid प्रोटीन कॉंप्लेक्स के साथ solubilized (क) 1% digitonin और (ख) 1% β-डीएम और 3 डी द्वारा पहले अलग-बीएन-पृष्ठ (शीर्ष पर लेन) और बाद में 2d पर-एसडीएस-पृष्ठ प्रत्येक परिसर के व्यक्तिगत प्रोटीन संरचना प्रदर्शित करने के लिए । denaturing Laemmli बफर के साथ बीएन-स्ट्रिप्स की गर्मी के कारण, प्रोटीन उप प्रत्येक परिसर (बीएन पट्टी में) अलग कर देना और 2d-एसडीएस-पृष्ठ के दौरान एक ऊर्ध्वाधर लाइन में अलग कर रहे हैं । प्रोटीन पहचान सन्दर्भ7,8में प्रस्तुत मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण पर आधारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| बफ़र | सामग्री | टिप्पणियाँ |
| ३.५% (T) Acrylamide (एए) बीएन पृथक्करण जेल | ४८% एए, १.५% भा-एए: १४८ µ l 3xGel बफर: ७०० µ l ७५% (w/v) ग्लिसरॉल: १४० µ l Ultrapure ज2ओ: १०९२ µ l 5% अनुप: 15 µ l TEMED 3 µ l |
नोट: Acrylamide neurotoxic है । उपयोग करने से पहले तुरंत अनुप और TEMED जोड़ें । नुस्खा एक छोटे बीएन जेल कास्टिंग के लिए पर्याप्त है । |
| १२.५% (T) Acrylamide (एए) बीएन पृथक्करण जेल | ४८% aa, 1, 5% भा-aa: ५३० µ l 3xGel बफर: ७०० µ l ७५% (w/v) ग्लिसरॉल: ५६० µ l Ultrapure ज2ओ: २९० µ l 5% अनुप: 11 µ l TEMED 2 µ l |
नोट: Acrylamide neurotoxic है । उपयोग करने से पहले तुरंत अनुप और TEMED जोड़ें । नुस्खा एक छोटे बीएन जेल कास्टिंग के लिए पर्याप्त है । |
| 3% (T) Acrylamide (एए) बीएन स्टैकिंग जेल | 20% ए. ए., 5% भा-aa: १८० µ l 3xGel बफर: ५०० µ l Ultrapure ज2ओ: ८०० µ l 5% अनुप: 30 µ l TEMED 3 µ l |
नोट: Acrylamide neurotoxic है । उपयोग करने से पहले तुरंत अनुप और TEMED जोड़ें । नुस्खा एक छोटे बीएन जेल के लिए पर्याप्त है । |
| 3x जेल बफर | १.५ मी ऐका 150mM BisTris/HCl (pH ७.०) |
+ 4 ˚ सी पर स्टोर । |
| CBB बफर | १०० mM BisTris/एचसीएल (पीएच ७.०) ०.५ मीटर ऐका 30% (w/v) सुक्रोज ५० मिलीग्राम/एमएल सर्वजन नीला जी |
+ 4 ˚ C पर स्टोर |
| Anode बफर | ५० mM BisTris/एचसीएल (पीएच ७.०) | + 4 ˚ सी पर स्टोर । बफर 10x स्टॉक समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है |
| कैथोड बफ़र | ५० मिमी Tricine 15 एमएम BisTris ०.०१% सर्वजन नीला जी |
+ 4 ˚ सी पर स्टोर । बफर 10x स्टॉक समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है, 1x समाधान के लिए डाई जोड़ने |
| 25BTH20G | 25 mM BisTris/HCl (pH ७.०) 20% (w/v) ग्लिसरॉल ०.२५ मिलीग्राम/एमएल Pefabloc (हौसले से जोड़ें) 10 मिमी NaF (हौसले से जोड़ें) |
बफर 2x स्टॉक समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है (+ 4 ˚ सी पर स्टोर), लेकिन Pefabloc और NaF हौसले से जोड़ |
| डिटर्जेंट बफर | 2% β-dodecyl maltoside/Digitonin (w/v) 25 mM BisTris/HCl (pH ७.०) 20% (w/v) ग्लिसरॉल और ०.२५ मिलीग्राम/एमएल Pefabloc (शेयर समाधान से हौसले से जोड़ें) 10 मिमी NaF (हौसले से जोड़ें) |
डिटर्जेंट 5-10% स्टॉक समाधान (पानी में) के रूप में तैयार किया जा सकता है । यदि अंय डिटर्जेंट उपयोग किया जाता है, अंतिम डिटर्जेंट एकाग्रता के लिए अनुकूलित किया जाना है । |
तालिका 1. बफ़र्स और मूल जेल ट्रो के लिए समाधान
| बफ़र | सामग्री | टिप्पणियाँ |
| Laemmli बफर | १३८ mM Tris/एचसीएल नं० ६.८ 6M यूरिया २२.२% (v/v) ग्लिसरॉल ४.४% एसडीएस |
संदर्भ: 9 |
| 12% Acrylamide, 6M यूरिया एसडीएस जुदाई जेल | ५०% एए, 1, 33% भा मा-एए: १०.५ mL 20% एसडीएस: ०.७ mL १.५ एम Tris-एचसीएल (पीएच ८.८): 8.05 ml यूरिया: १२.६ ग्राम MQ-एच2ओ: ६.१६ एमएल 10% अनुप: २०० µ l TEMED 28 µ l |
नोट: Acrylamide neurotoxic है । नुस्खा एक बड़ा एसडीएस जेल कास्टिंग के लिए उपयुक्त है । |
| 6% Acrylamide, 6M यूरिया एसडीएस स्टैकिंग जेल | ५०% एए, १.३३% भा-एए: १.२ mL 20% एसडीएस: ०.२ mL ०.५ एम Tris-एचसीएल (पीएच ६.८): २.५ mL यूरिया: ३.६ ग्राम MQ-एच2ओ: ३.४५ एमएल 10% अनुप: १०० µ l TEMED 10 µ l |
नोट: Acrylamide neurotoxic है । |
| एसडीएस चल रहा बफ़र | 19 एमएम Tris २.५ मिमी Glycine ०.०१% एसडीएस |
तालिका 2. 2 डी-एसडीएस-पृष्ठ के लिए बफ़र्स
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
संश्लेषक ऊर्जा रूपांतरण मशीनरी बड़े multisubunit प्रोटीन परिसरों से बना है, जो thylakoid झिल्ली में एंबेडेड हैं । इस प्रोटोकॉल बीएन के साथ Arabidopsis थालियाना से संयंत्र thylakoid प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए एक बुनियादी विधि का वर्णन पृष्ठ 2d-एसडीएस-पृष्ठ के साथ संयुक्त । प्रोटोकॉल भी तंबाकू और पालक thylakoids से thylakoid प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, लेकिन छोटे समायोजन की आवश्यकता हो सकती है ।
झिल्ली प्रोटीन परिसरों के solubilization के लिए, ईओण डिटर्जेंट सामांयतः अपने मूल रूप में परिसरों को संरक्षित करने की क्षमता के लिए इस्तेमाल किया जाता है । यहां, दो सामांयतः डिटर्जेंट β-डीएम और digitonin लागू किए गए थे । Dodecyl maltoside solubilizes व्यक्तिगत प्रोटीन परिसरों, जबकि digitonin बड़ा प्रोटीन जटिल विधानसभाओं10के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । भारी संरचित digitonin कसकर appressed grana विभाजन करने के लिए फिट करने में असमर्थ है और इसलिए केवल appressed झिल्ली3,11के गैर thylakoid क्षेत्रों solubilizes । यह इसलिए स्ट्रोमा thylakoids और grana मार्जिन के विश्लेषण के लिए अनुकूल है । हालांकि, जब digitonin aminocaproic एसिड (ऐका) के साथ एक साथ प्रयोग किया जाता है, संयोजन solubilizes पूरे thylakoid झिल्ली सहित, भी appressed grana thylakoids12। एक अज्ञात तंत्र के माध्यम से, ऐका digitonin आसंन grana झिल्ली परतों के बीच विभाजन अंतराल के लिए उपयोग करने के लिए अनुमति देता है । महत्वपूर्ण बात, digitonin प्रोटीन परिसरों के बीच labile बातचीत को बरकरार रखता है और इसलिए labile प्रोटीन सुपर और megacomplexes, जो गैर में सबसे प्रचुर मात्रा में है के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता appressed thylakoid8क्षेत्रों । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डिटर्जेंट हमेशा प्रोटीन परिसरों के बीच labile बातचीत में से कुछ के साथ हस्तक्षेप और इसलिए यह संभव प्रोटीन परिसरों के पूरी तरह से बरकरार नेटवर्क को अलग करने के लिए नहीं है । परिसरों में से कुछ पृथक्करण उत्पादों है कि thylakoid solubilization और ट्रो के दौरान बड़ा प्रोटीन जटिल संघों से काट दिया गया है । बीएन-पृष्ठ जुदाई की गुणवत्ता न केवल नमूना तैयारी (प्रोटीन जटिल solubilization) पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी thylakoid अलगाव की गुणवत्ता पर, जो ताजा पत्तियों से किया जाना चाहिए । यदि विशेष देखभाल नहीं की जाती है, PSII-LHCII β-DM solubilization के दौरान आम तौर पर नीचा supercomplexes ।
बीएन-पेज solubilized प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की अखंडता को बनाए रखता है । बीएन जेल के पृथक्करण क्षमता acrylamide ढाल पर निर्भर करता है, और ढाल प्रोटीन ब्याज के परिसरों के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए । polyacrylamide जेल का ताकना-आकार एकाग्रता ढाल बदलकर संशोधित किया जा सकता है (कुल acrylamide एकाग्रता, टी) या बीआईएस-acrylamide एकाग्रता का समायोजन करके (C) acrylamide मोनोमर4की कुल राशि के सापेक्ष. बीएन-पीए जेल ढाल यहां इस्तेमाल किया अनुकूलित और अच्छी तरह से बड़े प्रोटीन सुपर और megacomplexes3के विश्लेषण के लिए अनुकूल है । महत्वपूर्ण बात, ताकना-स्टैकिंग जेल का आकार सभी परिसरों जुदाई जेल में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए बड़ा होना चाहिए । बीएन के साथ प्रोटीन जटिल जुदाई के बाद पृष्ठ, संरचना या प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन जटिल बैंड की संरचना और विश्लेषण किया जा सकता है । संरचनात्मक विश्लेषण के लिए ब्याज के प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को जेल से eluted होना जरूरी है और रेफरेंस के दौरान ज्यादातर labile कॉम्प्लेक्स नष्ट हो सकते हैं । इसलिए, सुक्रोज घनत्व ढाल अधिक बार संरचनात्मक विश्लेषण के लिए प्रोटीन जटिल शुद्धि के लिए प्रयोग किया जाता है । जेल में प्रोटीन परिसरों के स्पेक्ट्रोस्कोपी गुणों के विश्लेषण के लिए, स्पष्ट देशी पृष्ठ के बजाय बीएन-पृष्ठ का इस्तेमाल किया जाना चाहिए, Coomassie डाई के बाद से इस तरह के माप के साथ हस्तक्षेप. प्रोटीन परिसरों की उपइकाई संरचना के विश्लेषण के लिए, एक denaturing 2d-एसडीएस-पृष्ठ यहां वर्णित है । प्रत्येक परिसर की उपइकाईयों को एक ऊर्ध्वाधर रेखा में अलग कर दिया जाता है और आसानी से पहचाना जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई प्रोटीन एक ही स्थान में मौजूद हो सकता है और एक ही ऊर्ध्वाधर लाइन में उपइकाइयों अलग परिसरों सह बीएन में प्रवास-पृष्ठ से संबंधित हो सकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अनुसंधान आर्थिक रूप से फिनलैंड की अकादमी (परियोजना संख्या ३०७३३५ और ३०३७५७) और बायोमास (SE2B) Marie Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते (६७५००६) में सौर ऊर्जा द्वारा समर्थित था । प्रोटोकॉल संदर्भ3पर आधारित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
