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Biochemistry

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.

Abstract

Catena di trasporto fotosintetiche dell'elettrone (ecc) converte energia solare in energia chimica sotto forma di NADPH e ATP. Quattro complessi proteici grande incorporato nell'energia solare raccolta membrana tilacoide per guidare gli elettroni dall'acqua a NADP+ via due fotosistema e utilizzare la pendenza del protone creato per la produzione di ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) e dell'atpasi sono tutti i complessi multiproteici con orientamento distinto e dinamiche nella membrana tilacoide. Preziose informazioni circa la composizione e le interazioni dei complessi della proteina nella membrana tilacoide ottenibile da solubilizzare i complessi dall'integrità della membrana di detergenti delicati, seguite dalla separazione elettroforetica di Natale del gel della complessi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo analitico utilizzato per la separazione dei complessi della proteina nella loro forma nativa e funzionale. Il metodo può essere utilizzato per la purificazione della proteina di complessi per più dettagliata analisi strutturale, ma fornisce anche uno strumento per analizzare le interazioni dinamiche tra i complessi di proteine. Il metodo è stato sviluppato per l'analisi dei complessi della proteina respiratoria mitocondriale, ma da allora ha stato ottimizzato e migliorato per la dissezione dei complessi proteici thylakoid. Qui, forniamo un dettagliato protocollo sono aggiornato per l'analisi di complessi proteici fotosintetici labile e le loro interazioni in Arabidopsis thaliana.

Introduction

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Grande proteina del multisubunit complessi fotosistema PSI e PSII, Cyt b6f e dell'atpasi coordinare la produzione di ATP e NADPH in reazioni fotosintetiche di luce. Nei cloroplasti di piante superiori, i complessi si trovano nella membrana tilacoide, che è una struttura a membrana strutturalmente eterogenee, che comprende appressed grana e lo stroma non appressed tilacoidi. L'elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo ampiamente usato nell'analisi dei complessi della proteina del multisubunit grande nella loro forma nativa e biologicamente attivo. Il metodo è stato istituito per la dissezione della membrana mitocondriale della proteina complessi1, ma più successivamente è stato personalizzato per la separazione dei complessi della proteina dalla membrana tilacoide rete3. Il metodo è adatto (i) per la purificazione dei complessi della proteina thylakoid individuali per l'analisi strutturale, (ii) per determinare interazioni natali tra complessi proteici e (iii) per l'analisi dell'organizzazione complessiva dei complessi proteici Dopo aver cambiato il stimoli ambientali.

Prima della separazione, complessi proteici sono isolati dalla membrana con detergenti non ionici attentamente selezionate, che sono generalmente lievi e preservare la struttura nativa dei complessi proteici. Detersivi contengono idrofobo e idrofilici siti e micelle stabile forma sopra una certa concentrazione, chiamato una concentrazione micellare critica (CMC). Aumento della concentrazione di detersivo sopra i risultati di CMC in rottura delle interazioni lipido-lipidico e la solubilizzazione dei complessi della proteina. La scelta di detersivo dipende sulla stabilità della proteina complessa di interesse e la capacità di solubilizzazione del detergente. Ordinariamente usati detergenti sono α/β-dodecil-maltoside e digitonina. La solubilizzazione dei complessi della proteina nel loro stato nativo, materiale insolubile viene rimosso mediante centrifugazione. Nelle piante superiori, la membrana tilacoide è altamente eterogeneo in struttura e alcuni detersivi (ad es., digitonina) solubilizzano selettivamente solo una specifica frazione della membrana3. Pertanto, per caratterizzare l'organizzazione complessa di proteine o le interazioni tra i complessi di proteine, è cruciale determinare sempre la capacità di solubilizzazione del detergente scelto attraverso la determinazione del contenuto di clorofilla e la clorofilla a/b rapporto del surnatante per valutare il rendimento e il dominio rappresentato thylakoid (sub), rispettivamente, della frazione solubilizzata. Il rapporto di clorofilla a/b in tilacoidi intatto di crescita-luce acclimatati piante è in genere intorno alle 3, mentre il chl un / valore b di thylakoid frazioni arricchite in grana o stroma tilacoidi scende di sotto (~ 2,5) o superiore (~ 4,5) al valore del totale tilacoidi, rispettivamente.

Per fornire la carica negativa per i complessi di proteine, colorante (CBB) azzurro brillante di Coomassie è aggiunto al campione solubilizzato. A causa dello spostamento di carica, complessi proteici migrano verso l'anodo e sono separati su una pendenza di acrilamide (AA) secondo la loro forma e la massa molecolare. Separazione efficace e ad alta risoluzione si ottiene utilizzando un gradiente di concentrazione di acrilammide lineare. Durante l'elettroforesi, i complessi di proteine migrano verso l'anodo fino a quando essi raggiungono il loro limite di dimensione dei pori dipendente dalla dimensione. Il formato del poro del gel di poliacrilammide dipende da (i) il totale acrilammide /bis- acrilammide concentrazione (T) e (ii) il cross-linker bis- acrilammide monomero concentrazione (C) riguardante i monomeri totale4. Dopo la separazione con BN-PAGE, i complessi di proteine possono essere ulteriormente suddivisi in loro subunità proteiche individuali di seconda dimensione (2D) - SDS - PAGE. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di complessi di proteine di membrana tilacoide da BN-pagina/2D-SDS-PAGE.

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Protocol

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1. preparazione BN Gel1,2,3

  1. Impostare la colata di gel con piastre di 8 x 10 cm (rettangolare in vetro e piastra dentellata allumina) secondo le istruzioni del produttore mediante distanziali di 0,75 mm.
  2. Posizionare un gradiente mixer su un piatto di mescolare e collegarlo con la pompa peristaltica di una tubazione. Collegare una siringa a altra estremità del tubo e inserire l'ago tra la piastra di vetro e alluminio. Agitatore magnetico posto il "pesante" (H)-camera.
  3. Preparare il 3,5% (v/v) e del 12,5% (v/v) soluzioni di acrilamide (AA) in provette coniche da 15 mL per la sfumatura di gel di separazione (Vedi ricette in tabella 1). Per evitare la polimerizzazione prematura, mantenere le provette da centrifuga sul ghiaccio durante la preparazione delle soluzioni.
    Attenzione: L'acrilammide è neurotossico e cancerogeno, indossare indumenti protettivi e guanti.
  4. Aggiungere 5% APS e TEMED diritto prima di pipettaggio le soluzioni al mixer del gradiente. Dispensare la soluzione di 12,5% per la camera-H.
    1. Rimuovere le bolle d'aria dal canale di collegamento tra la "luce" (L) e la H-Camera aprendo la valvola che collega le due camere che permette soluzione entrare alla L-camera. Chiudere la valvola e dispensare che le tracce di soluzione torna alla camera di H.
    2. Infine, dispensare la soluzione di 3,5% per la camera da L.
  5. Accendere l'agitatore magnetico (la velocità di stir non è critica, ma esso dovrebbe garantire la corretta miscelazione delle soluzioni pesanti e leggeri), aprire le valvole e accendere la pompa peristaltica. Permettono le soluzioni di gel di fluire tra la piastra di vetro e alluminio, la portata dovrebbe essere di circa 0,5 mL/min. L'ago deve essere sopra il liquido tutto il tempo, può essere collegato alla parte superiore della lastra di vetro con un nastro.
  6. Quando le camere H e L sono svuotati, riempirli con acqua ultrapura e permettere all'acqua di delicatamente overlay sulla superficie del gel. La polimerizzazione del gel richiede circa 1-2 ore a TA.
  7. Preparare la soluzione di acrilammide 3% (vedi ricetta in tabella 1) per l'impilamento del gel a RT. Dispensare il gel d'impilamento in cima il gel polimerizzato separazione (prima del getto il gel d'impilamento, rimuovere l'acqua sovrapponendo la superficie del gel) e collocare un pettine di gel di campione tra il vetro e alluminio piastra evitando bolle d'aria.
    1. Lasciare per polimerizzare 30-60 min a RT. Remove il pettine delicatamente sotto l'acqua ultrapura. Memorizzare il gel a + 4 ˚ c.
      Punto di pausa. Il gel può essere conservato a + 4 ˚ c per pochi giorni. Il gel dovrebbe essere mantenuto in condizioni di umidità per evitare l'essiccamento dei pozzi e la superficie del gel.

2. Thylakoid solubilizzazione1,2,3

Nota: Tutte le procedura deve essere eseguita sotto luce molto fioca. Mantenere i campioni e buffer sul ghiaccio.

  1. Diluire tilacoidi isolato con gelida 25BTH20G buffer per una concentrazione di clorofilla finale di 1 mg/mL. Per analisi 2D-BN-SDS-PAGE circa 4-8 µ g di clorofilla / campione è adatto.
    Nota: I tilacoidi utilizzati negli esperimenti devono essere isolati dalle foglie fresche (per protocollo di isolamento tilacoide, Vedi3)
  2. Aggiungere un volume equivalente di tampone detergente, cioè, 2% β-DM (w/v) o 2% della digitonina (w/v). Mescolare il detersivo per il campione di thylakoid delicatamente con la punta della pipetta ed evitare di fare bolle d'aria. La concentrazione finale del detergente è 1% e quella dei tilacoidi 0,5 mg Chl/mL.
    1. Solubilizzare i tilacoidi per 2 min su ghiaccio (β-DM) o 10 minuti a RT con continua miscelazione delicata su un bilanciere/shaker (digitonina).
      Nota: Digitonina e β-DM sono generalmente utilizzati per la solubilizzazione dei complessi della proteina thylakoid. Se vengono utilizzati altri detergenti non ionici, la concentrazione di detersivo e il tempo di solubilizzazione deve essere ottimizzate prima. Solitamente l'intervallo di concentrazione detergente da 0,5% - 5% (v/v).
      Attenzione: Digitonina è tossica, indossare indumenti protettivi e guanti
  3. Rimuovere il materiale insolubilized mediante centrifugazione a 18.000 x g per 20 min, a + 4 ˚ c.
  4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere 1/10 (v/v) di buffer di CBB al campione.
    Nota: Quando viene esaminata la composizione dei complessi proteici della membrana tilacoide, determinare il rendimento e il dominio di thylakoid rappresentato della frazione solubilizzata è raccomandato. Per determinare il rendimento del materiale solubilizzato, prendere 5 µ l del surnatante ad un nuovo tubo (prima di aggiungere di CBB) e misurare il contenuto di Chl e Chl un / b rapporto5.

3. BN-PAGE1,2,3

  1. Impostare il gel per un sistema di elettroforesi verticale (ad es., Hoefer SE 250). Riempire l'alloggiamento superiore del buffer con il catodo blu tampone (Vedi tabella 1) e versare il buffer di anodo per la camera di buffer inferiore.
  2. Caricare un esempio di thylakoid (ad es., 5 µ g di clorofilla) nei pozzetti.
  3. Avviare l'elettroforesi e gradualmente aumentare la tensione: 75 V per 30 min, 100 V per 30 min, 125 V per 30 min, 150 V per 1 h e 175 V fino ai complessi sono stati separati completamente. Eseguire il gel a + 4 ° c, utilizzando una cella frigorifera o regolazione della temperatura di gel con un sistema di raffreddamento.
    Nota: Modificare il buffer di catodo blu a un buffer di catodo chiaro quando la parte anteriore del campione ha migrato circa un terzo del gel.
  4. Dopo la corsa elettroforetica, scansione il gel con uno scanner per l'archiviazione di immagini.

4. 2D-SDS-PAGE

  1. Assemblare il sistema di elettroforesi verticale (dimensioni dei gel 16 cm x 20 cm). Utilizzare distanziatori di 1 mm.
  2. Preparare gli standard del gel di SDS (12% di acrilammide, 6 M Urea, vedi ricetta nella tabella 2) con un 2D-pettine (singolo grande bene per la strip e un pozzetto standard per marcatore di peso molecolare).
  3. Tagliare la corsia da BN-gel e inserirlo in un tubo (5 mL). Aggiungere 2 mL di tampone di Laemmli (contenente 5% β-mercaptoetanolo) ed incubare la striscia per 45 minuti con agitazione delicata a TA.
  4. Posizionare la corsia, con l'aiuto di ad esempio, un distanziatore, sulla superficie del gel, evitando bolle d'aria.
  5. Pipettare 5 µ l di marcatore di peso molecolare su un pezzo di carta da filtro e posto la carta per lo standard ben stretto.
  6. Per sigillare la striscia BN-gel e la carta di marcatore, versare 0,5% di agarosio (in tampone di corsa) sopra la striscia di gel e lasciare solidificare.
  7. Eseguire l'elettroforesi secondo protocolli standard. Dopo l'esecuzione l'elettroforetica, visualizzare le proteine con ad es., macchia Sypro Ruby o macchiatura secondo6d'argento.

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Representative Results

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Un sistema rappresentativo di 2D-BN/SDS-PAGE nella Figura 1 viene illustrato la separazione della digitonina e complessi della proteina β-DM-solubilizzato thylakoid e loro composizione in subunità della proteina dettagliate. Il modello complesso della proteina di digitonina solubilizzata tilacoidi (gel orizzontale in alto a sinistra sulla cima di Figura 1A) contiene PSII-LHCII-PSI megacomplex, due grandi supercomplessi di PSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LHCII, monomero PSI (m), PSII m/Cyt b6f, vagamente associato (L)-trimero LHCII (Figura 1A). Il detergente leggermente più forte, la β-DM, solubilizza la membrana tilacoide intero (gel orizzontale nella parte superiore Figura 1B), ma è Impossibile mantenere interazioni deboli tra complessi proteici. Thylakoid solubilizzazione con β-DM produce in genere quattro supercomplessi PSII-LHCII (con diverse quantità di antenna LHCII allegata), dimero PSII (d) e PSI m, atpasi, PSII m e Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII e LHCII monomero (Figura 1B). A differenza di β-DM, digitonina produce solo piccole quantità di monomero LHCII. Il modello complesso della proteina può differire a seconda dell'esposizione della pianta a differenti condizioni di luce e può anche differire tra linee mutanti, poiché le complesse interazioni della proteina sono dinamici e dipendono cioè, fosforilazione della proteina. Gel di SDS-PA sotto le strisce di Natale del gel nella Figura 1 A e B rappresentano la composizione del polipeptide di ogni complesso di proteine inizialmente solubilizzata con digitonina o β-DM.

Figure 1
Figura 1. Un bidimensionale BN-pagina/SDS-PAGE di Arabidopsis thylakoid. Complessi proteici thylakoid solubilizzato con (A) 1% della digitonina e (B) 1% β-DM e separati prima da 1D-BN-PAGE (le corsie sulla parte superiore) e successivamente in 2D-SDS-PAGE per dimostrare la composizione di singole proteine di ciascun complesso. Dovuto l'incubazione di BN-strisce con denaturazione Laemmli buffer, la subunità proteiche di ciascun complesso (nella striscia di BN) dissociare e sono separate in una linea verticale durante il 2D-SDS-PAGE. L'identificazione di proteine si basa sull'analisi di spettrometria di massa nella riferimenti7,8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Buffer Contenuto Commenti
3,5 gel di acrilammide (AA) BN separazione del % (T) 48% AA, 1,5% bis-AA: 148 µ l
3xGel Buffer: 700 µ l
75% (p/v) glicerolo: 140 µ l
Ultrapura H2o: 1092 µ l
5% APS: 15 Μ l
Μ L DI TEMED 3
Nota: L'acrilammide è neurotossica. Aggiungere APS e TEMED immediatamente prima dell'uso. La ricetta è sufficiente per eseguire il cast un piccolo gel BN.
12,5 gel di acrilammide (AA) BN separazione del % (T) 48% AA, 1,5% bis-AA: 530 µ l
3xGel Buffer: 700 µ l
75% (p/v) glicerolo: µ l 560
Ultrapura H2o: 290 µ l
5% APS: 11 Μ l
TEMED 2ΜL
Nota: L'acrilammide è neurotossica. Aggiungere APS e TEMED immediatamente prima dell'uso. La ricetta è sufficiente per eseguire il cast un piccolo gel BN.
Gel di acrilammide (AA) BN accatastamento del 3% (T) AA 20%, 5% bis-AA: 180 µ l
3xGel Buffer: 500 µ l
Ultrapura H2o: 800 µ l
5% APS: 30 Μ l
Μ L DI TEMED 3
Nota: L'acrilammide è neurotossica. Aggiungere APS e TEMED immediatamente prima dell'uso. La ricetta è sufficiente per un piccolo gel BN.
3 x buffer Gel 1.5 M ACA
150mM BisTris/HCl (pH 7.0)
Conservare a + 4 ° c.
Buffer di CBB 100 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 0,5 M ACA
30% (p/v) di saccarosio
Serva di 50 mg/ml blu G
Conservare a + 4 ° c
Buffer di anodo 50 mM BisTris/HCl (pH 7.0) Conservare a + 4 ° c. Buffer può essere preparato come soluzione di riserva x 10
Buffer di catodo 50 mM Tricine
15 mM BisTris
0,01% Serva blu G
Conservare a + 4 ° c. Buffer può essere preparato come soluzione di riserva: 10x, aggiungere il colorante nella soluzione 1x
25BTH20G 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
20% (p/v) glicerolo
0,25 mg/ml Pefabloc (aggiungere appena)
10 mM NaF (aggiungere appena)
Buffer possono essere preparati come 2 X soluzione madre (conservare a + 4 ° c), ma aggiungere appena Pefabloc e NaF
Buffer di detersivo 2% β-dodecil maltoside/digitonina (w/v)
25 mM BisTris/HCl (pH 7.0)
20% (p/v) glicerolo e
0,25 mg/ml Pefabloc (aggiungere appena dalla soluzione di riserva)
10 mM NaF (aggiungere appena)
Detergenti possono essere preparati come soluzioni di riserva di 5-10% (in acqua). Se vengono utilizzati altri detergenti, la concentrazione finale di detergente deve essere ottimizzato.

Tabella 1. Buffer e soluzioni per elettroforesi nativa

Buffer Contenuto Commenti
Tampone di Laemmli pH di 138 mM Tris/HCL 6.8
6M Urea
22,2% (v/v) glicerolo
4,4% SDS
Riferimento: 9
12% acrilammide, gel di separazione di 6M Urea SDS 50% AA, 1,33% bis-AA: 10,5 mL
20% SDS: 0,7 mL
1.5 M Tris-HCl (pH 8,8): 8,05 mL
Urea: 12,6 g
MQ-H2o: 6,16 mL
10% APS: 200 Μ l
Μ L DI TEMED 28
Nota: L'acrilammide è neurotossica. La ricetta è adatta per eseguire il cast un grande gel di SDS.
6% acrilammide, 6M Urea SDS Stacking gel 50% AA, 1,33% bis-AA: 1,2 mL
20% SDS: 0,2 mL
0.5 M Tris-HCl (pH 6,8): 2,5 mL
Urea: 3,6 g
MQ-H2o: 3,45 mL
10% APS: 100 Μ l
TEMED 10 Μ l
Nota: L'acrilammide è neurotossica.
Buffer di SDS in esecuzione 19 mM Tris
2,5 mM glicina
0,01% SDS

Tabella 2. Buffer per 2D-SDS-PAGE

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Discussion

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I macchinari di conversione di energia fotosintetica sono composto da complessi di grande proteina del multisubunit, che sono incorporati nella membrana tilacoide. Questo protocollo descrive un metodo di base per l'analisi dei complessi proteici thylakoid pianta Arabidopsis thaliana con BN-PAGE combinato con 2D-SDS-PAGE. Il protocollo è adatto anche per l'analisi dei complessi della proteina thylakoid da tilacoidi tabacco e spinaci, ma potrebbe richiedere piccoli aggiustamenti.

Per la solubilizzazione dei complessi della proteina di membrana, detergenti non ionici sono comunemente utilizzati per la loro capacità di preservare i complessi nella loro forma nativa. Qui, i detergenti comunemente utilizzati due β-DM e della digitonina erano applicati. Dodecil maltoside solubilizza i complessi della proteina individuali, mentre digitonina può essere utilizzata per l'analisi dei più grandi assiemi complessi di proteine10. L'ingombrante digitonina strutturata è in grado di adattarsi alle partizioni strettamente appressed grana e solubilizza pertanto solo le regioni non-appressed del thylakoid membrana3,11. È quindi adatto per l'analisi dei margini di tilacoidi e grana di stroma. Tuttavia, quando digitonina è utilizzata insieme con l'acido aminocaproico (ACA), la combinazione solubilizza la membrana tilacoide intero, tra cui anche la grana appressed tilacoidi12. Attraverso un meccanismo sconosciuto, ACA permette digitonina avere accesso al gap di partizione tra strati di membrana adiacenti grana. D'importanza, digitonina conserva labile interazioni tra complessi proteici e può quindi essere utilizzata per l'analisi di proteine labili super e megacomplexes, che sono più abbondanti nelle regioni non-appressed thylakoid8. Deve essere notato che detergenti sempre interferiscano con alcune delle interazioni labile tra i complessi di proteine e di conseguenza non è possibile isolare la rete completamente intatta dei complessi della proteina. Alcuni dei complessi sono prodotti di dissociazione che stato disconnesso dal più grandi associazioni complesse proteine durante thylakoid solubilizzazione e l'elettroforesi. La qualità della separazione BN-PAGE dipende non solo la preparazione del campione (solubilizzazione proteine complesse), ma anche sulla qualità dell'isolamento tilacoide, che deve essere fatto dalle foglie fresche. Se non viene prestata particolare attenzione, i supercomplessi PSII-LHCII degradano in genere durante la solubilizzazione di β-DM.

BN-PAGE mantiene l'integrità dei complessi proteici solubilizzata. La capacità di separazione del gel BN dipende il gradiente di acrilammide e il gradiente deve essere ottimizzato basato sui complessi della proteina di interesse. Il formato del poro del gel di poliacrilammide può essere modificato modificando il gradiente di concentrazione (concentrazione di acrilammide totale, T) o regolando la concentrazione di acrilammide - bis(C) rispetto alla quantità totale di acrilammide monomeri4. Il gradiente di gel BN-PA usato qui è ottimizzato e adatta per l'analisi di grandi proteine super - e megacomplexes3. Cosa importante, dimensione dei pori del gel d'impilamento deve essere grande per consentire tutti i complessi di entrare direttamente sul gel di separazione. Dopo proteina complessa separazione con BN-PAGE, la composizione o la struttura di ciascuna banda di singole proteine complesse può essere ulteriormente analizzato. Per l'analisi strutturale della proteina complesso di interesse deve essere eluito dal gel e più labile complessi possono essere distrutti durante l'eluizione. Di conseguenza, gradiente di densità di saccarosio è più spesso usato per la purificazione di proteine complesse per l'analisi strutturale. Per l'analisi delle proprietà spettroscopiche dei complessi proteici nel gel, deve essere utilizzata la pagina clear-nativo anziché BN-PAGE, poiché il colorante Coomassie interferisce con tali misure. Per l'analisi della composizione in subunità dei complessi proteici, una denaturazione 2D-SDS-PAGE è descritto qui. Le subunità di ciascun complesso sono separate in una linea verticale e possono essere facilmente identificate. Deve essere notato che parecchie proteine possono essere presenti in un singolo punto e le subunità nella stessa linea verticale possono appartenere distinti complessi di co-migrazione in BN-PAGE.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dall'Accademia di Finlandia (numeri di progetto 307335 e 303757) ed energia solare nell'accordo di sovvenzione di biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Il protocollo si basa sul riferimento3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
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Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu
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Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

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