Summary
프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.
Abstract
광합성 전자 전송 체인 (등) NADPH와 ATP의 형태로 화학 에너지로 태양 에너지를 변환합니다. 4 개의 큰 단백질 복합물 NADP+ photosystems 통해 두, 물에서 전자를 드라이브 하 고 생성된 된 양성자 기온 변화도 사용 하 여 ATP의 생산을 위한 thylakoid 막 수확 태양 에너지에 포함. Photosystem PSII, PSI, 시 토 크롬 b6f (Cyt b6f) 및 ATPase는 뚜렷한 방향과 thylakoid 막에서 역학으로 모든 multiprotein 복합물. 온화한 세제의 기본 젤 전기 이동 별거 다음으로 막 무결성에서 단지 solubilizing 여 구성과 thylakoid 막에서 단백질 복합물의 상호 작용에 대 한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다는 단지입니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 기능 형태로 단백질 복합물의 분리에 사용 되는 분석 방법 이다. 자세한 구조 분석을 위해 단백질 복잡 한 정화에 대 한 메서드를 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 또한 단백질 복합물 간의 동적 상호 작용을 해 부를 도구를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 미토 콘 드리 아 호흡 단백질 복합물의 분석을 위해 개발 되었다 하지만 이후 되었습니다 최적화 있으며 thylakoid 단백질 복합물의 해 부에 대 한 개선. 여기, 우리가 정한 광합성 단백질 복합물 및 애기 thaliana에서 그들의 상호 작용의 분석에 대 한 상세한 최신 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
큰 multisubunit 단백질 복합물 photosystem PSI과 PSII, Cyt b6f와 ATPase 광합성 빛 반응에서 ATP와 NADPH의 생산 조정. 더 높은 식물의 엽록체에는 단지는 구조적으로 다른 유형의 막 구조, appressed grana 및 appressed 비 기질 thylakoids thylakoid 막에 있습니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 생물학적 활성 형태로 큰 multisubunit 단백질 복합물의 분석에는 광범위 하 게 사용 되는 방법 이다. 방법1, 미토 콘 드 리아 멤브레인의 단백질 복합물 해 부에 대 한 설립 되었다 하지만 나중 thylakoid 막 네트워크3에서 단백질 복합물의 분리에 대 한 사용자 지정 된. 방법은 (i) 구조 분석, (ii) 단백질 복합물 사이 기본 상호 작용을 결정 하 고 (iii) 단백질 복합물의 전체 조직 분석에 대 한 개별 thylakoid 단백질 복합물의 정화에 적합 시 환경 큐를 변경 합니다.
이전에 분리, 단백질 복합물 신중 하 게 선택한 비 세제는 일반적으로 온화 하 고 단백질 복합물의 기본 구조를 보존 막 으로부터 격리 됩니다. 세제 소수 포함 하 고 친수성 사이트 및 특정 농도, 위의 형태 안정 micelles 라는 중요 한 micellar 농도 (CMC). CMC 결과 지질-지질 상호 작용의 고 단백질 복합물의 가용 화에 세제 농도 증가. 세제의 선택에는 세제의 가용 화 능력 및 관심사의 복잡 한 단백질의 안정성에 따라 달라 집니다. 일상적으로 사용된 세제 α/β-라우릴-maltoside 및 digitonin을 포함합니다. 그들의 네이티브 국가에서 단백질 복합물의 가용 화에 따라 불용 성 물질은 원심 분리에 의해 제거 됩니다. 더 높은 식물에서 thylakoid 막 구조에 매우 heterogenic 이며 일부 세제 (예: digitonin)는 선택적으로 막3의 특정 부분만 solubilize. 따라서, 단백질 복잡 한 조직 또는 단백질 복합물 사이 상호 작용의 특성, 그것은 항상 엽록소 콘텐츠, 엽록소 a/b를 확인 하 여 선택한 세제의 가용 화 능력을 결정 하는 중요 한 상쾌한 solubilized 분수의 수익률 및 대표 thylakoid (하위) 도메인을 각각 평가 비율. 엽록소 a/b 비율 성장 빛 풍토 식물의 그대로 thylakoids에는 일반적으로 약 3, 반면는 chl는 thylakoid 분수의 b 값 grana에 농축 또는 기질 thylakoids (~ 2.5) 미만으로 떨어지면 (~ 4.5) 총의 값 보다 thylakoids, 각각.
단백질 복합물에 부정적인 요금을 제공 하려면 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 염료 solubilized 샘플에 추가 됩니다. 충전 시프트 인해 단백질 복합물 양극 쪽으로 이동 하 고 그들의 분자 질량과 모양에 따라 아크릴 (AA) 그라데이션에 구분 됩니다. 효과적이 고 고해상도 분리 선형 아크릴 아 미드 농도 기온 변화도 사용 하 여 이루어집니다. 전기 이동 법, 동안 그들의 크기에 종속 기 공 크기 제한에 도달할 때까지 단백질 복합물 양극 쪽으로 마이그레이션합니다. Polyacrylamide 젤의 기 공 크기 (i) 총 아크릴에 따라 달라 집니다 /두번째-아크릴 아 미드 농도 (T) 및 (ii) cross-linker 두번째-아크릴 모노 머 농도에 (C) 총 단위체4를 기준으로. BN 페이지와 분리 후 단백질 복합물 수 수 더 세분화 그들의 개별 단백질 소 단위 2 차원 (2D)-SDS-페이지. 여기, 우리는 BN-페이지/2D-SDS-페이지 thylakoid 막 단백질 복합물의 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 준비 비 엔 젤1,2,3
- 0.75 m m의 스페이서를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 cm x 10 cm 플레이트 (직사각형 유리 및 노치 알 루미나 판)와 젤 캐스터를 설정 합니다.
- 그라데이션 믹서를 저 어 접시에 놓고는 배관에 의해 연동 펌프와 연결 합니다. 주사기 바늘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 하 고 유리 및 알루미늄 격판덮개 사이 바늘을 배치. "무거운" (H)에 장소 자력-챔버.
- 대비 3.5% (v/v) 및 12.5% (v/v) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 아크릴 (AA) 솔루션 분리 젤 그라데이션 (참조 표 1에). 불의 중 합을 방지 하기 위해 솔루션을 준비 하는 동안 얼음에 원심 분리기 튜브를 유지.
주의: 아크릴은 신경 및 발암 성, 마모 보호 옷과 장갑. - 그라데이션 믹서에 대 한 해결책을 pipetting 전에 5 %APS TEMED 오른쪽을 추가 합니다. 피펫으로 H-챔버에 12.5% 솔루션.
- L-챔버를 입력 하는 솔루션을 수 있도록 두 개의 챔버를 연결 하는 밸브를 열어 "빛" (L)과 H-챔버를 연결 하는 채널에서 기포를 제거 합니다. 밸브 및 피펫으로 솔루션의 H-챔버를 다시 닫습니다.
- 마지막으로, 피펫으로 L-약 실에 3.5% 솔루션.
- 스위치는 자력에 (는 저 속도가 중요 하지만 무 겁 고 가벼운 솔루션의 적절 한 혼합 되도록 해야), 밸브를 열고 연동 펌프에 전환. 유리 및 알루미늄 판 사이에 젤 솔루션을 허용, flowrate는 대략 0.5 mL/min. 바늘 해야 액체 위에 모든 시간, 그것은 테이프와 함께 유리 접시의 위쪽 부분을 연결할 수 있습니다.
- H와 L 챔버는 비운 초순 그들을 채울 고 부드럽게 오버레이 젤 표면 물 허용. 젤 중 합 실시간에 약 1-2 시간 소요
- 3% 아크릴 솔루션 준비 (참조 표 1제조 법)는 스태킹에 대 한 생산 분리 젤 위에 겹쳐 쌓이는 젤에 실시간 피펫으로 젤 (겹쳐 쌓이는 젤을 주조 하기 전에 제거 젤 표면 overlaying 물) 배치 샘플 젤 빗 사이는 유리와 알루미늄 플레이트 피하 공기 방울.
- 30-60 분 실시간 제거 초순에서 부드럽게 빗에 유해 하실 수 있습니다. 젤 + 4 ˚C에 저장 합니다.
일시 중지 포인트입니다. 젤은 몇 일 동안 + 4 ˚C에 저장할 수 있습니다. 젤은 우물과 젤 표면의 건조를 피하기 위해 습 한 조건에서 보관 한다.
- 30-60 분 실시간 제거 초순에서 부드럽게 빗에 유해 하실 수 있습니다. 젤 + 4 ˚C에 저장 합니다.
2. Thylakoid 가용 화1,2,3
참고: 모든 단계는 매우 희미 한 빛 속에서 수행 되어야 합니다. 샘플 및 버퍼 얼음에 계속.
- 얼음 처럼 차가운 25BTH20G 버퍼 1 mg/mL의 최종 엽록소 농도를 가진 고립 된 thylakoids를 희석. 엽록소의 µ g 2D BN SDS 페이지 분석 약 4-8에 대 한 샘플은 적합 /.
참고: thylakoids는 실험에 사용 되는 (thylakoid 절연, 참조3프로토콜)에 대 한 신선한 잎에서 격리 되어야 합니다. - 세제 버퍼, 즉, 2% β-DM (w/v) 또는 2%의 동일한 볼륨 추가 digitonin (w/v). 부드럽게 피펫으로 팁 thylakoid 샘플에 세제를 혼합 하 고 기포를 만들기 방지. 세제의 최종 농도 1%와 thylakoids 0.5 mg Chl/mL 이다.
- 얼음 (β-디 엠) 또는 로커/통 (digitonin)에 연속 부드러운 혼합과 RT에서 10 분 2 분 thylakoids solubilize
참고: thylakoid 단백질 복합물의 가용 화에 대 한 Digitonin 및 β-DM 사용 일반적으로 됩니다. 다른 비 이온 세제 사용 하는 경우 세제 농도 및 가용 화 시간 해야 합니다 먼저 최적화. 일반적으로 세제 농도 범위에서 0.5%-5% (v/v).
주의: Digitonin은 독성 보호 옷을 입고, 장갑
- 얼음 (β-디 엠) 또는 로커/통 (digitonin)에 연속 부드러운 혼합과 RT에서 10 분 2 분 thylakoids solubilize
- Insolubilized 자료 + 4 ˚C에서 20 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리 하 여 제거 합니다.
- 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플을 CBB 버퍼의 1/10 (v/v)를 추가 합니다.
참고: thylakoid 막 단백질 복합물의 전체적인 구성, 시험 수확량 및 solubilized 분수의 대표 thylakoid 도메인 확인 것이 좋습니다. Solubilized 자료의 수익률을 확인 하려면 (CBB 추가) 하기 전에 새로운 튜브는 상쾌한의 5 µ L을 하 고 측정 Chl 내용과 Chl a / b 비율5.
3. 비-페이지1,2,3
- 수직 전기 시스템 (예: Hoefer SE 250) 젤을 설정 합니다. 위의 버퍼 챔버 블루 음극 버퍼 채우기 ( 표 1참조) 양극 버퍼는 더 낮은 버퍼 약 실에 붓는 다.
- 우물에 thylakoid 샘플 (엽록소의예를 들어, 5 µ g)를 로드 합니다.
- 전기 이동 법을 시작 하 고 서서히 전압을 증가: 75 V 30 분, 30 분 동안 100 V, 30 분 125 V, 150 V 1 h와 V는 단지까지 175 완전히 분리 되었다. 에 젤 + 4˚C, 차가운 룸을 사용 하거나 냉각 시스템 젤 온도 조정 실행 합니다.
참고: 샘플 전면 젤의 1/3 정도 마이그레이션한 때 블루 음극 버퍼 분명 음극 버퍼에 변경 합니다. - 전기 이동 실행 후 이미지 보관에 대 한 photoscanner와 젤 스캔.
4입니다. 2D SDS 페이지
- 수직 전기 시스템 (젤 크기 16 cm x 20 cm)를 조립 한다. 1mm 스페이서를 사용 합니다.
- 2D-빗 (스트립 및 분자량 표식에 대 한 하나의 표준 잘 큰 단일) 표준 SDS 젤 (12% 아크릴, 6 M 요소, 표 2제조 법 참조)를 준비 합니다.
- BN 젤에서 차선을 잘라내어 (5 mL) 튜브에. Laemmli 버퍼 (5% β-mercaptoethanol 포함)의 2 개 mL를 추가 하 고 실시간에 부드러운 진동으로 45 분 동안 스트립을 품 어
- 예를 들어, 기포 방지 젤 위에 스페이서의 도움으로 레인을 놓습니다.
- 피펫으로 5 종이 필터와 장소를 잘 표준 종이의 좁은 조각에 분자량 마커의 µ L.
- BN 젤 스트립 및 마커 종이 인감, (실행 버퍼)에 0.5 %agarose 젤 스트립 위에 부 어 하 고 공고히 하 허용.
- 전기 이동 법 프로토콜 표준에 따라 수행 합니다. 전기 이동 실행, 예를 들어, Sypro 루비 얼룩과 단백질 또는6에 따라 얼룩은 시각화.
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Representative Results
그림 1 에 대표적인 2D BN/SDS 페이지 시스템 digitonin 및 β-DM solubilized thylakoid 단백질 복합물의 분리 및 그들의 상세한 단백질 소 단위 구성 방법을 보여 줍니다. PSII-LHCII-PSI megacomplex, 2 개의 큰 PSII LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI 단량체 (m), PSII m/Cyt solubilized digitonin thylakoids ( 그림 1A상단 위에 가로 젤)의 단백질 복잡 한 패턴 포함 b6f, 느슨하게 바운드 (L)-LHCII 삼합체 (그림 1A). 약간 강한 세제, β-DM, 전체 thylakoid 막 ( 그림 1B상단 가로 젤), solubilizes 하지만 단백질 복합물 사이 약한 상호 작용을 유지 하기 위해 수 없습니다. Β-dm Thylakoid 가용 화 일반적으로, 생산 하 고 4 개의 PSII LHCII supercomplexes (와 다른 양의 LHCII 안테나 연결) PSII 이합체 (d) PSI PSII ATPase, m 및 Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII와 LHCII 모노 (그림 1B). Β-DM, 달리 digitonin LHCII 모노 머의 사소한 금액만을 생성합니다. 단백질의 복잡 한 패턴 공장 노출 다른 조명 조건에 따라 다를 수 있습니다 그리고 또한 돌연변이 라인, 이후 단백질 복잡 한 상호 작용은 동적이 고 즉, 단백질 인 산화에 사이 다를 수 있습니다. 그림 1 A와 B에에서 기본 젤 스트립 아래 SDS PA 젤 처음 digitonin 또는 β-DM solubilized 복잡 한 각 단백질의 polypeptide 구성을 나타냅니다.
그림 1. 2 차원 BN-페이지/SDS-페이지 애기 thylakoid의. Thylakoid 단백질 복합물 (A) 1 %digitonin 및 (B) 1% β-dm solubilized 고 1 D-BN-페이지 (상단에 차선)와 나중에 2D-SDS 페이지 각 단지의 개별 단백질 구성을 보여 먼저 분리 합니다. Laemmli 버퍼를 변성 시키기를 가진 BN 스트립의 외피, 인 단백질 소 단위 (BN 스트립)에서 각 단지의 해리 하 고 2D SDS 페이지 동안 수직 라인에 구분 됩니다. 단백질 식별 참조7,8에서 제시 하는 질량 분석 분석을 기반으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 버퍼 | 콘텐츠 | 코멘트 |
| 3.5% (T) 아크릴 (AA) BN 분리 젤 | 48 %AA, 1.5% 두번째-AA: 148 µ L 3xGel 버퍼: 700 µ L 75% (w/v) 글리세롤: 140 µ L 초순 H2소개할 1092 µ L 5 %AP: 15 Μ L TEMED 3 Μ L |
참고: 아크릴 신경 이다입니다. 사용 전에 바로 APS와 TEMED를 추가 합니다. 제조 법은 하나의 작은 비 엔 젤을 주조에 대 한 충분 합니다. |
| 12.5% (T) 아크릴 (AA) BN 분리 젤 | 48 %AA, 1, 5% 두번째-AA: 530 µ L 3xGel 버퍼: 700 µ L 75% (w/v) 글리세롤: 560 µ L 초순 H2소개할 290 µ L 5 %AP: 11 Μ L TEMED 2ΜL |
참고: 아크릴 신경 이다입니다. 사용 전에 바로 APS와 TEMED를 추가 합니다. 제조 법은 하나의 작은 비 엔 젤을 주조에 대 한 충분 합니다. |
| 3% (T) 아크릴 (AA) BN 스태킹 젤 | 20 %AA, 5% 두번째-AA: 180 µ L 3xGel 버퍼: 500 µ L 초순 H2소개할 800 µ L 5 %AP: 30 Μ L TEMED 3 Μ L |
참고: 아크릴 신경 이다입니다. 사용 전에 바로 APS와 TEMED를 추가 합니다. 제조 법은 하나의 작은 비 젤에 대 한 충분 합니다. |
| 젤 버퍼 x 3 | 1.5 M ACA 150 mM BisTris/HCl (pH 7.0) |
스토어 + 4 ˚c입니다. |
| CBB 버퍼 | 100 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 0.5 M ACA 30% (w/v) 자당 50 mg/ml Serva 블루 G |
스토어 + 4 ˚C |
| 양극 버퍼 | 50mm BisTris/HCl (pH 7.0) | 스토어 + 4 ˚c입니다. 버퍼는 10 배 재고 솔루션으로 준비 될 수 있다 |
| 음극 버퍼 | 50 mM Tricine 15 mM BisTris 0.01 %Serva 블루 G |
스토어 + 4 ˚c입니다. 버퍼 재고 솔루션 x 10으로 준비 될 수 있다, 염료 1 x 솔루션에 추가 |
| 25BTH20G | 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 20% (w/v) 글리세롤 0.25 mg/ml Pefabloc (갓 추가) 10mm NaF (갓 추가) |
2 X 재고 솔루션 (가 게 + 4 ˚C), 그러나 Pefabloc와 NaF를 갓 추가 버퍼를 준비 하실 수 있습니다. |
| 세제 버퍼 | 2% β-라우릴 maltoside/Digitonin (w/v) 25 mM BisTris/HCl (pH 7.0) 20% (w/v) 글리세롤 및 0.25 mg/ml Pefabloc (재고 솔루션에서 갓 추가) 10mm NaF (갓 추가) |
세제 (물)에 5-10% 재고 솔루션으로 준비 될 수 있다. 다른 세제를 사용 하는 경우 최종 세제 농도 최적화할 수 있다. |
표 1입니다. 버퍼 및 네이티브 젤 전기 이동 법을 위한 솔루션
| 버퍼 | 콘텐츠 | 코멘트 |
| Laemmli 버퍼 | 138 m m Tris/HCL pH 6.8 6 M 요소 22.2% (v/v) 글리세롤 4.4% SDS |
참조: 9 |
| 12% 아크릴, 6 M 요소 SDS 분리 젤 | 50 %AA, 1,33% 두번째-AA: 10.5 mL 20 %SDS: 0.7 mL 1.5 M Tris HCl (pH 8.8): 8.05 mL 요소: 12.6 g MQ-H2소개할 6.16 mL 10 %APS: 200 Μ L TEMED 28 Μ L |
참고: 아크릴 신경 이다입니다. 제조 법은 하나의 큰 SDS 젤 주조 적합 합니다. |
| 6% 아크릴, 6 M 요소 SDS 스태킹 젤 | 50 %AA, 1.33% 두번째-AA: 1.2 mL 20 %SDS: 0.2 mL 0.5 M Tris HCl (pH 6.8): 2.5 mL 요소: 3.6 g MQ-H2소개할 3.45 mL 10 %APS: 100 Μ L TEMED 10 Μ L |
참고: 아크릴 신경 이다입니다. |
| SDS 실행 버퍼 | 19 mM Tris 2.5 m m 글리신 0.01% SDS |
표 2입니다. 2D SDS 페이지 버퍼
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Discussion
광합성 에너지 변환 기계 thylakoid 막에 포함 된 큰 multisubunit 단백질 복합물으로 구성 된다. 이 프로토콜 애기 thaliana 2D SDS 페이지와 결합 된 BN 페이지에서 식물 thylakoid 단백질 복합물의 분석을 위한 기본적인 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 또한 담배와 시금치 thylakoids에서 thylakoid 단백질 복합물의 분석에 적합 하지만 작은 조정 해야 할 수도 있습니다.
막 단백질 복합물의 가용 화에 대 한 비 세제는 일반적으로 그들의 능력에 대 한 그들의 기본 형태로 단지를 보존 하기 위해 사용 됩니다. 여기, 두 가지 일반적으로 사용 되 세제 β-DM 및 digitonin 적용 했다. 라우릴 maltoside solubilizes 개별 단백질 복합물, 반면 더 큰 단백질 복잡 한 어셈블리10의 분석에 대 한 digitonin를 사용할 수 있습니다. 부피가 큰 구조적된 digitonin 단단히 appressed grana 파티션에 맞게 수 이며 따라서 thylakoid 막3,11만 appressed 비 지구를 solubilizes. 그것은 따라서 기질 thylakoids 및 grana 여백의 분석에 적합 합니다. 그러나, digitonin aminocaproic 산 (ACA) 함께 사용 하는 경우 조합 또한 appressed grana thylakoids12을 포함 하 여 전체 thylakoid 막 solubilizes. 알 수 없는 메커니즘을 통해 ACA digitonin을 파티션 간격 인접 grana 막 층 사이 액세스할 수 있습니다. 중요 한 것은, digitonin 단백질 복합물 사이 정한 상호 작용을 유지 하 고 따라서 정한 단백질의 분석에 사용할 수 있습니다 슈퍼와 비 appressed thylakoid 지역8에 가장 풍부한 고급. 그것은 세제 항상 단백질 복합물 사이 정한 상호 작용의 일부 방해 하 고 따라서 그것은 단백질 복합물의 완전히 그대로 네트워크 격리 수 주목 해야 합니다. 일부는 단지의 thylakoid 가용 화 하는 동안 더 큰 단백질 복잡 한 협회와는 전기 이동 법에서 연결이 분리 제품이 있습니다. BN 페이지 분리의 품질에는 샘플 준비 (단백질 복잡 한 가용 화)에 뿐만 아니라 신선한 잎에서 수행 되어야 합니다 thylakoid 격리의 품질에 따라 달라 집니다. 특별 한 주의 촬영 되지 않습니다 경우 PSII LHCII supercomplexes는 일반적으로 β-DM 가용 화 하는 동안 저하 될.
BN-페이지 solubilized 단백질 복합물의 무결성을 유지합니다. 그리고 비 엔 젤의 분리 용량 아크릴 그라데이션에 따라 그라데이션 관심의 단백질 복합물에 따라 최적화 되어야 합니다. 농도 기온 변화도 (총 아크릴 아 미드 농도, T)를 변경 하 여 또는 아크릴 아 미드 단위체4의 총 금액을 기준으로 bis-아크릴 아 미드 농도 (C)를 조정 하 여 polyacrylamide 젤의 기 공 크기를 수정할 수 있습니다. 여기 사용 BN PA 젤 그라데이션 최적화 이며 큰 단백질 슈퍼-고급3의 분석에 적합 합니다. 중요 한 것은, 겹쳐 쌓이는 젤의 기 공 크기 큰 분리 젤을 입력 하는 모든 단지 수 있도록 해야 합니다. 단백질 후 BN 페이지, 구성 또는 각 개별 단백질의 복잡 한 구조와 복잡 한 분리는 더 이상 분석할 수 있습니다. 단백질 구조 분석에 대 한 관심의 젤에서 eluted 해야 합니다 그리고 가장 불안정 단지는 차입 기간 동안 파괴 될 수 있습니다. 따라서 자당 밀도 그라데이션 구조 분석을 위한 단백질 복잡 한 정화에 대 한 더 자주 사용 됩니다. Coomassie 염료 같은 측정을 방해 하는 이후 젤에 단백질 복합물의 광 속성의 분석에 대 한 일반 기본 페이지 BN 페이지 대신 사용 해야 합니다. 단백질 복합물의 소 단위 구성의 분석, 대 한 변성 2D SDS 페이지는 여기 설명 되어 있습니다. 각 단지의 소 단위 수직 라인에서 분리 하 고 쉽게 확인 될 수 있다. 그것은 여러 가지 단백질 단일 자리에 있을 수 있으며 같은 세로줄에 있는 소 단위 분리 단지 공동 억 페이지에 마이그레이션에 속할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 바이오 매스 (SE2B) 마리 Skłodowska 퀴리 부여 계약 (675006)로 핀란드의 아카데미 (프로젝트 번호 307335 및 303757) 및 태양 에너지에 의해 재정적으로 지원 되었다. 프로토콜 참조3를 기반으로 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
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- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
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