Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58369

Summary

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Abstract

Fotosentetik Elektron transferi zinciri (vb) NADPH ve ATP şeklinde kimyasal enerji güneş enerjisi dönüştürür. Dört büyük protein kompleksleri elektron sudan NADP+ ile iki photosystems için sürücü ve ATP üretimi için oluşturulan proton degrade kullanmak için thylakoid membran hasat güneş enerjisi gömülü. Photosystem PSII, psişik, sitokrom b6f (Cyt b6f) ve ATPaz farklı yönlendirme ve thylakoid membran dinamikleri ile tüm multiprotein kompleksleri vardır. Kompozisyon ve thylakoid membran protein kompleksleri etkileşimleri hakkında değerli bilgiler elde hafif deterjan yerli jel elektroforetik ayrımı tarafından takip tarafından kompleksleri membran bütünlüğü gelen çözücü tarafından kompleksleri. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) protein kompleksleri yerli ve fonksiyonel formlarındaki ayrılması için kullanılan bir analitik yöntemdir. Yöntem protein kompleksi arıtma daha ayrıntılı yapısal analizi için kullanılabilir, ama aynı zamanda protein kompleksleri arasındaki dinamik etkileşimler incelemek için bir araç sağlar. Yöntem mitokondrial solunum protein kompleksleri, analiz için geliştirilmiştir ama beri en iyi duruma getirilmiş ve thylakoid protein kompleksleri diseksiyon için geliştirilmiş. Burada, biz değişken fotosentetik protein kompleksleri ve onların etkileşimlerde Arabidopsis thalianaanalizi için detaylı güncel iletişim kuralı sağlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Büyük multisubunit protein kompleksleri photosystem PSI ve PSII, Cyt b6f ve ATPaz koordine NADPH ve ATP üretimi fotosentetik ışık reaksiyonlarda. Daha yüksek bitki kloroplast içinde kompleksleri appressed grana ve appressed stroma thylakoids oluşan bir yapısal olarak heterojen membran yapıdır thylakoid zarının içinde yer alır. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) büyük multisubunit protein kompleksleri onların yerli ve biyolojik olarak aktif biçimde analizinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Yöntem mitokondrial membran protein kompleksleri1diseksiyon için kuruldu, ancak sonra thylakoid membran ağ3protein kompleksleri ayrılması için özelleştirilmiş. Yöntem (i) tek tek thylakoid protein kompleksleri için yapısal analizi, (ii) yerli protein kompleksleri Hofstede belirlemek için ve (iii) protein kompleksleri genel organizasyonu analizi için arıtma için uygundur çevre ipuçları değiştirme üzerine.

Ayrılık öncesinde protein kompleksleri genellikle hafiftir ve protein kompleksleri doğal yapısını korumak dikkatle seçilmiş Nonyonik deterjanlar ile membran etkilenmezsiniz. Deterjanlar içeren hidrofobik ve hidrofilik siteleri ve form istikrarlı micelles bir belirli konsantrasyon, yukarıda adı verilen bir kritik micellar konsantrasyonu (CMC). CMC sonuçlarının lipid-lipid etkileşimleri bozulma ve protein kompleksleri solubilization üzerinde deterjan konsantrasyonu artan. Deterjan seçimi protein kompleksi ilgi kararlılığını ve deterjan solubilization kapasitesine bağlıdır. Rutin olarak kullanılan deterjanlar α/β-Lauryl-maltoside ve digitonin içerir. Protein kompleksleri içinde onların yerli durum solubilization çözünmez malzeme Santrifüjü tarafından kaldırılır. Yüksek bitkilerde thylakoid membran yapısı içinde son derece heterogenic ve bazı deterjanlar (Örneğin, digitonin), seçmeli olarak membran3yalnızca belirli bir kısmını solubilize. Bu nedenle, protein kompleksi kuruluş ya da protein kompleksleri arasındaki etkileşimler ayırdetmek için bu her zaman klorofil içeriği ve klorofil a/b belirleyerek seçilen deterjan solubilization kapasitesini belirlemek önemlidir verim ve temsil thylakoid (sub) etki alanı, sırasıyla, solubilized kısmını değerlendirmeye süpernatant sayısına oranı. Büyüme-ışık iklime alıştırılacağı bitkilerin sağlam thylakoids klorofil a/b oranı genellikle yaklaşık 3, ise chl bir / b değeri thylakoid kesirler zenginleştirilmiş grana birinde veya stroma thylakoids düşer (~ 2.5 altında) veya (~ 4.5) toplam değerini aşıyor thylakoids, anılan sıraya göre.

Protein kompleksleri için negatif yük sağlamak için Coomassie parlak mavi (CBB) boya solubilized örneğe eklenir. Şarj kayması nedeniyle protein kompleksleri anot doğru göç ve molekül ağırlığı ve şekil göre bir Akrilamid (AA) degrade olarak ayrılır. Etkili ve yüksek çözünürlüklü ayırma doğrusal akrilamid konsantrasyon gradyanı kullanılarak elde edilir. Onlar kendi boyut bağımlı gözenek boyutu sınırına ulaşıncaya kadar Elektroforez sırasında protein kompleksleri anot doğru göç. (İ toplam akrilamid polyacrylamide jel gözenek büyüklüğüne bağlıdır /bis- akrilamid konsantrasyonu (T) ve (II) cross-linker bis- akrilamid monomer konsantrasyonu (C) göre toplam monomerleri4. BN-sayfa ile boşanmadan sonra protein kompleksleri daha fazla onların bireysel protein alt ikinci boyut (2D) - SDS - sayfa tarafından alt. Burada, thylakoid membran protein kompleksleri BN-/ 2D SDS-sayfa tarafından çözümlenmesi için detaylı bir protokol açıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. hazırlanması BN jel1,2,3

  1. Jel tekeri plakalı 8 cm x 10 cm (dikdörtgen cam ve çentikli alümina plaka) 0,75 mm mesafe tutucular kullanarak üretici yönergelerine göre ayarlayın.
  2. Bir degrade karıştırıcı bir heyecan tabağa yerleştirin ve bir tüp tarafından peristaltik pompa ile bağlayın. Bir şırınga iğnesi tüp diğer ucunu takın ve cam ve alüminyum plaka arasında iğne yerleştirin. "Ağır" (H) için yer manyetik karıştırıcı-odası.
  3. %3.5 (v/v) ve (v/v) % 12.5 15 mL konik santrifüj tüpleri çözümlerinde Akrilamid (AA) ayırma jel degrade için hazırlamak (bkz. Tablo 1tariflerde). Zamansız polimerizasyon önlemek için çözümler hazırlarken santrifüj tüpleri buz üzerinde tutun.
    Dikkat: Akrilamid nörotoksik ve kanserojen, aşınma koruyucu elbise ve eldivenler var.
  4. % 5 APS ve TEMED doğru çözümler degrade Mixer pipetting önce ekleyin. Damlalıklı H-Odası % 12.5 çözümü.
    1. Hava kabarcıkları "light" (L) ve H-odası L odasına girmek çözüm sağlayan iki odaları bağlanma Vana açarak bağlanma kanal kaldırın. Çözüm izleri H-odasına geri Vana ve damlalıklı kapatın.
    2. Son olarak, damlalıklı L-odası % 3,5 çözümü.
  5. Manyetik karıştırıcı geçiş (heyecan hız kritik değildir, ancak uygun ağır ve hafif çözümler karıştırma emin olmalısınız), vanaları açın ve peristaltik pompa geçin. Cam ve alüminyum plaka arasında akmaya jel çözümleri sağlar, debisi yaklaşık 0.5 mL/dk olmalı. İğne sıvı her zaman olmalı, cam levha bir bant ile üst kısmındaki eklenebilir.
  6. Ne zaman H ve L chambers boşluk, onları Ultrasaf Su ile doldurun ve yavaşça jel yüzeyi yerleşimi için su sağlar. Jel polimerizasyon 1-2 saat civarında RT. alır.
  7. %3 akrilamid çözüm hazırlamak (bkz. Tablo 1' deki tarifi) istifleme için RT. damlalıklı polimerli ayrılık jel üstüne yığın jel jel (yığın jel döküm önce jel yüzeyi overlaying su kaldırmak) ve bir örnek jel tarak yer Cam ve alüminyum plaka kaçınarak hava kabarcıkları arasında.
    1. 30-60 dk RT. Kaldır tarak yavaşça Ultrasaf Su altında az polimerize olanak sağlar. 4 ˚C, jel saklayın.
      Durma noktası. Jel 4 ˚C bir kaç gün saklanabilir. Jel kuyuları ve jel yüzey kurutma önlemek için nemli ortamlarda tutulmalıdır.

2. Thylakoid Solubilization1,2,3

Not: Tüm adımları çok loş ışık altında yapılmalıdır. Örnekleri ve arabellekleri buz üzerinde tutun.

  1. Buz gibi 25BTH20G arabellek son klorofil konsantrasyonu 1 mg/ml ile izole thylakoids oranında seyreltin. İçin klorofil 2D-BN-SDS-sayfa analizi yaklaşık 4-8 µg / örnek uygundur.
    Not: deneylerde kullanılan thylakoids (için protokol thylakoid yalıtım, bkz:3) taze yaprakları yalıtılmış olması gerekir
  2. Eşit miktarda deterjan arabellek, Yani, % 2 β-DM (w/v) veya % 2 eklemek digitonin (w/v). Thylakoid örnek için deterjan karışımı yavaşça damlalıklı ucu ile ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçının. Son deterjan % 1 ve thylakoids 0,5 mg Chl/mL olan bölgedir.
    1. Thylakoids 2 dakika buz (β-DM) veya RT sürekli nazik bir rocker/shaker (digitonin) karıştırma ile 10 dakika solubilize.
      Not: Digitonin ve β-DM genellikle thylakoid protein kompleksleri solubilization için kullanılır. Diğer non-iyonik deterjanlar kullandıysanız, deterjan konsantrasyon ve solubilization saat önce optimize edilmiş olması gerekir. Genellikle deterjan konsantrasyon aralığı üzerinden % 0.5-%5 (v/v).
      Uyarı: Toksik, aşınma koruyucu elbise ve eldivenler Digitonin olduğunu
  3. İnsolubilized malzeme Santrifüjü 18.000 x g 4 ˚C, 20 dk için de çıkarın.
  4. Yeni bir 1,5 mL tüp süpernatant nakletmek ve 1/10 (v/v) CBB arabelleği için örnek eklemek.
    Not: thylakoid membran protein kompleksleri genel kompozisyon incelendiğinde, verim ve çözündürüldükten kesir temsil thylakoid etki alanını belirleme önerilir. Solubilized malzeme verim belirlemek için (CBB eklemeden önce) için yeni bir tüp süpernatant ile 5 µL al ve Chl içerik ve Chl ölçmek bir / b oranı5.

3. BN-sayfa1,2,3

  1. Jel bir dikey elektroforez sistemi (Örneğin, Hoefer SE 250) için ayarlayın. Üst arabellek odası mavi katot arabellek ile doldurun (bkz. Tablo 1) ve anot arabellek alt arabellek odasına dökün.
  2. Thylakoid örnek (Örneğin, 5 klorofil µg) kuyu yükleyin.
  3. Elektroforez başlayın ve yavaş yavaş voltajı artırmak: 75 V 30 dk için 30 dk için 100 V, 125 V 30 dk, 150 V 1 h için ve 175 V kompleksleri kadar ayrılmış tamamen. Koşmak, jel + 4˚C, soğuk bir oda kullanma ya da jel sıcaklık soğutma sistemi ile ayarlama.
    Not: örnek açık yaklaşık üçte biri jel göç mavi katot arabellek açık katot arabellek için değiştirmiş olursunuz.
  4. Elektroforetik çalıştırdıktan sonra jel ile görüntü arşivleme için bir photoscanner inceden inceye gözden geçirmek.

4. 2D-SDS-SAYFA

  1. Dikey elektroforez sistemi (jel boyutu 16 cm x 20 cm) bir araya getirin. 1 mm boşluk ekleyiciler kullanın.
  2. 2D-tarak (tek büyük şerit ve molekül ağırlığı işaretçi için bir standart iyi için iyi) ile standart SDS jel (% 12 akrilamid, 6 M üre, Tablo 2' deki bkz: tarifi) hazırlayın.
  3. Lane BN-jel keser ve bir (5 mL) tüpe yerleştirir. Laemmli arabellek (%5 β-mercaptoethanol içeren) 2 mL ekleyin ve nazik RT. sallayarak ile 45 dk için şerit kuluçkaya
  4. Örneğin, ayırıcı, üstünde tepe-in hava kabarcıkları kaçınarak jel yardımıyla ile lane yerleştirin.
  5. Damlalıklı 5 µL molekül ağırlığı işaretçisini filtre kağıdı ve yer iyi standart kağıt dar bir parçası üzerinde.
  6. BN-jel şerit ve marker kağıt imzalamaya, (içinde tampon çalıştıran) % 0.5 özel jel şerit üzerine dökün ve kuvvetlendirmek için izin.
  7. Elektroforez standart protokolleri göre gerçekleştirin. Elektroforetik çalıştırdıktan sonra proteinler ile Örneğin, Sypro Ruby leke veya gümüş göre6boyama görselleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 1 ' deki temsilcisi bir 2D-BN/SDS-sayfa sistemi digitonin ve β-DM-çözündürüldükten thylakoid protein kompleksleri ayrılması ve kendi detaylı protein alt birimi kompozisyon göstermektedir. Çözündürüldükten digitonin thylakoids ( Şekil 1Aüst üstte Yatay jel) protein karmaşık desen içerir PSII-LHCII-PSI megacomplex, iki büyük PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSII m/Cyt b6f, (L) gevşek bağlı-LHCII trimer (Şekil 1A). Biraz daha güçlü deterjan, β-DM, tüm thylakoid membran ( Şekil 1Büst kısmında yatay jel) solubilizes ama protein kompleksleri arasındaki zayıf etkileşimler korumak değiştiremiyor. Thylakoid solubilization β-DM ile genellikle dört PSII-LHCII supercomplexes (ile LHCII anten bağlı farklı büyüklükte), PSII dimer (d) ve PSI m, ATPaz, PSII m üretir ve Cytb6f, M-LHCII, L-LHCII ve LHCII monomer (Şekil 1B). β-DM, digitonin LHCII monomer yalnızca küçük miktarda üretir. Protein karmaşık desen farklı ışık koşullarında bitki maruz bağlı olarak farklı olabilir ve aynı zamanda protein karmaşık etkileşimler dinamik ve Yani, protein fosforilasyon bağımlı olduğundan mutant satırları arasındaki farklılık gösterebilir. SDS-PA jelleri aşağıda Şekil 1 A ve B yerli jel şeritler başlangıçta digitonin veya β-DM ile çözündürüldükten polipeptid bileşimi her protein kompleksi temsil.

Figure 1
Şekil 1. Bir iki boyutlu BN-/ SDS-sayfası Arabidopsis thylakoid. Thylakoid protein kompleksleri (A) %1 digitonin ve % 1 (B) β-DM ile çözündürüldükten ve ilk 1 D-BN-sayfa (üst şerit) ve daha sonra üzerinde 2D-SDS-her karmaşık bireysel protein bileşimi göstermek için sayfa ayrılmış. Laemmli arabellek denaturing ile kuluçka BN-şeritler nedeniyle (BN şerit içinde) her Kompleks protein alt ayırmak ve bir dikey çizgi 2D-SDS-sayfa sırasında ayrılır. Protein kimlik başvurular7,8' sunulan kütle spektrometresi analize dayalı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Arabellek İçerik Yorumlar
%3.5 (T) Akrilamid (AA) BN ayrılık jel %48 AA % 1.5 BIS-AA: 148 µL
3xGel arabellek: 700 µL
%75 (w/v) gliserol: 140 µL
Ultrasaf H2O: 1092 µL
% 5 APS: 15 ΜL
TEMED 3 ΜL
Not: Akrilamid sinir hücrelerini tahrip eder. APS ve TEMED kullanımdan hemen önce ekleyin. Bir küçük BN jel döküm için yeterli bir reçetedir.
12.5 (T) % Akrilamid (AA) BN ayrılık jel % 48'aa, %1,5 BIS-AA: 530 µL
3xGel arabellek: 700 µL
%75 (w/v) gliserol: 560 µL
Ultrasaf H2O: 290 µL
% 5 APS: 11 ΜL
TEMED 2ΜL
Not: Akrilamid sinir hücrelerini tahrip eder. APS ve TEMED kullanımdan hemen önce ekleyin. Bir küçük BN jel döküm için yeterli bir reçetedir.
% 3 (T) Akrilamid (AA) BN istifleme jel %20 AA % 5 BIS-AA: 180 µL
3xGel arabellek: 500 µL
Ultrasaf H2O: 800 µL
% 5 APS: 30 ΜL
TEMED 3 ΜL
Not: Akrilamid sinir hücrelerini tahrip eder. APS ve TEMED kullanımdan hemen önce ekleyin. Bir küçük BN jel için yeterli bir reçetedir.
3 x jel arabellek 1,5 M ACA
150mM BisTris/HCl (pH 7,0)
Mağazada + 4 ˚C.
CBB arabellek 100 mM BisTris/HCl (pH 7,0) 0, 5 M ACA
%30 (w/v) sükroz
50 mg/ml Serva mavi G
Mağazada + 4 ˚C
Anot arabellek 50 mM BisTris/HCl (pH 7,0) Mağazada + 4 ˚C. Arabellek 10 x hisse senedi çözüm olarak hazırlanabilir
Katot arabellek 50 mM Tricine
15 mM BisTris
% 0,01 Serva mavi G
Mağazada + 4 ˚C. Tampon 10 x hisse senedi çözüm olarak hazırlıklı olun, boya 1 x ekleyin
25BTH20G 25 mM BisTris/HCl (pH 7,0)
%20 (w/v) gliserol
0.25 mg/ml Pefabloc (taze Ekle)
10 mM NaF (taze Ekle)
Arabellek 2 hisse senedi çözüm (mağaza, + 4 ˚C) X, ama Pefabloc ve NaF taze eklemek gibi hazır olun
Deterjan arabellek % 2 β-Lauryl maltoside/Digitonin (w/v)
25 mM BisTris/HCl (pH 7,0)
%20 (w/v) gliserol ve
0.25 mg/ml Pefabloc (hisse senedi eriyik--dan taze Ekle)
10 mM NaF (taze Ekle)
Deterjanlar, % 5-10 hisse senedi çözümlerinde (su) olarak hazırlanabilir. Diğer deterjanlar kullandıysanız, optimize edilmiş olması son deterjan konsantrasyonu vardır.

Tablo 1. Arabellekleri ve yerel Jel Elektroforez için çözümler

Arabellek İçerik Yorumlar
Laemmli arabellek 138 mM Tris/HCL pH 6.8
6M üre
%22,2 (v/v) gliserol
%4.4 SDS
Referans: 9
%12 akrilamid, 6M üre SDS ayrılık jel % 50 AA, %1,33 BIS-AA: 10,5 mL
% 20 SDS: 0.7 mL
1,5 M Tris-HCl (pH 8.8): 8.05mL
Üre: 12.6 g
MQ-H2O: 6,16 mL
% 10 APS: 200 ΜL
TEMED 28 ΜL
Not: Akrilamid sinir hücrelerini tahrip eder. Tarifi bir büyük SDS-jel döküm için uygundur.
%6 akrilamid, 6M üre SDS yığınlama jel % 50 AA, %1.33 BIS-AA: 1.2 mL
% 20 SDS: 0.2 mL
0,5 M Tris-HCl (pH 6.8): 2.5 mL
Üre: 3,6 g
MQ-H2O: 3.45 mL
% 10 APS: 100 ΜL
TEMED 10 ΜL
Not: Akrilamid sinir hücrelerini tahrip eder.
SDS çalıştıran arabellek 19 mM Tris
2.5 mM glisin
% 0,01 SDS

Tablo 2. 2D-SDS-sayfası arabellekleri

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fotosentetik enerji dönüşüm makine thylakoid membran gömülü büyük multisubunit protein kompleksleri oluşur. Bu iletişim kuralı için çözümleme-in bitki thylakoid protein kompleksleri Arabidopsis thaliana BN sayfalı 2D-SDS-sayfa ile kombine ile gelen temel yöntemi açıklanır. Protokolü de thylakoid protein kompleksleri gelen tütün ve ıspanak thylakoids çözümlenmesi için uygundur, ama ufak değişiklikler gerektirebilir.

Membran protein kompleksleri solubilization için Nonyonik deterjanlar kendi yerel formunda kompleksleri korumak için yeteneklerini için yaygın olarak kullanılır. Burada, iki yaygın olarak kullanılan deterjanlar β-DM ve digitonin uygulandı. Digitonin daha büyük protein kompleksi derlemeler10analiz için kullanılabilir, ancak bireysel protein kompleksleri, Lauryl maltoside solubilizes. Hantal yapılandırılmış digitonin sıkıca appressed grana bölümleri için uygun bulunmamaktadır ve bu nedenle sadece appressed olmayan bölgeleri thylakoid membran3,11solubilizes. Bu nedenle stroma thylakoids ve grana kenar boşlukları analiz için uygundur. Ancak, digitonin aminocaproic asit (ACA) ile birlikte kullanıldığında, kasanın da appressed grana thylakoids12de dahil olmak üzere tüm thylakoid membran solubilizes. Bilinmeyen bir mekanizmayla ACA digitonin bölüm aralığa bitişik grana membran katmanlar arasında erişimi olmasını sağlar. Önemlisi, digitonin protein kompleksleri arasında değişken etkileşimleri korur ve bu nedenle değişken protein analizi için kullanılabilir super ve megacomplexes, appressed thylakoid bölgeler8' en bol miktarda bulunmaktadır. Deterjanlar her zaman bazı protein kompleksleri arasında değişken etkileşimlerin müdahale ve bu nedenle tamamen bozulmamış protein kompleksleri ağının izole etmek mümkün değildir dikkat edilmelidir. Bazı konut projeleri thylakoid solubilization sırasında daha büyük protein karmaşık ilişkileri ve Elektroforez kesildikten ayrılma ürünlerdir. BN-sayfa ayırma kalitesi numune hazırlama (protein kompleksi solubilization) sadece, aynı zamanda taze yaprakları yapılması gereken thylakoid yalıtım kalitesine bağlıdır. Eğer özel bakım alınır değil, PSII-LHCII supercomplexes genellikle β-DM solubilization sırasında bozulmasına yol açar.

BN-sayfa çözündürüldükten protein kompleksleri bütünlüğünü korur. Akrilamid degrade BN jel ayırma kapasitesine bağlıdır ve degrade faiz protein kompleksleri üzerinde göre optimize edilmelidir. Polyacrylamide jel gözenek boyutunu konsantrasyon gradyanı (Toplam akrilamid konsantrasyon, T) değiştirerek veya akrilamid monomerleri4toplam miktarı göreceli olarak bis- akrilamid konsantrasyonu (C) ayarlayarak değiştirilebilir. Burada kullanılan BN-PA jel geçişin en iyi duruma getirilmiş ve iyi büyük protein süper - ve megacomplexes3analiz için uygun. Önemlisi, gözenek-boyutu yığın jel ayrılık jöleye girmek bütün kompleksleri izin vermek için büyük olmalıdır. Protein sonra karmaşık ayırma BN-sayfa, her bireysel protein karmaşık grup yapısını veya kompozisyon ile daha da analiz edilebilir. Yapısal analiz için protein kompleksi faiz jel eluted gerekir ve en değişken kompleksleri elüsyon sırasında tahrip olabilir. Bu nedenle, sukroz yoğunluk gradient daha sık protein kompleksi arıtma yapısal analizi için kullanılır. Coomassie boya gibi ölçümleri ile müdahale beri jel içinde protein kompleksleri spektroskopik özellikleri analiz için açık ana sayfa BN-sayfa yerine kullanılmalıdır. Protein kompleksleri alt birim kompozisyon analizi için denaturing bir 2D-SDS-sayfa burada açıklanmıştır. Alt birimleri her kompleks bir dikey çizgi ayrılır ve kolayca tespit edilebilir. Bu birkaç proteinler tek bir nokta mevcut olabilir ve alt birimleri aynı dikey çizgi BN SAYFALIK birlikte geçirme kompleksleri ayırmak için ait olabilir belirtmek zorunda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma mali biyokütle (SE2B) Marie Skłodowska-Curie hibe sözleşmesine (675006) Finlandiya Akademisi (proje numaraları 307335 ve 303757) ve güneş enerjisi tarafından desteklenmiştir. İletişim kuralı başvuru3dayalı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-aminocaproic acid (ACA) Sigma-Aldrich A2504
BisTris Sigma-Aldrich B4429
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Acrylamide (AA) Sigma-Aldrich A9099 Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside Sigma-Aldrich D4641
Tricine Sigma-Aldrich T0377
Tris Sigma-Aldrich T1503
SDS VWR 442444H
Urea VWR 28877.292
Glycerol J.T. Baker 7044
Sodium Fluoride (NaF) J.T. Baker 3688
EDTA disodium salt J.T. Baker 1073
Digitonin Calbiochem 300410 Caution:Toxic!
Pefabloc SC Roche 11585916001
Serva Coomassie Blue G Serva 35050
β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
APS (Ammonium persulfate) Bio-Rad 161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine) Bio-Rad 1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide Omnipur 2610
Glycine Fisher G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) New England Biolabs P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml Corning 352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates Hoefer SE215
Gradient maker SG5 Hoefer
0.75 mm T-spacers Hoefer SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm Hoefer SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system Hoefer SE250
IPC-pump Ismatec
Power supply, PowerPac HV Bio-Rad 164-5097
Centrifuge Eppendorf 5424R
Rocker-Shaker Biosan BS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell
Bio-Rad 1651813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
  3. Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
  4. Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
  5. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 384-394 (1989).
  6. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
  7. Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
  8. Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
  11. Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
  12. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).More

Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (139), e58369, doi:10.3791/58369 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter