Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

اكتشاف 3-نيتروتيروسيني في بيئة الغلاف الجوي عن طريق عالية أداء نظام سائل الكاشف اللوني الكهروكيميائية

doi: 10.3791/58371 Published: January 30, 2019

Summary

نحن نقدم طريقة للكشف عن التعديلات الكيميائية 3-نيتروتيروسيني للبروتينات الغلاف الجوي مع جولات مم 6 قطع من بريفيلتيرس عينات الهواء باستخدام كاشف لوني الكهروكيميائية سائلة عالية الأداء ([هبلك]-نماء الطفولة المبكرة).

Abstract

3-نيتروتيروسيني (3-NT) يتم إنشاؤها من بقايا التيروسين في الغلاف الجوي والهباء الجوي الحيوي البروتينات عن طريق رد فعل مع الأوزون (O3) وثاني أكسيد النتروجين (رقم2). مستقرة 3-NT هو علامة معينة للضرر التأكسدي ويقال أن لها أثرا تشجيعية للحصول على الحساسية. في هذه الدراسة، ونحن تقرير تنمية مقايسة حساسة للغاية لقياس 3-الإقليم الشمالي في مرشحات الهواء أخذ العينات لجمع < 2.5 ميكرون من الجسيمات (الساعة2.5) من الهواء البيئية في المناطق الحضرية، بما في ذلك الهباء الجوي الحيوي. في هذا الأسلوب، وقطرها 6 ملم فتحه مستديرة كان قطع من عوامل التصفية لأخذ العينات من الهواء وتمتزج حوزتي غير محدد كوكتيل كي يتحلل البروتينات. تم اختبار عينات البروتين يهضم إلى مستوى الأحماض الأمينية ل 3-NT استخدام كاشف لوني الكهروكيميائية سائلة عالية الأداء ([هبلك]-نماء الطفولة المبكرة). تم الكشف عن محتوى 3-NT الحد الأقصى في prefilter للساعة أحجام من 4.5 إلى 7.3 ميكرومترات، مع الكشف عن حد من 1.13 بيكوغرام/م3.

Introduction

الهباء الجوي أو المحمولة جوا الساعة تحتوي على بروتينات من أصول بيولوجية مختلفة، بما في ذلك الفيروسات وبدائيات النوى، والفطريات، والنباتات (حبوب اللقاح) والحيوانات (الحشرات، الإنسان)1. نسبة البروتين في الساعة يقدر بحوالي 5%، الذي كان متورطا بالقيام بدور رئيسي ك حساسية المحمولة جوا2. وتشير التقارير الأخيرة إلى أن الهباء الجوي المحيط الحضري من مختلف الأحجام تحتوي على الأحماض الأمينية بنسب تتراوح بين 0.5% و 2%3. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترحت التعديلات الكيميائية للبروتينات بعد الظهر التي ستنتج عن ردود فعل البروتينات مع الملوثات المختلفة، مثل3س، وثاني أكسيد النيتروجين (رقم2)، وثاني أكسيد الكبريت (هكذا2)4.

3-NT-تعديل بروتين – تم إنشاؤه بواسطة نترته المخلفات تيروزين. قد تبين وجود تركيز أعلى من س3 وليس2 لتعزيز نترته الجزيئات البروتينية في الفضاء الجوي الزائفة5،6. نترته المخلفات تيروزين في سلسلة ببتيد يعزز إمكانات مثيرة للحساسية من حبوب اللقاح البروتينات7. وهكذا القياس الكمي والتقييم من NT 3 المحمولة جوا جانبا مهما في معالجة الشواغل المتعلقة بالصحة البيئية.

3-الإقليم الشمالي المعروف أيضا العلامات البيولوجية للأكسدة و nitrosative الإجهاد8. وقد أظهرت هيئة ناشئة من الأدلة عصابة كبيرة من المحتوى 3-NT مع عدة أمراض الإنسان9،10. نظراً لما له من آثار ضارة، والكشف عن وتقدير كمي ل 3-الإقليم الشمالي في عينة بيولوجية يعقد أهمية كبيرة في تحديد الحالة الصحية للفرد. وقد أدخلت في السنوات الأخيرة، أساليب متنوعة لتقدير محتوى 3-الإقليم الشمالي، بما في ذلك فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط، [هبلك]، و LC/MS11. في دراسات سابقة، أبلغنا أسلوب الكشف عن استخدام التقنية [هبلك]-النماء أنعم بالعديد من المزايا مقارنة بالأساليب السابقة. على سبيل المثال، [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة لا تتطلب إجراء استخراج أو derivatization، مما يجعل من نظام مقايسة بسيطة نسبيا12. وقد أكدنا أن هذا الأسلوب قابلاً للكشف عن 3-NT من العينات البيولوجية (البلازما من الإنسان والفئران).

على الرغم من أن العديد من التحقيقات أكدت اكتشاف 3-الإقليم الشمالي في العينات البيولوجية، الكشف عنها في عينات نونبيولوجيكال لا يزال بعيد المنال، ومن ثم اتبعت هذه الدراسة. في الواقع، لتقييم الآثار الضارة للهواء 3-الإقليم الشمالي، كمية مفيدة للكشف عن 3-NT مباشرة من الجسيمات المحمولة جوا مطلوب أسلوب؛ ولذلك، قمنا بتطبيق الأسلوب [هبلك]-النماء الموجودة للكشف عن 3-NT من الساعة2.5 جمعت في عامل تصفية من ألياف زجاجية. باستخدام هذا الأسلوب، 3-NT يمكن الكشف عن مباشرة من الصغيرة قطعة (6 ملم-قطر الجولة ثقوب) عينة من عامل تصفية مجموعة م. ونحن كذلك تقييم محتوى 3-NT لأحجام مختلفة من الساعة وقياس حدود الكشف 3-NT. وتقترح هذه المادة طريقة حساسة عالية والفائق للكشف عن 3-NT مباشرة من عينات نونبيولوجيكال والبيولوجية على حد سواء.

Protocol

1-جمع إجمالي علقت جسيمات PM2.5، أو الساعة7وطريقة التحلل المائي للبروتينات بعد الظهر

  1. جمع رئيس الوزراء من عامل تصفية prefilter أو النسخ الاحتياطي.
    1. قبل جمع مجموع الجسيمات المعلقة (ملعقة صغيرة) والساعة2.5م7، تزن الكوارتز عامل التصفية.
      ملاحظة: نظراً لأن التلوث من الببتيدات والبروتينات بعد الظهر لا ينبغي أن يؤثر على كشف تيروزين نترته (كما أنها تفتقر إلى مجموعة نيترو)، نحن لم تعامل تصفية الكوارتز عند درجة حرارة عالية قبل أخذ القياس. بالإضافة إلى ذلك، كان المحتوى 3-الإقليم الشمالي في عامل التصفية الكوارتز ضمن حدود الكشف، كما يحددها [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة.
    2. تعيين عامل تصفية مرو على عينة كبيرة الحجم هواء مع محدد حجم جسيمات لجمع الساعة7 بمعدل تدفق 1,000 لتر في الدقيقة بشكل مستمر لمد 7 (الشكل 1B). ملعقة صغيرة يمكن جمعها في عامل تصفية كوارتز دون حجم محدد (الشكل 1A).
    3. جمع الساعة2.5 استخدام عينة صغيرة الحجم هواء مع وحدة تصنيف حجم بمعدل تدفق 116 لتر في الدقيقة بشكل مستمر ل 7 د استخدام هذه الوحدة، يمكن تصنيف الجسيمات كملعقة صغيرة-م15 والساعة7، 15-3، م2، 4، 5-5والساعة7.3-4.5 وجمعها على مرشحات الكوارتز للتصنيف. ويمكن جمع الساعة2.5 إلى عامل تصفية النسخ احتياطي (الشكل 1).
    4. سجل حجم التدفق الإجمالي في وقت جمع عامل التصفية. قياس وزن ملعقة صغيرة، الساعة2.5، و الساعة7 على عوامل التصفية عن طريق طرح وزن بريكوليكشن من وزن بوستكوليكشن. ختم عامل التصفية في كيس من بلاستيك وتخزينها عند-30 درجة مئوية حتى الخطوة التالية (انظر القسم 2).
  2. بروتيوليزي العينات.
    1. حل كوكتيل حوزتي غير محدد مع عازلة اسيتات 0.1 M (درجة الحموضة 7.4). وضع الحل في غشاء الديال (الوزن الجزيئي استقطاع = دا 5,000) وتزج أنه في 1 لتر من المخزن المؤقت اسيتات 0.1 M مع التحريك في 4 درجات مئوية. استبدال المخزن المؤقت 2 × كل ح 12، وثم إجراء الغسيل الكلوي بين عشية وضحاها من أجل إزالة NT 3 الذاتية والنترات (لا2). وبعد الغسيل الكلوي، جمع الحل وقياس تركيز البروتين بمقايسة البروتين (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك.
    2. لكمه الدوائر الجولة 6 مم من prefilter أو تصفية النسخ الاحتياطي ووضعها في microtubes. يمكن استخدام ما يصل إلى خمس قطع من الكسور 6 مم للتحليل (الشكل 2).
    3. إضافة 300 ميليلتر من 0.1 م خلات مخزن يحتوي على 50 ميكروغرام من بروتين حوزتي غير محدد كوكتيل (أعد الخطوة 1.2.1) إلى أنبوب يتحلل البروتينات بعد الظهر عند 50 درجة مئوية ح 16 بالتناوب.
      ملاحظة: لطرح الذاتية 3-NT من الحل كوكتيل حوزتي غير محدد، من الضروري إعداد وهضم عينة كوكتيل فقط البروتياز غير محدد.
    4. شطف الغشاء ultrafiltration جنبا إلى جنب مع أنبوب الموردة لها بإضافة 0.1 م خلات المخزن المؤقت وسينتريفوجينج (10,000 x ز لمدة 30 ثانية؛ سرعة الضبط يعتمد على الغشاء)، المقرر أن تلويث المواد الكيميائية مماثلة إلى 3-الإقليم الشمالي في الغشاء. تكرار شطف 1 x.
    5. بروتيوليسيس ما بعد، الطرد المركزي هذه العينات في س 2,500 ز لأدنى 10 تحميل المادة طافية في الغشاء أولترافيلتريشن والطرد المركزي تبلغ 000 10 x ز و 4 درجات مئوية عن أولترافيلتريشن (موكو = 10,000)، حتى يتم تجميع حجم كاف شطف. تخزين الواتيس في 4 درجات مئوية في الظلام.
      تنبيه: بسبب الكشف عن ذروة مماثلة إلى 3-الإقليم الشمالي في عمود الدوران، يكون من الضروري غسله جيدا بالماء النظيف أو مع المخزن مؤقت مثل الماء [هبلك] والمخزن مؤقت اسيتات 0.1 م مسبق لاستخدام.

2-تحديد المحتوى 3-الإقليم الشمالي في ملعقة صغيرة والساعة2.5، والساعة7عبر عالية أداء اللوني السائل ونظام كشف الكهروكيميائية ([هبلك]-نماء الطفولة المبكرة)

ملاحظة: انظر الشكل 3.

  1. التحضير لمرحلة الجوال.
    1. إعداد 0.2 M الفوسفات المخزن المؤقت (pH 2.5) التي تحتوي على 50 مغ/لتر يدتا. قياس قبالة 98 حجم المخزن المؤقت ومجلدين من الاسيتو الانيتريل ([هبلك] الصف) وصب لهم في زجاجة زجاج نظيفة والمزيج بقوة بحد أقصى.
    2. تسوية المرحلة المتنقلة في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات حتى يذهب الهواء المذاب مسطحة.
      ملاحظة: إذا كان يتم تشغيل النظام في وقت سابق، مرحلة متنقلة يمكن سونيكاتيد ويطرد تحت فراغ. ومع ذلك، الإفراط ولﻵﻻت ستتغير نسبة بين الماء والمرحلة العضوية عبر التبخر.
  2. يتألف النظام [هبلك]-النماء مضخة وعمود [هبلك]، ديجاسير، نماء وحاقن. حجته في مرحلة المتنقلة، وتحقيق استقرار النظام للحد من الضوضاء والخلفية.
    1. تثبيت المرحلة المتنقلة والعمود [هبلك] في النظام [هبلك]. قم بتشغيل المضخة [هبلك] واستقرار العمود مع المرحلة متنقلة بمعدل تدفق 500 ميليلتر/دقيقة في درجة حرارة العمود 25 درجة مئوية اعتبارا من اليوم قبل يوم البدء.
    2. في اليوم التالي، إشعال النماء في مرحلة الطفولة المبكرة، وتعيين المعلمات (الجهد الحد في-900 أم والجهد الإثارة في 400 mV). استقرار على الأقل 3 ح.
  3. قياس تركيز 3-الإقليم الشمالي في الساعة7.
    1. إعداد تركيزات مختلف المعايير 3-NT (5-500 nM) وفارغة (دون ملوثة 3-NT القياسية وغير محدد حوزتي كوكتيل، للتأكد من القنينة ولا المخزن المؤقت) في المخزن مؤقت اسيتات 0.1 متر.
    2. قم بتشغيل المعالج البيانات [هبلك].
    3. وضع قنينات العينات في السيارات-حاقن وتعيين حجم الحقن إلى 25 ميليلتر. تعمل نفس شروط المرحلة المتنقلة ومعدل التدفق كما هو مذكور في الخطوة 2.2.1.
      ملاحظة: إذا كان إعداد عينة كاملة، ينبغي عينات، ومعيار (5-500 nM)، عينة كوكتيل فقط البروتياز غير محدد، وقنينة فارغة.
    4. تأكد من أن خط الأساس في chromatogram شقة وتبدأ حقن العينة.
      ملاحظة: عموما، اكتشاف 3-الإقليم الشمالي في 20-21 دقيقة؛ ومع ذلك، ينصح بحوالي 30 دقيقة كإدارة الوقت كل حقن عينة. وبخلاف ذلك، ستدرج قمم الملوث في التشغيل التالية.

3-تحليل تشروماتوجرامس والتحديد الكمي للمحتوى 3-الإقليم الشمالي في الساعة7

  1. تحقق ذروة 3-الإقليم الشمالي في تشروماتوجرامس وحساب المحتوى.
    1. وبعد جمع البيانات وفتح ملف البيانات تشروماتوجرام مع برمجيات التحليل.
    2. رسم خط عبر الذروة 3-الإقليم الشمالي من خط الأساس مسطحة وقراءة ارتفاع الذروة من السطر مرسومة.
      ملاحظة: الحد من الكمية هو حوالي 5 نانومتر (فمول 125 في حقنه 25 ميليلتر).
      تنبيه: يصبح استنفاد مسرى في النماء مرحلة الطفولة المبكرة ببطء، وسوف يكون الحد مرتفعة بسبب نسبة S/N.
    3. إعداد خط انحدار من قمم القياسية 3-NT وحساب المنحدر، واعتراض.
    4. تعيين هذه الثوابت في المعادلة التالية وحساب المحتوى 3-الإقليم الشمالي في العينات على النحو التالي.
      نموذج 3-الإقليم الشمالي (nM) = [عينة ذروة – اعتراض]/المنحدر (1) مكافئ.
      ملاحظة: المنحنى المعياري يجب أن تكون ممثلة تمثيلاً جيدا كخط مستقيم بين 5 نانومتر و 500 نانومتر.
  2. حساب 3-الإقليم الشمالي في البيئة الجوية و الساعة7 من القنينة عينة.
    1. مضاعفة تركيز 3-NT بحجم رد الفعل (وعامل إضعاف، أن وجدت)، وتقييم المحتوى 3-NT المطلق في الساعة7 من الدائرة.
    2. قياس منطقة التصفية التي تم جمعها وحساب المحتوى 3-الإقليم الشمالي في الساعة المجموع7 تصفية حسب المعادلة التالية.
      مجموع الساعة7 = [3-NT المحتوى في الساعة7 من الدائرة] x [نسبة ناحية التصفية7 بعد الظهر إلى منطقة دائرة] س 226.19 (في حالة تحويل جزيئات غرام) مكافئ. (2)
    3. تقييم المحتوى 3-الإقليم الشمالي في البيئة الجوية أو الساعة7 بقسمة م المجموع7 بحجم تدفق الهواء الكلي أو الساعة7 الوزن (المسجلة في الخطوة 1-1-3).

Representative Results

[هبلك]-النماء مبدأ بسيط. تفصل العينات المحتوية على الهدف من العمود [هبلك] والمرحلة المتنقلة، والمجمع المستهدف المنفصلين هو خفض و/أو تتأكسد في كشف الكهروكيميائية.

في النظام [هبلك]-تنمية الطفولة المبكرة، ويتم الكشف عن ذروة 3-الإقليم الشمالي في 22 دقيقة تقريبا. أكدس (PEC 510 وهتك-500) ترتبط بالترادف في السطر [هبلك]. النماء الأولى يقلل من مجموعات الهيدروكسيل في المركبات، ويكسد التالي انخفاض المواد الكيميائية. وقد أكدس حساسة للغاية الكشف عن مجموعة من 10-15 م. وكان حد الكشف للنظام [هبلك]-النماء 1.13 بيكوغرام/م3، التي تم حسابها كإشارة يعني القاعدية (mV) 10 أجزاء x 3.

وترد تشروماتوجرامس الممثل في الشكل 4. من خلال تحليل معيار 3-NT نقية، ذروة نهائي مع خط أساس مستقر يمكن أن يكون الكشف عن (الشكل 4 أ). 3-الإقليم الشمالي في الساعة7 وكان أيضا تقاس باستخدام 6 مم، عينات مستدير (الشكل 4 باء).

فيما يتعلق بدقة القدرة على اكتشاف 3-الإقليم الشمالي، عندما تم حقن معيار 3-الإقليم الشمالي في [هبلك]، تم الكشف عن ذروة الموافق 3-الإقليم الشمالي في وقت احتفاظ لمدة 20 دقيقة. في عينات بعد الظهر، 3-NT تم فصلها عن غيرها من المواد، وتم الكشف عن ذروة مستقلة في نفس الوقت الاحتفاظ بها كالمعيار. منحنى قياسي نموذجي يبين الشكل 5، حيث يلاحظ الخطي بين 5 و 40 نانومتر. يمكن رؤية الخطي ما يصل إلى 500 نانومتر (البيانات لا تظهر).

ويبين الجدول 1 محتويات 3-الإقليم الشمالي في الغلاف الجوي، وتحسب كالهواء بيكوغرام/م3 . ولوحظ أعلى تركيز من NT 3 في prefilter2.5 م في #3 (الساعة7، 3-4، 5).

Figure 1
الشكل 1 : نظام جمع ملعقة صغيرة، الساعة7والساعه2.5. (أ) مجموع الجسيمات المعلقة (ملعقة صغيرة) يتم جمعها مباشرة إلى عامل تصفية مجموعة (بمعدل تدفق 1,000 لتر في الدقيقة). (ب) عندما يتم جمع الساعة7 ، جزيئات كبيرة مستبعدة بحجم محدد (بمعدل تدفق 1,000 لتر في الدقيقة). (ج) الساعة2.5 يتم جمعها من خلال أربعة بريفيلتيرس (بمعدل تدفق 116 لتر في الدقيقة). ويشيع استخدام عامل تصفية كوارتز كعامل تصفية النسخ احتياطي للساعة7 والساعة2.5 أو كعامل تصفية مجموعة ملعقة صغيرة، كما هو مبين في هذا الشكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : إعداد دائرة مم-الجولة 6- عامل التصفية مجموعة قطع باستخدام أداة لكمه مجوفة يبلغ قطرها 6 مم. بعد ذلك، تم تخزين العينة في microtube 1.5 مل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الرسم التخطيطي للنظام [هبلك]-النماء- كان فصل 3-الإقليم الشمالي في نموذج حقنه في العمود [هبلك] من خلال تدفقات المرحلة المتنقلة التي. 3-الإقليم الشمالي انخفض إلى أمينوتيروسيني، وتتأكسد إيمينوتيروسيني، والكشف عن اليكتروتشيميكالي في الجهاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تشروماتوجرامس نموذجية في النظام [هبلك]-النماء- (أ) النقي 3-NT تحليلها بواسطة النظام [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة. (ب) 6 مم دائرة عينة من عامل تصفية7 م المستخدمة للكشف عن 3-NT. يتم الإشارة إلى ذروة 3-NT سهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : المنحنى المعياري نقية 3 NT عينات. وترد النتائج بتركيز أقل في رسم بياني آخر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

هذا الموضوع أيام من
جمع
بقعة 3-الإقليم الشمالي
(الهواء بيكوغرام/م3 )
PM2.5 Prefilter #1 27 4 8.25 ± 0.37
Prefilter #2 27 4 29.66 ± 1.94
Prefilter #3 27 4 74.37 ± 4.09
Prefilter #4 27 4 32.70 ± 0.75
باكفيلتير 7 5 4.21 ± 0.91
PM7 باكفيلتير 7 1 89.16 ± 6.36
ملعقة صغيرة عامل التصفية 7 1 10.34 ± 2.09

الجدول 1: 3-الإقليم الشمالي في الغلاف الجوي تقاس بالنظام [هبلك]-النماء- وقيست بقع دائرية 6 مم من كل عامل تصفية باستخدام النظام [هبلك]-النماء. وقد جمعت بريفيلتيرس #1--#4 في نفس الفترة. علما بأن تركيزات 3-الإقليم الشمالي في الهواء تتأثر بعوامل مختلفة، مثل التي تم جمعها حتى الآن، والسنة أو الموقع. البيانات (n = 3-10) يتم تمثيلها ك ± يعني الخطأ القياسي.

Discussion

توضح هذه المقالة طريقة القياس الكمي لتقييم 3-الإقليم الشمالي في الساعة المحمولة جوا التي جمعت على مرشحات الكوارتز استخدام تقنيات [هبلك]-النماء حساسة للغاية.

وبصفة عامة، وضعت طرق القياس 3-NT كالمؤشرات الحيوية للأكسدة في الأمراض التي تصيب الإنسان. وتعتبر الأساليب المستندة إلى جسم (مثلاً، مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم) شبه كمي لأن هناك لا التحقق من صحة التحليل الدقيق ومن الصعب تقييم موثوقية الاختبار. [هبلك] بكشف الكهروكيميائية (النماء) وفحوصات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي بالحساسية الكافية للتحديد الكمي ل 3-NT13. على الرغم من أنها حساسة، مثل أساليب جماعية على أساس قياس الطيف الكتلي GC-MS أو تتطلب GC-MS/MS derivatization الأحماض الأمينية، ونتائج عملية derivatization في كثير من الأحيان في تشكيل التحف14.

مقارنة بتقنيات GC و LC، [هبلك]-نماء الطفولة المبكرة نسبيا أقل تكلفة ولديه حساسية كافية لقياس 3-NT. بالإضافة إلى ذلك، أن الخطوة derivatization في GC-مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد-LC غالباً ما يتطلب وقتاً إضافيا. على الرغم من أن الأسلوب الذي قدم هنا يتطلب 16 ساعة للخطوة هضم البروتين، فإنه يمكن، على الرغم من ذلك، القيام بها بين عشية وضحاها (كما هو موضح أعلاه، حوالي 30 دقيقة وقت العملي مطلوب كل عينة). قد توفر قياس التكرار التلقائي باستخدام أوتوسامبلير نظام قياس الفائق. وأفادت الدراسات السابقة طرق مناعية لقياس 3-الإقليم الشمالي في الساعة2،7؛ ومع ذلك، تعذر اكتشاف هذه الأساليب 3-الإقليم الشمالي في فصل الشتاء بسبب انخفاض مستويات 3-الإقليم الشمالي في الساعة15.

الأسلوب [هبلك]-النماء مزايا إضافية أكثر من الأساليب القياسية الأخرى؛ على سبيل المثال، (ط) عملية استخراج غير مطلوب في هذا الأسلوب، (ثانيا) أنها خالية تماما من المنظفات، (ثالثا) فقد شرط الحد الأدنى من العينة، و، الأهم من ذلك، (رابعا) لها حساسية عالية. الجسيمات التي يتم جمعها على مرشحات مفصولة كثيرا ما سونيكاتيون لمزيد من التحقيقات، بما في ذلك التحديد الكمي للعناصر المختلفة. كما تستخدم المنظفات لعزل البروتينات م زمنياً من المرشحات. ومع ذلك، هذه الخطوات الإضافية تزيد من خطر التلوث وفقدان عينة، واستهانة بسبب كفاءة الاستخراج، وعلاوة على ذلك، معظم المنظفات تتنافى مع LC/MS. في هذا الأسلوب [هبلك]-النماء، عينات [هبلك] يمكن بسهولة فصل من عامل تصفية باستخدام لكمه مجوف بسيط ودون الشرط لعملية إعداد عينة إضافية. منطقة العينة مستدير هو 28.3 مم2، وصغيرة جداً بالمقارنة مع حجم التصفية الكوارتز الأصلي (8 × 10 بوصة = 203.2 × 254 مم = 51,600 مم2).

الشرط [هبلك]-النماء واستعرضت بعناية لتجنب التدخل للإشارة 3-الإقليم الشمالي، كما هو موضح سابقا12. الرقم الهيدروجيني حمضية قوية من المرحلة المتنقلة بتركيز كاف من الاسيتو الانيتريل مهم للكشف. باستخدام هذه الشروط، يمكن فصل المركبات الأخرى، بما في ذلك نيترو قاعدة، من نيتروتيروسيني. الوضع الراهن مناسبة للكشف عن 3-NT من العينات مع خاصية مادية مختلفة (مثل الجسيمات والبلازما).

3-الإقليم الشمالي في الهواء، لتقييم قياس وزن عامل التصفية وإزالة الخلفية هي الخطوات الحاسمة. وبصفة عامة، على مدى ما يقرب من 100 مغ من الساعة7 يتم جمعها على مدى فترة من أربعة إلى سبعة أيام؛ ومع ذلك، تؤثر عدة عوامل وزن عامل التصفية قبل وبعد جمع7 بعد الظهر، بما في ذلك الرطوبة وحشوه كهربائية ثابتة. لتجنب هذه الآثار، ضروري استقرار الوزن عامل التصفية لفترات طويلة تحت سوبيكوال درجة الحرارة والرطوبة. ينبغي الإبقاء على الموقع حيث تم تثبيت التوازن الإلكترونية في بيئة مستقرة. لإعداد نموذج، من المهم لتصحيح آثار الخلفية من حوزتي غير محدد كوكتيل والغشاء ultrafiltration، التي غالباً ما تظهر ذروة مماثلة إلى 3-الإقليم الشمالي.

يمكن تطبيق هذا الأسلوب للجزيئات الأخرى، بما في ذلك تلك الموجودة في البيئات المغلقة. نترته البروتينات قد تزيد بهم المحتملة للحساسية2. ولذلك، قد يساعد هذا الأسلوب على تقييم النظافة البيئية ومنع nitrosative الإجهاد.

في هذه الدراسة، ونحن تقرير طريقة قياس درجة عالية من حساسية للغلاف الجوي 3-الإقليم الشمالي من فلاتر الهواء العينة بأجهزة رخيصة الثمن وسهلة التعامل. جيل 3-الإقليم الشمالي في الغلاف الجوي المرتبطة بالملوثات البيئية مثل س3وليس2والبروتينات بعد الظهر وعناصر الأرصاد الجوية التي تؤثر على البشرية تحسسية. وفي الختام، قد تساعد الطريقة المتقدمة في التحقيقات الحالية لتقييم رد فعل الغلاف الجوي س3والملوثات المختلفة والبروتينات بعد الظهر تحت مختلف الظروف الجوية. مع هذه المساعي لتطوير [هبلك]-النماء لتقدير 3-نيتروتيروسيني في الغلاف الجوي، ونحن نتوقع تحسين النظافة البيئية، تحسين الصحة البشرية.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون ماسايوكي كوبو من "وكالة حماية البيئة الأمريكية" لمساعدته مع أخذ العينات2.5 ملعقة صغيرة/م. أيد هذا العمل جزئيا JSPS كاكينهي المنحة رقم JP16K15373 و JP18H03039.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quartz filter, backup quartz filter PALL life sciences 7204 Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY HV-1000F
Particle size selector for SPM SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY 080130-061 SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600F
Size classification unit for PM2.5 SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) Tokyo Dylec AHQ-630
Non-specific protease cocktail Roche 11459643001 Pronase from Streptomyces griseus 
3-Nitrotyrosine SIGMA N7389
Ultrafiltration membranes Millipore UFC5010BK AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECD Eicom HTEC-500, PEC-510 standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column Eicom SC-5ODS
Data processor Eicom EPC-300
Injector Hitachi High-Tech Science  L-7200 Auto sampler
Analyzing software eDAQ Japan ES280  PowerChrom software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, (1), 15-26 (2012).
  2. Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39, (6), 1673-1678 (2005).
  3. Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14, (1), 155-161 (2016).
  4. D'Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62, (9), 976-990 (2007).
  5. Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35, (9), 1791-1797 (2001).
  6. Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46, (12), 6672-6680 (2012).
  7. Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141, (3), 265-275 (2006).
  8. Kubo, M., Ogino, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. Tsukahara, H., Kaneko, K. Humana Press. 149-158 (2014).
  9. Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
  10. Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons? Journal of Neurochemistry. 89, (3), 529-536 (2004).
  11. Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
  12. Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141, (4), 495-502 (2007).
  13. Ogino, K., Wang, D. -H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61, (4), 181-189 (2007).
  14. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -T., Gutzki, F. -M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827, (1), 146-156 (2005).
  15. Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
اكتشاف 3-نيتروتيروسيني في بيئة الغلاف الجوي <em>عن طريق</em> عالية أداء نظام سائل الكاشف اللوني الكهروكيميائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).More

Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K., Nishiyama, R., Shimizu, Y. Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System. J. Vis. Exp. (143), e58371, doi:10.3791/58371 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter