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Bioengineering

Anionic Cerium ऑक्साइड नैनोकणों द्वारा Vivo में संयंत्र प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की उत्प्रेरक सफाई

Published: August 26, 2018 doi: 10.3791/58373
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम ROS (प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों) vivo मेंसफ़ाई के लिए cerium ऑक्साइड नैनोकणों (nanoceria) के संश्लेषण और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा संयंत्र के ऊतकों में nanoceria इमेजिंग, और vivo में फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा nanoceria ROS सफाई की निगरानी ।

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) संचय संयंत्र अजैव तनाव प्रतिक्रिया की एक बानगी है । ROS पौधों में उच्च स्तर पर कम स्तर और हानिकारक अणुओं पर संकेत अणुओं के रूप में अभिनय के द्वारा एक दोहरी भूमिका निभाते हैं । तनाव वाले पौधों में ROS का संचय चयापचयों, एंजाइम, लिपिड, और डीएनए को नुकसान पहुंचा सकता है, जिससे पौधे की वृद्धि और उपज में कमी होती है । cerium ऑक्साइड नैनोकणों (nanoceria) की क्षमता vivo में उत्प्रेरक ROS सफाई करने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है समझने के लिए और इंजन संयंत्र अजैव तनाव सहिष्णुता । यहां, हम संश्लेषित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और पाली (एक्रिलिक) एसिड लेपित nanoceria (पीएनसी) की विशेषता, पत्ती लेमिना घुसपैठ के माध्यम से पौधों के साथ नैनोकणों इंटरफेस, और उनके वितरण और ROS का उपयोग कर vivo में सफाई की निगरानी फोकल माइक्रोस्कोपी. पौधों में ROS संचय जोड़ तोड़ के लिए वर्तमान आणविक उपकरण मॉडल प्रजातियों के लिए सीमित है और श्रमसाध्य परिवर्तन तरीकों की आवश्यकता है । vivo ROS सफ़ाई में के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए व्यापक पत्तियों और Arabidopsis थालियानाकी तरह पत्ती संरचना के साथ जंगली प्रकार के पौधों के लिए लागू किया जा करने के लिए संभावित है ।

Introduction

Cerium ऑक्साइड नैनोकणों (nanoceria) व्यापक रूप से रहने वाले जीवों में इस्तेमाल कर रहे हैं, बुनियादी अनुसंधान से, अपने विशिष्ट उत्प्रेरक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) सफाई की क्षमता1,2,3की वजह से, इंजीनियरिंग करने के लिए । Nanoceria सतह ऑक्सीजन रिक्तियों की एक बड़ी संख्या है कि दो ऑक्सीकरण राज्यों के बीच वैकल्पिक (ce3 + और ce4 +) 4,5,6के कारण सफाई क्षमताओं ROS है । Ce3 + झूलने बांड प्रभावी ढंग से सफाई ROS जबकि नेनो पर जाली उपभेदों redox साइकिलिंग प्रतिक्रियाओं के माध्यम से इन दोष साइटों के उत्थान को बढ़ावा देने के7. Nanoceria भी हाल ही में अध्ययन और इंजीनियरिंग संयंत्र समारोह8,9के लिए इस्तेमाल किया गया है । अजैव तनाव के तहत पौधों ROS के संचय का अनुभव, लिपिड, प्रोटीन, और10डीएनए के लिए ऑक्सीडेटिव क्षति के कारण. एक. थालियाना संयंत्रों में, vivo में ROS के nanoceria उत्प्रेरक सफाई उच्च प्रकाश, गर्मी के तहत संयंत्र प्रकाश संश्लेषण में सुधार की ओर जाता है, और द्रुतशीतन8तनाव । मिट्टी में nanoceria लगाने से भी बढ़ता है गोली मारो बायोमास और गेहूं की अनाज उपज (Triticum aestivum)11; canola (Brassica napus) पौधों nanoceria के साथ इलाज किया नमक तनाव12के तहत उच्च संयंत्र बायोमास है ।

Nanoceria प्रस्ताव एक नैनो-आधारित उपकरण अजैव तनाव प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए और संयंत्र अजैव तनाव सहिष्णुता को बढ़ाने के लिए और पौधों के संयंत्र जीव । vivo में है Nanoceria ROS सफ़ाई क्षमताओं संयंत्र प्रजातियों में से स्वतंत्र हैं, और संयंत्र के ऊतकों में सतही वितरण क्षमता मॉडल जीवों के बाहर व्यापक आवेदन को सक्षम करने के लिए है । अंय आनुवंशिक रूप से आधारित तरीकों के विपरीत, nanoceria उच्च ROS सफाई की क्षमता13के लिए एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की अधिकता के साथ संयंत्र लाइनों पैदा करने की आवश्यकता नहीं है । लीफ लेमिना nanoceria संयंत्रों के लिए घुसपैठ प्रयोगशाला आधारित अनुसंधान के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है ।

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य 1 का वर्णन है) संश्लेषण और नकारात्मक आरोप लगाया पाली (एक्रिलिक) एसिड nanoceria (पीएनसी) के लक्षण वर्णन, 2) वितरण और पीएनसी पत्ती कोशिकाओं भर में ट्रैकिंग, और 3) पीएनसी की निगरानी सक्षम ROS में सफाई vivo. इस प्रोटोकॉल में, नकारात्मक आरोप लगाया पाली (एक्रिलिक) एसिड nanoceria (पीएनसी) संश्लेषित कर रहे है और उनके अवशोषण स्पेक्ट्रम, hydrodynamic व्यास, और जीटा क्षमता की विशेषता । हम एक सरल पत्ती लेमिना घुसपैठ विधि का वर्णन पीएनसी संयंत्र पत्ती ऊतकों में वितरित करने के लिए । vivo इमेजिंग में mesophyll कोशिकाओं के भीतर nanoparticle वितरण के लिए, एक फ्लोरोसेंट डाई (दिी) पीएनसी लेबल (दिी-पीएनसी) के लिए प्रयोग किया जाता था और नैनोकणों के माध्यम से फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का पालन । अंत में, हम बताते है कैसे vivo पीएनसी ROS में निगरानी के लिए फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से सफाई ।

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Protocol

1. बढ़ते ए. थालियाना पौधे

  1. मानक मिट्टी के मिश्रण से भरे 5 सेमी x 5 सेमी डिस्पोजेबल बर्तन में एक. थालियाना बीज बोना । इन बर्तनों की ३२ एक प्लास्टिक पानी से भरी ट्रे में रखो (~ ०.५ सेमी गहराई) और पौधों के साथ एक संयंत्र वृद्धि चैंबर में प्लास्टिक की ट्रे हस्तांतरण ।
    1. इस प्रकार के रूप में वृद्धि चैंबर सेटिंग्स सेट करें: २०० µmol/ms संश्लेषक सक्रिय विकिरण (सममूल्य), 24 ± 1 ° c दिन और 21 ± 1 ° c रात, ६०% आर्द्रता, और 14/10 घंटे/रात प्रकाश शासन, क्रमशः ।
  2. प्रत्येक बर्तन पतले अंकुरण के एक सप्ताह के बाद केवल एक ही व्यक्ति के पौधे को छोड़ दें । प्रत्येक बर्तन में समान आकार के साथ अंकुर रखने के लिए ध्यान दें ।
  3. हर दो दिन में एक बार सीधे प्लास्टिक की ट्रे पर नल का पानी डालकर बर्तनों को पानी दें । चार सप्ताह तक पौधे उगते हैं । A. थालियाना संयंत्रों आगे उपयोग के लिए तैयार हैं ।

2. संश्लेषण और पीएनसी के लक्षण वर्णन

  1. cerium (III) नाइट्रेट का १.०८ ग्राम वजन और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में २.५ मिलीलीटर आणविक जीवविज्ञान ग्रेड पानी में इसे भंग ।
  2. पाली (एक्रिलिक) एसिड की ४.५ जी वजन और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में आणविक जीवविज्ञान ग्रेड पानी की 5 मिलीलीटर में इसे भंग ।
  3. 15 मिनट के लिए २,००० rpm पर इन दो समाधान अच्छी तरह से मिश्रण एक डिजिटल भंवर मिक्सर का उपयोग कर ।
  4. अमोनियम हीड्राकसीड सॉल्यूशन (७.२ मीटर) के 15 मिलीलीटर को एक ५० मिलीलीटर ग्लास यूरिन में ट्रांसफर करें ।
  5. ५०० rpm पर सरगर्मी जबकि, कदम २.३ dropwise से अमोनियम हीड्राकसीड समाधान के मिश्रण को जोड़ने और एक धुएं डाकू में 24 hr के लिए कमरे के तापमान पर ५०० rpm पर हलचल ।
  6. कागज के एक टुकड़े के साथ चोंच कवर रात प्रतिक्रिया के दौरान समाधान के काफी नुकसान से बचने के लिए ।
  7. 24 एच के बाद, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के परिणामस्वरूप समाधान हस्तांतरण और 1 के लिए ३,९०० x g पर यह केंद्रापसारक के लिए किसी भी संभावित मलबे और बड़े agglomerates हटाने के लिए ।
  8. ३ १५ मिलीलीटर 10 केडीए फिल्टर में supernatant समाधान के इस २२.५ मिलीलीटर स्थानांतरण और आणविक ग्रेड पानी के साथ फिल्टर के शेष को भरने के लिए ४५ मिलीलीटर की कुल कमजोर पड़ने बनाने के लिए ।
  9. एक 15 मिलीलीटर 10 केडीए फिल्टर करने के लिए supernatant जोड़कर एक benchtop केंद्रापसारक के साथ मुक्त पॉलिमर और अन्य रिएजेंट से supernatant समाधान को शुद्ध और 15 मिनट के लिए ३,९०० x g पर केंद्रापसारक । इस चरण को कम से छह बार दोहराएँ.
  10. एक यूवी विज़ spectrophotometer से 220-700 एनएम के साथ प्रत्येक चक्र में eluent के अवशोषण को मापने के लिए कोई मुक्त पॉलिमर और अन्य रिएजेंटों अंतिम पीएनसी समाधान में मौजूद हैं सुनिश्चित करने के लिए.
  11. 5 मिलीलीटर सिरिंज में एकत्र पीएनसी समाधान ले लो और एक 20 एनएम ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के खिलाफ यह फिल्टर । एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में फ़िल्टर पीएनसी समाधान ले लीजिए ।
  12. एक प्लास्टिक cuvette में एक पतला अंतिम पीएनसी समाधान ले लो और यूवी विज़ spectrophotometer से 220-700 एनएम के साथ अपने अवशोषण उपाय । पीएनसी अवशोषक पीक २७१ एनएम पर है ।
  13. बियर का उपयोग करके अपनी एकाग्रता की गणना-है Lambert कानून: एक = εCL । एक दिए गए नमूने के लिए पीक मूल्य के अवशोषण है, ɛ पीएनसी के दाढ़ अवशोषण गुणांक (सेमी-1 एम-1) है, एल ऑप्टिकल पथ लंबाई (cuvette चौड़ाई, इस विधि में 1 सेमी) है, और सी मापा नैनोकणों के दाढ़ एकाग्रता है ।
  14. hydrodynamic व्यास और संश्लेषित पीएनसी के जीटा क्षमता एक कण आकार और जीटा संभावित विश्लेषक (चित्रा 1) का उपयोग उपाय ।
  15. एक रेफ्रिजरेटर में अंतिम पीएनसी समाधान स्टोर (4 ° c) आगे का उपयोग जब तक ।
    नोट: कृपया देखें वू एट अलकरने के लिए । 8 पीएनसी लक्षण वर्णन के बारे में अधिक प्रोटोकॉल विवरण के लिए ।

3. दिी फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग पीएनसी

  1. 5 मिमी (५८ mg/L) पीएनसी के ०.४ मिलीलीटर एक 20 मिलीलीटर कांच की शीशी में आणविक जीवविज्ञान ग्रेड पानी की ३.६ मिलीलीटर के साथ मिश्रण और ५०० rpm पर हलचल ।
  2. इसमें 24 µ l 1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine perchlorate डाई सॉल्यूशन (दिी, २.५ mg/मब; DMSO में पतला) में १७६ µ एल के DMSO (dimethyl sulfoxide) को दिी डाई सॉल्यूशन बना लें ।
  3. पीएनसी समाधान के लिए दिी डाई dropwise जोड़ें, परिवेश के तापमान पर 1 मिनट के लिए १,००० rpm पर सरगर्मी ।
  4. एक 15 मिलीलीटर 10 केडीए फिल्टर में इस परिणामी मिश्रण हस्तांतरण और आणविक जीवविज्ञानी ग्रेड पानी के साथ शीर्ष करने के लिए ट्यूब भरने के लिए कुल कमजोर पड़ने 15 मिलीलीटर बनाने के लिए ।
  5. शुद्ध दिी पीएनसी (दिी-पीएनसी) समाधान से DMSO और किसी भी संभव मुक्त दिी डाई के साथ एक benchtop केंद्रापसारक द्वारा 15 मिलीलीटर 10 केडीए फ़िल्टर 5 मिनट के लिए ३,९०० x g पर ।
    1. दोहराएं ३.५ चरण में ंयूनतम पांच बार ।
  6. फ़िल्टर अंतिम दिी-पीएनसी समाधान एक 20 एनएम ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के माध्यम से ।
  7. यूवी विज़ spectrophotometry द्वारा अंतिम दिी-पीएनसी के अवशोषण को मापने और बियर के अनुसार अपनी एकाग्रता की गणना-Lambert के कानून (चित्रा 2) । अधिक विवरण के लिए चरण २.१३ देखें ।
  8. यह आगे उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में स्टोर ।

4. पीएनसी के साथ संयंत्र के पत्तों की घुसपैठ

  1. घुसपैठ बफर के ०.१ मिलीलीटर (१०० mm द्वीतीय, १०० mm MgCl2, पीएच ७.५, एचसीएल द्वारा समायोजित) ०.९ मिमी पीएनसी या दिी-पीएनसी समाधान के ०.५ मिलीलीटर में जोड़ें और यह भंवर । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 10 मिमी द्वीतीय घुसपैठ बफर के समाधान का उपयोग करें ।
  2. पीएनसी या दिी-पीएनसी घुसपैठ समाधान के ०.२ मिलीलीटर स्थानांतरण एक 1 मिलीलीटर बाँझ सुई के लिए एक सिरिंज । किसी भी संभव हवा बुलबुले को दूर करने के लिए टैप करें ।
  3. बस नैनोकणों के साथ घुसपैठ से पहले कमरे प्रकाश की स्थिति के तहत संभव stomata बंद से बचने के लिए विकास चैंबर से संयंत्र निकालते हैं ।
  4. घुसपैठ से पहले, एक क्लोरोफिल मीटर का उपयोग कर समान आकार के साथ एक. थालियाना पत्तियों से क्लोरोफिल सामग्री को मापने । प्रत्येक पत्ती को मापने के साथ तीन प्रतिकृतियां (प्रत्येक को कम से शामिल दोहराने तीन माप)14। घुसपैठ प्रयोग के लिए समान क्लोरोफिल सामग्री के साथ अ. थालियाना पत्ते चुनें ।
  5. धीरे पत्ती लेमिना (abaxial पक्ष) और दबाना गोताख़ोर (चित्रा 3ए) के नीचे के खिलाफ सुइयों की नोक दबाकर धीरे से हाल ही में तैयार पीएनसी या दिी-पीएनसी समाधान के साथ पत्तियों घुसपैठ.
  6. धीरे से अतिरिक्त समाधान है कि पत्ती लेमिना (चित्रा 3ख) एक नाजुक कार्य वाइपर (चित्रा 3सी) और लेबल संयंत्र का उपयोग कर की सतह पर रहता है पोंछें । पत्तियों के प्रत्येक समूह के लिए नए नाजुक कार्य वाइप्स का उपयोग करें ।
  7. 3 एच के लिए पीएनसी या दिी-पीएनसी के साथ पत्ती अनुकूलन और गर्मी के लिए बेंच पर घुसपैठ ए थालियाना संयंत्रों रखो ।
    नोट: घुसपैठ थालियाना संयंत्रों तो आगे उपयोग के लिए तैयार है (चित्रा 3डी) ।

5. फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए पत्ती के नमूनों की तैयारी

  1. अवलोकन जेल के एक मटर आकार की राशि के बारे में एक 1 सेमी त्रिज्या (चित्रा 4ए) को रोल और फिर इसे बाहर फैल जब तक यह एक गिलास स्लाइड पर 1 मिमी पतली है (चित्रा 4बी) ।
  2. एक काग बरमा (व्यास ०.३ सेमी) के लिए बाहर गिलास स्लाइड (चित्रा 4सी) पर अवलोकन जेल के केंद्र में एक परिपत्र अनुभाग में कटौती का प्रयोग करें ।
  3. पत्ती के ऊतकों में गहरी और बेहतर फोकल इमेजिंग संकल्प के लिए perfluorodecalin (PFD) के साथ अच्छी तरह से काट भरें ।
  4. एक काग बरमा का प्रयोग करें (व्यास ०.२ सेमी) के लिए अनुकूलित दिी से पत्ता डिस्क इकट्ठा-पीएनसी एक थालियाना संयंत्रों (चित्रा 4डी) घुसपैठ की ।
  5. अच्छी तरह से भरा PFD में पत्ती डिस्क माउंट; पत्ती के ऊपर घुसपैठ (abaxial) की ओर चेहरा ।
  6. पत्ती डिस्क के शीर्ष पर एक वर्ग coverslip रखो और धीरे से स्लाइड पर प्रेस coverslip समान रूप से अवलोकन जेल की अच्छी तरह से इसे सील करने के लिए और सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले फंस (चित्रा 4ई) रहते हैं ।

6. इमेजिंग दिी-पीएनसी पत्ती ऊतकों में फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा

  1. एक उल्टे लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप में एक 40X उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें ।
  2. 40X उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर ddH2ओ की दो से तीन बूंदें ड्रॉप ।
  3. औंधा 40X उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर तैयार दिी-पीएनसी घुसपैठ पत्ती नमूना स्लाइड प्लेस ।
    1. सुनिश्चित करें कि coverslip पक्ष लेकिन नहीं ग्लास स्लाइड सीधे लेंस पर ddH2ओ के साथ संपर्क करें ।
  4. या तो लेजर प्रकाश या उज्ज्वल क्षेत्र के साथ माइक्रोस्कोप के तहत नमूने में ब्याज की एक क्षेत्र का पता लगाएं ।
  5. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर शुरू करने और आर्गन लेजर पर बारी (20% पर सेट).
  6. एक ऑप्टिकल स्लाइस 2 µm से कम और 4 की एक पंक्ति औसत एकत्रित करने के लिए pinhole सेट करें ।
  7. फोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ नमूना छवि: ५१४ एनएम लेजर उत्तेजना (30%); Z-स्टैक अनुभाग मोटाई: 2 µm; PMT1:550-615 एनएम (दिी पीएनसी इमेजिंग के लिए); PMT2:700-800 एनएम (chloroplast इमेजिंग के लिए) ।
  8. विभिंन व्यक्तियों, तीन जैविक प्रतिकृति की एक ंयूनतम से पत्ती के नमूनों की प्रतिनिधि फोकल छवियां ले लो ।

7. इमेजिंग पीएनसी vivo ROS में फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा सफाई

  1. तैयार 25 µ एम 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (एच2DCFDA, एक सामांय ROS संकेत के लिए एक डाई) और 10 µ एम dihydroethidium (DHE, सुपरऑक्साइड आयनों संकेत के लिए एक डाई) द्वीतीय घुसपैठ बफर में रंजक (pH ७.५) में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, अलग.
  2. एक कॉर्क बरमा का प्रयोग करें (व्यास ०.२ सेमी) से पत्ती डिस्क इकट्ठा करने के लिए अनुकूलित पीएनसी एक. थालियाना संयंत्रों घुसपैठ की ।
    1. डाई लोडिंग प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए लीफ डिस्क पर तीन से चार छिद्र बनाने के लिए संदंश के तीखे टिप का प्रयोग करें ।
  3. एच2DCFDA और DHE के साथ microcentrifuge ट्यूबों के लिए पत्ती डिस्क स्थानांतरण अलग से और अंधेरे के तहत 30 मिनट के लिए मशीन ।
  4. मशीन के बाद, ddH2हे तीन बार के साथ पत्ती डिस्क कुल्ला और यह अवलोकन जेल के साथ कांच स्लाइड में माउंट (देखें प्रोटोकॉल अनुभाग 5) ।
  5. फोकल माइक्रोस्कोप पर स्लाइड रखो और पत्ती mesophyll कोशिकाओं के एक क्षेत्र के लिए मैन्युअल रूप से ध्यान केंद्रित. विवरण के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग 6 देखें ।
  6. ROS उत्पन्न करने के लिए 3 मिनट के लिए यूवी एक (४०५ एनएम) लेजर के लिए पत्ती डिस्क बेनकाब और पत्ती डिस्क प्रति समय-श्रृंखला ("xyt") में ROS संकेत तीव्रता परिवर्तन रिकॉर्ड.
  7. फोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ पत्ती डिस्क छवि: 40X पानी उद्देश्य; ४९६ एनएम लेजर उत्तेजना; PMT1:500-600 एनएम (DHE और DCFDA डाई का पता लगाने के लिए); PMT2:700-800 एनएम (chloroplasts डिटेक्शन के लिए) । नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ही घुसपैठ बफर समाधान के साथ घुसपैठ एक संयंत्र का उपयोग करें ।

8. ज2ओ 2 के पीएनसी सफाईइन विट्रो

  1. आचरण बिल्ली (catalase) mimetic गतिविधि में संश्लेषित पीएनसी के पिछले प्रकाशनों में तरीकों का पालन करके3,8,15
  2. 1x द्वीतीय घुसपैठ बफर के ४५.४ µ एल जोड़ें (10 mM द्वीतीय, 10 मिमी MgCl2, पीएच ७.५, एचसीएल द्वारा समायोजित), पीएनसी (६० एनएम, 3 µ एल), और एच2ओ 2 (2 µ एम, 1 µ एल) में एक अच्छी तरह से (सफेद दौर नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली), और धीरे से यह pipetting द्वारा मिश्रण ।
  3. जोड़ 10-एसिटाइल-3, 7-dihydroxyphenoxazine (कार्य एकाग्रता १०० µ एम, ०.५ µ एल) और सहिजन peroxidase (एचआरपी; कार्य एकाग्रता ०.२ U/एमएल, ०.१ µ एल) में अच्छी तरह से, धीरे pipetting द्वारा यह मिश्रण है, और यह 30 मिनट के लिए मशीन । 10-एसिटाइल-3, 7-dihydroxyphenoxazine एच2ओ2 के साथ प्रतिक्रिया करता है और एचआरपी की उपस्थिति में resorufin में बदल दिया है ।
    1. मशीन के दौरान प्रकाश से बचने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ थाली लपेटें ।
    2. प्रतिक्रिया बफ़र या जल H2O2को प्रतिस्थापित करने के लिए का उपयोग करके एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें ।
    3. शेयर समाधान के लिए छोड़कर, परिवेश के तापमान पर अंय सभी समाधान तैयार करते हैं ।
  4. मशीन के बाद, एक प्लेट रीडर के साथ, ५६० एनएम पर अवशोषक की निगरानी के लिए एच2ओ2के स्तर का संकेत के लिए resorufin का उपयोग करें । 0, 2, 5, 10, 20, और 30 मिनट पर समय शासन निर्धारित करें ।

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Representative Results

पीएनसी संश्लेषण और लक्षण वर्णन .
पीएनसी संश्लेषित, शुद्ध और प्रोटोकॉल खंड 2 में वर्णित विधि निंनलिखित विशेषता थे । चित्रा 1 एक cerium नाइट्रेट के समाधान की रंगाई दिखाता है, पा, cerium नाइट्रेट और पा के मिश्रण, और पीएनसी । पीएनसी संश्लेषित करने के बाद सफेद से हल्के पीले रंग में परिवर्तन देखा जाता है । एक 10 केडीए फिल्टर के साथ शुद्धिकरण के बाद, पीएनसी एक यूवी की तुलना spectrophotometer के साथ विशेषता थे । पीएनसी के लिए अवशोषक की एक चोटी २७१ एनएम (चित्रा 1ख) में मनाया गया । अंतिम eluent भी यूवी विज़ के साथ मापा गया था की पुष्टि करने के लिए कि गैर प्रतिक्रिया रसायन शुद्धि के दौरान धोया गया । hydrodynamic व्यास और संश्लेषित पीएनसी के जीटा क्षमता एक कण sizer और जीटा संभावित विश्लेषक (चित्रा 1सी) के साथ मापा गया ।

दिी डाई के साथ पीएनसी लेबलिंग .
vivo मेंनैनोकणों के वितरण का निर्धारण करने के लिए, पीएनसी प्रोटोकॉल खंड 3 में वर्णित विधि निंनलिखित एक फ्लोरोसेंट दिी डाई के साथ लेबल थे । दिी डाई पीएनसी कोटिंग के भीतर अनायास एंबेड के बाद से यह16nanoceria के बहुलक कोटिंग्स के अंदर hydrophobic डोमेन में encapsulate कर सकते हैं । पीएनसी समाधान के लिए दिी डाई जोड़ने के बाद, गुलाबी करने के लिए एक तेजी से रंग बदलने के लिए मनाया गया था (चित्रा 2ए) । पीएनसी लेबल दिी तो एक 10 केडीए फिल्टर के साथ शुद्ध और एक यूवी विज़ spectrophotometry द्वारा विशेषता थे । तीन दिी पीएनसी लेबल के लिए साफ अवशोषित चोटियों (चित्रा 2बी) मनाया गया । अंतिम eluent यूवी विज़ spectrophotometry द्वारा मापा गया था की पुष्टि करने के लिए कि गैर प्रतिक्रिया रसायन शुद्धि के दौरान बाहर धोया गया ।

पत्ता लेमिना घुसपैठ ।
पीएनसी या दिी-पीएनसी थालियाना पत्ती के माध्यम से पत्ती लेमिना घुसपैठ विधि के माध्यम में वितरित किया गया के रूप में प्रोटोकॉल खंड 4 में वर्णित है । पत्ती चार विभिंन स्थानों पर घुसपैठ की थी सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण पत्ती क्षेत्र पीएनसी समाधान (चित्रा 3ए) के साथ perfused था । किसी भी शेष समाधान पत्ती की सतह से हटा दिया गया था (चित्रा 3बी और 2 सी). हरे से गहरा हरा (चित्रा 3डी) के लिए हरी से घुसपैठ के दौरान पत्ती का रंग बदल गया । सिरिंज धीरे से किसी भी शारीरिक क्षति से बचने के लिए पत्ती के खिलाफ दबाया गया था ।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए पत्ता नमूना तैयारी ।
पत्ती नमूने एक अवलोकन जेल के भीतर कांच की स्लाइड पर घुड़सवार थे अच्छी तरह से PFD से भरा बनाया । स्लाइड (चित्रा 4ए और 4B) पर मटर के आकार अवलोकन जेल रोलिंग के बाद, एक अच्छी तरह से फ्लैट जेल (चित्रा 4सी) के बीच में किया गया था । फिर, हौसले से तैयार पत्ती डिस्क अच्छी तरह से पहले PFD समाधान (चित्रा 4डी) के साथ भरा करने के लिए हस्तांतरित किया गया था । एक coverslip का इस्तेमाल स्लाइड (फिगर 4ई) पर लीफ सैम्पल को मैटीरियल करने के लिए किया गया था ।

दिी के फोकल इमेजिंग-पीएनसी में vivo .
दिी-पीएनसी घुसपैठ थालियाना पत्तियों दिी के वितरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया-लीफ mesophyll कोशिकाओं में पीएनसी के माध्यम से फोकल इमेजिंग (चित्रा 5ए और 5B) । दिी-पीएनसी और chloroplasts, दिी-पीएनसी घुसपैठ पत्ती के नमूनों के बीच colocalization कल्पना करने के लिए एक ५१४ एनएम लेजर के साथ उत्साहित थे । दिी के उत्सर्जन-पीएनसी 550-615 एनएम पर सेट के बाद ~ ६५० एनएम17chloroplast pigments संकेतों के संभावित हस्तक्षेप से बचने के लिए किया गया था । क्लोरोफिल ऑटो-chloroplasts से प्रतिदीप्ति 700-800 एनएम का पता लगाया गया । फोकल इमेजिंग सेटिंग्स (लेजर शक्ति और लाभ) के लिए सुनिश्चित करें कि कोई दिी डाई संकेतों नियंत्रण पत्ती नमूना में पाया गया (केवल बफर के साथ घुसपैठ) (चित्रा 5सी) सेट थे । पत्ती mesophyll कोशिकाओं में chloroplasts के साथ दिी-पीएनसी के colocalization का पता लगाया दिी-पीएनसी और chloroplast वर्णक autofluorescence (चित्रा 5डी) के ओवरले छवि द्वारा देखा जा सकता है ।

पीएनसी ROS सफाई की फोकल इमेजिंग वीवो में .
पीएनसी में 10 मिमी द्वीतीय बफर समाधान एक. थालियाना पत्तियों में पत्ती लेमिना घुसपैठ विधि के माध्यम से वितरित किया गया के रूप में प्रोटोकॉल खंड 7 में वर्णित है । DHE (dihydroethidium) और एच2DCFDA (2 ′, 7 ′-dichlorodihydrofluorescein diacetate) फ्लोरोसेंट रंजक संयंत्र के ऊतकों में ROS कल्पना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं8,18. एच2DCFDA को फ्लोरोसेंट डीसीएफ (' 2 ', 7 '-dichlorofluorescein, जनरल ऑक्सीडेटिव तनाव की डिग्री का एक संकेतक)19एसीटेट द्वारा ROS समूहों की दरार के कारण में परिवर्तित हो जाना जाता है । DHE सुपरऑक्साइड आयनों अपने फ्लोरोसेंट उत्पाद (2-hydroxyethidium) एक सुपरऑक्साइड आयनों20के साथ प्रतिक्रिया पर वृद्धि होने के लिए एक और अधिक विशिष्ट डाई है । वीवो में पीएनसी द्वारा सक्षम ROS सफाई DHE और डीसीएफ डाई प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन (आंकड़े 6A और घमण्ड) को मापने पत्ती डिस्क में निगरानी की गई । पीएनसी घुसपैठ पत्ती के नमूने ४९६ एनएम लेजर के साथ उत्साहित थे । chloroplast ऑटो प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ संभव हस्तक्षेप से बचने के लिए DHE और डीसीएफ डाई के उत्सर्जन 500-600 एनएम पर सेट किया गया था । वर्णक ऑटो-chloroplasts से प्रतिदीप्ति 700-800 एनएम से पता लगाया गया । यूवी तनाव के 3 मिनट बाद पीएनसी और बफर-घुसपैठ की पत्ती के नमूनों में ROS डाई संकेतों को अलग से नजर अंदाज किया गया । no-nanoparticle बफर नियंत्रण (NNP), पीएनसी घुसपैठ की तुलना में काफी कम ROS-सक्रिय फ्लोरोसेंट डीसीएफ डाई संकेत (चित्रा 6A) दिखाया । इसी तरह के परिणाम भी सुपरऑक्साइड आयनों के साथ पाया गया DHE डाई, जहां पीएनसी घुसपैठ की पत्तियों से काफी कम DHE डाई तीव्रता बफर नियंत्रण पत्तियों (चित्रा 6ख) से घुसपैठ की थी सक्रिय ।

पीएनसी बिल्ली mimetic गतिविधि परख . एच2ओ2 की पीएनसी सफ़ाई की परख प्रोटोकॉल खंड 8 में वर्णित किया गया था । resorufin की कमी है जो की प्रतिक्रिया में एच2ओ2 स्तर इंगित करता है पीएनसी युक्त (चित्रा 7) मनाया गया था, संश्लेषित पीएनसी के बिल्ली mimetic गतिविधि की पुष्टि ।

Figure 1
चित्रा 1 : संश्लेषण और पीएनसी के लक्षण वर्णन । ए रंगाई cerium नाइट्रेट, पाली एक्रिलिक एसिड (पा), cerium नाइट्रेट और पा के मिश्रण, और संश्लेषित पीएनसी (पा लेपित cerium ऑक्साइड नैनोकणों, हल्के पीले) । ख. पीएनसी के अवशोषक स्पेक्ट्रम यूवी विज़ spectrophotometry द्वारा मापा । C. Hydrodynamic व्यास और संश्लेषित पीएनसी के जीटा क्षमता । ± मानक त्रुटि (n = 4) मतलब है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : दिी फ्लोरोसेंट डाई के साथ पीएनसी लेबलिंग । A. पीएनसी (हल्का पीला) और दिी डाई लेबल पीएनसी समाधान (दिी-पीएनसी, गुलाबी) । B. दिी-पीएनसी समाधान के अवशोषण स्पेक्ट्रम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : पत्ती पीएनसी या दिी-पीएनसी के लेमिना घुसपैठ । ए. ए. थालियाना पत्ता घुसपैठ से पहले । सिरिंज के अंदर समाधान दिी-पीएनसी है । बी पत्ती दिी-पीएनसी के साथ घुसपैठ की । C. नाजुक टास्क वाइप्स के साथ पत्ती की सतह से बचे हुए घोल को साफ कर लें । D. जरुर A. थालियाना लीफ दिी-पीएनसी के साथ घुसपैठ की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : पत्ती नमूना स्लाइड की तैयारी. A. मटर आकार अवलोकन जैल के साथ माइक्रोस्कोपी ग्लास स्लाइड । B. फ्लैट अवलोकन जैल के साथ स्लाइड । फ्लैट अवलोकन जेल के साथ सी स्लाइड मध्य में एक अच्छी तरह से होने. घ. अवलोकन जेल में पत्ती डिस्क के साथ अच्छी तरह से perfluorodecalin (PFD) समाधान के साथ भरा स्लाइड । ई. आवरण स्लिप द्वारा मैटीरियल लीफ डिस्क के साथ स्लाइड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : इमेजिंग दिी-फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से पत्ती mesophyll कोशिकाओं में पीएनसी । a. पत्ता नमूना एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप एक 40X पानी विसर्जन लेंस होने पर मुहिम शुरू की है । B. A फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग दिी-पीएनसी और chloroplasts के लिए प्रयोग किया जाता है । C. Chloroplast ऑटो-प्रतिदीप्ति नैनोकणों (NNP) के बिना बफर घुसपैठ पत्ती नमूनों में दर्ज किया गया है । D. दिी-पीएनसी सिग्नल और chloroplast ऑटो प्रतिदीप्ति दिी-पीएनसी घुसपैठ पत्ती के नमूनों में imaged है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : निरीक्षण पीएनसी ROS फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से planta में सफाई । A. डीसीएफ फ्लोरोसेंट डाई (सामान्य ROS सिग्नल की निगरानी के लिए) पीएनसी के mesophyll कोशिकाओं में काफी कम है बफर नियंत्रण से पौधों घुसपैठ (कोई नैनोकणों, NNP). बी कम DHE फ्लोरोसेंट डाई (निगरानी सुपरऑक्साइड आयनों के लिए) पीएनसी के mesophyll कोशिकाओं में बफर नियंत्रण (NNP) के सापेक्ष पौधों घुसपैठ की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : Catalase (कैट) पीएनसी के mimetic गतिविधि । सहिजन peroxidase की उपस्थिति में, फ्लोरोसेंट जांच हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ प्रतिक्रिया करता है और resorufin (अवशोषक ५६० एनएम) में परिवर्तित कर दिया है । resorufin के अवशोषण, जो हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्तर का संकेत है, ५६० एनएम पर नजर रखी थी । पीएनसी ने एक बिल्ली mimetic गतिविधि दिखाई । मतलब ± एसई (मानक त्रुटि) (n = 4) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम पीएनसी संश्लेषण, लक्षण वर्णन, फ्लोरोसेंट डाई लेबलिंग, और नैनोकणों के फोकल इमेजिंग संयंत्र mesophyll कोशिकाओं के भीतर अपने vivo ROS सफाई गतिविधि में प्रदर्शित करने के लिए । पीएनसी cerium नाइट्रेट और अमोनियम हीड्राकसीड में पा समाधान के मिश्रण से संश्लेषित कर रहे हैं । पीएनसी अवशोषण spectrophotomery की विशेषता है और एकाग्रता बियर-Lamberts कानून का उपयोग निर्धारित किया है । जीटा संभावित माप8chloroplasts के लिए वितरण को बढ़ाने के लिए पीएनसी के नकारात्मक आरोप लगाया सतह की पुष्टि की । पीएनसी के लेबल के साथ एक फ्लोरोसेंट दिी डाई में सक्षम बनाता है vivo इमेजिंग द्वारा फोकल माइक्रोस्कोपी के भीतर पत्ती mesophyll कोशिकाओं जहां नैनोकणों दिखाने के उच्च स्तर के साथ colocalization के chloroplasts. DHE और डीसीएफ फ्लोरोसेंट रंगों का प्रयोग, हम की पुष्टि की है कि पीएनसी सुपरऑक्साइड आयनों और vivo मेंROS के एक शक्तिशाली मेहतर के रूप में कार्य करते हैं ।

synthesizing पीएनसी के लिए विधि एक सरल कदम-वार प्रक्रिया है कि नियंत्रित आकार, नकारात्मक प्रभारी, और ROS सफाई क्षमताओं16के साथ cerium ऑक्साइड नैनोकणों उत्पंन करता है । अंय तरीकों, जैसे थर्मल hydrolysis, उच्च तापमान और महंगी रसायन विज्ञान उपकरणों की आवश्यकता21,22। संश्लेषण और पीएनसी के लक्षण वर्णन एक कम लागत आम प्रयोगशाला उपकरण के साथ प्रदर्शन विधि है । यह एक तेजी से सीखने की आवश्यकता नहीं है एक एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम के व्यक्ती के आधार पर पौधों में आणविक तरीकों के साथ तुलना में, जैसे, वतन, APX, और बिल्ली, मॉडल सिस्टम23में ROS प्रजातियों की सफाई के लिए । पीएनसी एक मजबूत, पानी में घुलनशील ROS उत्प्रेरक मेहतर है कि श्रमसाध्य क्लोनिंग और परिवर्तन तरीकों है कि संयंत्र आनुवंशिक पथ और उपलब्ध आणविक toolkit पर निर्भर कर रहे है की आवश्यकता नहीं होगी है ।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है पीएनसी के साथ पत्ती mesophyll कोशिकाओं के सिरिंज आधारित घुसपैठ । जीवित पौधों में नैनोकणों की घुसपैठ धीरे पत्ती24को शारीरिक क्षति से बचने के लिए किया जाना चाहिए । इस प्रकार, तरीकों के प्रोटोकॉल चरण 4 में के रूप में, धीरे से बचने के लिए सिरिंज के साथ पत्ती की सतह के खिलाफ धक्का फाड़ या abaxial पत्ती सतह puncturing. यह एक थालियाना पत्ती की abaxial सतह से घुसपैठ करने के लिए बेहतर है क्योंकि यह adaxial सतह से उच्च stomatal घनत्व है25,26। इसके अलावा, पीएनसी या दिी के एक बफर समाधान शारीरिक पीएच रेंज के भीतर पीएनसी (~ पीएच ७.५) पत्ती लेमिना घुसपैठ के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम के लिए पीएनसी के उचित एकाग्रता का अध्ययन संयंत्र के ऊतकों को लागू है । इस प्रोटोकॉल में, पीएनसी के ५० mg/L थालियाना पत्तियों को विषाक्त नहीं था, जबकि उत्प्रेरक पीएनसी ROS सफाई को सक्षम करने से । वर्तमान nanoparticle वितरण पद्धति की कुछ सीमाएं हैं 1) संयंत्र प्रजातियों के लिए लागू नहीं मोटी और मोमी cuticles या कम stomatal घनत्व, 2) क्षेत्र में अनुप्रयोगों के लिए स्केलेबल नहीं, 3) एक फोकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली की उच्च लागत पर नजर रखने के लिए vivo nanoparticle डिस्ट्रीब्यूशन और ROS सफ़ाई में ।

इस प्रोटोकॉल का अध्ययन और पौधों में अजैव तनाव सहिष्णुता पत्ती लेमिना घुसपैठ की एक सतही विधि के माध्यम से सुधार के लिए ROS सफाई पीएनसी के आवेदन को दर्शाता है । ROS संचय पौधों, जो बदले में संयंत्र प्रकाश संश्लेषण, विकास, और8,27,28उपज कम कर देता है में अजैव तनाव के साथ है । संयंत्र जेनेटिक में ROS हेरफेर के लिए आनुवंशिक संशोधनों के तरीकों अक्सर संयंत्र मॉडल प्रजातियों तक ही सीमित है जबकि पीएनसी ROS-सफाई के लिए विभिंन जंगली प्रकार के संयंत्र प्रजातियों के लिए लागू होने की क्षमता है । पत्ती लेमिना घुसपैठ समझ और इंजीनियरिंग संयंत्र अजैव तनाव सहिष्णुता के लिए पत्ती के ऊतकों में ROS सफाई बढ़ाने के लिए एक व्यावहारिक अनुसंधान पद्धति है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के कैलिफोर्निया, नदी के किनारे और USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि, हैच परियोजना १००९७१० J.P.G. को संस्थान के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया इस सामग्री को J.P.G. के लिए ग्रांट No १८१७३६३ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cerium (III) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 238538-100G
Molecular Biology Grade Water, Corning VWR 45001-044 
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes VWR 14-959-49A
Poly (acrylic acid) 1,800 Mw Sigma-Aldrich 323667-100G
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-370
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer Fisher Scientific 02-215-391
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set Fisher Scientific 02-215-395
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 05002-1L
PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning VWR 13912-149 
RCT basic IKA 3810001
Eppendorf Microcentrifuge 5424 VWR 80094-126
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore-Sigma UFC901024
Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge Beckman Coulter B06314
UV-2600 Sptecrophotometer Shimadzu UV-2600 120V
Whatman Anotop 10 syringe filter Sigma-Aldrich WHA68091102
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-829-45
Zetasizer Nano S Malvern Panalytical Zen 1600
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma-Aldrich 42364-100MG
Dimethyl Sulfoxide, ACS VWR BDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1 Green Island Distributors, Inc 5212601.CFL080P
Adaptis 1000 Conviron A1000
TES, >99% (titration Sigma-Aldrich T1375-100G
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266-1KG
Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe Fisher Scientific 14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Carolina Observation Gel Carolina 132700
Corning microscope slides, frosted one side, one end Sigma-Aldrich CLS294875X25-72EA
Cork Borer Sets with Handles Fisher Scientific S50166A
Perfluorodecalin Sigma-Aldrich P9900-25G
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-045
Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 Leica Microsystems TCS SP5
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma-Aldrich D6883-250MG
Dihydroethidium Sigma-Aldrich D7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Eppendorf Uvette cuvettes Sigma-Aldrich Z605050-80EA
Chlorophyll meter  Konica Minolta SPAD-502

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