Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Katalytisk rensning av växten reaktivt syre arter In Vivo av anjon Cerium Oxide nanopartiklar

Published: August 26, 2018 doi: 10.3791/58373
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för syntes och karakterisering av cerium oxide nanopartiklar (nanoceria) för ROS (reaktiva syreradikaler) rensning i vivo, nanoceria imaging i växt vävnader av konfokalmikroskopi, och i vivo övervakning av nanoceria ROS rensning av konfokalmikroskopi.

Abstract

Reaktivt syre arter (ROS) ackumulering är ett kännetecken för växt abiotisk stress svar. ROS spelar en dubbel roll i växter genom att agera som signalmolekyler på låga nivåer och skadliga molekyler på höga nivåer. Ansamling av ROS i stressade växter kan skada metaboliter, enzymer, lipider och DNA, orsakar en minskning av växters tillväxt och avkastning. Cerium oxide nanopartiklar (nanoceria) förmåga att katalytiskt rensa ROS i vivo ger en unikt verktyg att förstå och bioengineer växt abiotisk stresstålighet. Här presenterar vi ett protokoll för att syntetisera och karakterisera poly (akryl) syra belagda nanoceria (PNC), gränssnitt nanopartiklarna med växter via leaf lamina infiltration och övervaka sin distribution och ROS rensning i vivo med confocal mikroskopi. Aktuella molekylära verktyg för att manipulera ROS ackumulering i växter är begränsad till modell arter och kräver mödosamma transformation metoder. Detta protokoll för i vivo ROS rensning har potential att användas för vildtyp växter med breda blad och löv struktur som Arabidopsis thaliana.

Introduction

Cerium oxide nanopartiklar (nanoceria) används allmänt i levande organismer, från grundforskning till bioteknik, på grund av deras distinkta katalytisk reaktiva syreradikaler (ROS) rensning förmåga1,2,3. Nanoceria har ROS rensning förmåga på grund av ett stort antal ytan syre vakanser som växlar mellan två oxidation (CE-3 + och Ce4 +) 4,5,6. CE-3 + dinglande obligationerna rensar effektivt ROS medan de galler stammarna på nanonivå främja regenerering av dessa defekt platser via redox cykling reaktioner7. Nanoceria har också nyligen använts för att studera och engineering plantera funktion8,9. Växter under abiotisk stress uppleva ansamling av ROS, orsakar oxidativa skador på lipider, proteiner och DNA10. I A. thaliana växter leder nanoceria katalytisk rensning av ROS i vivo till förbättrad växt fotosyntesen under hög ljus, värme och kylning betonar8. Tillämpa nanoceria att jord också ökar skjuta biomassa och korn avkastning av vete (Triticum aestivum)11. raps (Brassica napus) växter behandlas med nanoceria har högre växtbiomassa under salt stress12.

Nanoceria erbjuder bioengineers och plantera biologer ett nanoteknikbaserade verktyg för att förstå abiotisk stress svaren och förbättra anläggningen abiotisk stresstålighet. Nanocerias i vivo ROS rensning funktioner är oberoende av växtarter och lättköpt leverans till växt vävnader har potential att möjliggöra bred tillämpning utanför modellorganismer. Till skillnad från andra genetiskt-baserade metoder, nanoceria inte kräver radgenerering växt med överuttryck av antioxidant enzymer för högre ROS rensning förmåga13. Leaf lamina infiltration av nanoceria växter är ett praktiskt tillvägagångssätt för lab-baserad forskning.

Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva 1) syntesen och karakterisering av negativt laddade poly (akryl) sura nanoceria (PNC), 2) leverans och spårning av PNC hela blad celler, och 3) övervakningen av PNC-aktiverade ROS rensning i vivo. I detta protokoll är negativt laddade poly (akryl) sura nanoceria (PNC) syntetiseras och kännetecknas av deras Absorberingsspectrum, hydrodynamisk diameter och zeta potential. Vi beskriver en enkel leaf lamina infiltration metod för att leverera PNC in växten leaf vävnader. För in-vivo imaging av nanopartiklar distribution inom mesophyll celler användes ett fluorescerande färgämne (DiI) att märka PNC (DiI-PNC) och iaktta nanopartiklarna via confocal fluorescensmikroskopi. Slutligen förklarar vi hur du övervakar i vivo PNC ROS rensning genom konfokalmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. A. thaliana plantor

  1. A. thaliana fröer i 5 x 5 cm disponibla krukor fyllda med standard jord mix. Sätta 32 av dessa krukor i en plastbricka fylld med vatten (~ 0,5 cm djup) och överför plastbehållaren med växter till en växt tillväxt kammare.
    1. Ange tillväxten kammare inställningar enligt följande: 200 µmol/ms fotosyntetiska aktiv strålning (PAR), 24 ± 1 ° C dag och 21 ± 1 ° C natt, 60% luftfuktighet och 14/10 h dag/natt lättreglering, respektive.
  2. Tunna varje pott att lämna endast en enskild växt efter en vecka av grobarheten. Notera att hålla plantorna med liknande storlek i varje kruka.
  3. Vatten krukor av hälla vatten direkt på plast facket en gång varje två dagar. Odla växterna fyra veckor. A. thaliana växter är redo för vidare användning.

2. Sammanfattning och karakterisering av PNC

  1. Väga 1,08 g cerium (III) nitrat och lös den i 2,5 mL vatten för molekylärbiologi kvalitet i en 50 mL konisk tub.
  2. Väga 4,5 g poly (akryl) syra och lös den i 5 mL molekylärbiologi grade vatten i en 50 mL konisk tub.
  3. Blanda dessa två lösningar grundligt vid 2.000 rpm i 15 min med hjälp av en digital vortex mixer.
  4. Överföra 15 mL ammoniumhydroxidlösning (7,2 M) till en 50 mL glasbägare.
  5. Under omrörning på 500 rpm, tillsätt blandningen från steg 2,3 droppvis till ammoniumhydroxidlösning och rör vid 500 rpm vid rumstemperatur för 24 hr i dragskåp.
  6. Täck bägaren med en bit papper för att undvika betydande förlust av lösning under natten reaktionen.
  7. Efter 24 h, överföra den resulterande lösningen till en 50 mL konisk rör och centrifugera det 3,900 x g för 1 h att ta bort all möjligt skräp och stora agglomeratbildning.
  8. Överför denna 22,5 mL av supernatanten till tre 15 mL 10 kDa filter och fyll resten av filtret med att göra en total utspädning av 45 mL vatten för molekylär användning.
  9. Rena supernatanten från gratis polymerer och andra reagenser med en bänkmonterade centrifug genom att lägga till supernatanten till en 15 mL 10 kDa filter och centrifugera vid 3,900 x g i 15 min. Upprepa detta minst sex gånger.
  10. Mät absorbansen hos eluenten i varje cykel med en UV-VIS spektrofotometer från 220-700 nm att säkerställa ingen gratis polymerer och andra reagenser finns i den slutliga PNC-lösningen.
  11. Ta den insamlade PNC-lösningen i 5 mL sprutan och filtrera det mot ett 20 nm pore storlek spruta filter. Samla den filtrerade PNC lösningen i en 50 mL konisk tub.
  12. Ta en utspädd slutliga PNC lösning i en plast kyvetten och mäta dess absorbansen med UV-VIS spektrofotometer från 220-700 nm. PNC absorbansen toppen är 271 nm.
  13. Beräkna dess koncentration med öl-Lamberts lag: A = εCL. A är det högsta värdet för ett givet prov absorbans, ɛ är den molära absorptionskoefficienten av PNC (cm-1 M-1), L är den optiska ljuspassagelängden (kyvetten bredd, 1 cm i denna metod) och C är molära koncentrationen av uppmätta nanopartiklar.
  14. Mäta den hydrodynamiska diameter och zeta potential av syntetiserade PNC med hjälp av en partikel storlek och zeta potential analyzer (figur 1).
  15. Lagra den slutliga PNC lösningen i kylskåp (4 ° C) tills vidare användning.
    Obs: Vänligen se Wu et al. 8 för mer protokolldetaljer om PNC karakterisering.

3. märkning PNC med DiI fluorescerande färgämne

  1. Blanda 0,4 mL 5 mM (58 mg/L) PNC med 3,6 mL av molekylär biologi klass vatten i en 20 mL injektionsflaska av glas och rör vid 500 rpm.
  2. Lägg till 24 µL 1 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat dye lösning (DiI, 2,5 mg/mL utspädd i DMSO) in 176 µL av DMSO (dimetyl sulfoxid) att göra DiI dye lösningen.
  3. Lägger till DiI färgämnet droppvis i PNC lösningen, omrörning vid 1000 rpm för 1 min i rumstemperatur.
  4. Överför detta resulterande blandningen in i en 15 mL 10 kDa filter och fylla röret till toppen med molekylärbiologi grade vatten till den totala utspädningen 15 mL.
  5. Rena de DiI märkt PNC (DiI-PNC) lösning från DMSO och alla möjliga gratis DiI färgämne en bänkmonterade centrifugering med 15 mL 10 kDa filtret vid 3,900 x g i 5 min.
    1. Upprepa steg 3.5 minst fem gånger.
  6. Filtrera DiI-PNC lösningarna genom en 20 nm pore storlek spruta filter.
  7. Mät absorbansen hos slutliga DiI-PNC av UV-VIS spektrofotometri och beräkna dess koncentration enligt öl-Lamberts lag (figur 2). Se steg 2.13 för mer information.
  8. Förvara den i kylskåp vid 4 ° C för vidare användning.

4. infiltration av växten lämnar med PNC

  1. Tillsätt 0,1 mL infiltration buffert (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, justerat med HCl) i 0,9 mL 0,5 mM PNC eller DiI-PNC lösning och vortex det. Använd en lösning av 10 mM TES infiltration buffert som en negativ kontroll.
  2. Överföra 0,2 mL av PNC eller DiI-PNC infiltration lösningen till en 1 mL steril nålfri spruta. Tryck för att avlägsna eventuella luftbubblor.
  3. Hämta växten från tillväxt kammaren precis innan infiltration med nanopartiklar att undvika möjliga stomata stängning under rum ljusförhållanden.
  4. Innan infiltration, mäta halten klorofyll från A. thaliana blad med liknande storlek med en klorofyll-mätare. Mäta varje blad med tre replikat (varje replikat bestående av minst tre mätningar)14. Välj den A. thaliana lämnar med liknande klorofyllhalt för infiltration experimentet.
  5. Infiltrera bladen långsamt med nyberett PNC eller DiI-PNC lösningen genom att försiktigt trycka spetsen av den nålfri sprutan mot botten av den leaf lamina (abaxial sidan) och trycka ned kolven (figur 3A).
  6. Försiktigt torka bort överflödig lösningen som finns kvar på ytan av blad lamina (figur 3B) med en delikat uppgift wiper (figur 3C) och etiketten anläggningen. Använd nya grannlaga uppgift våtservetter för varje grupp av bladen.
  7. Hålla den infiltrerade A. thaliana växter på bänken för leaf anpassning och inkubation med PNC eller DiI-PNC i 3 h.
    Obs: Infiltrerade A. thaliana växter är sedan redo för vidare användning (figur 3D).

5. beredning av Leaf prover för konfokalmikroskopi

  1. Rulla en ärt-storlek mängd observation gel till ca en 1 cm radie (figur 4A) och sedan sprida ut tills det är 1 mm tunna på en glasskiva (figur 4B).
  2. Använda en kork borer (diameter 0,3 cm) att skära ut ett cirkulärt tvärsnitt vid centrum av observation gelen i glas bilden (figur 4C).
  3. Fyll snittet väl helt med perfluorodecalin (PFD) för djupare och bättre confocal imaging upplösning i leaf vävnader.
  4. Använda en kork borer (diameter 0,2 cm) att samla löv skivor från anpassade DiI-PNC infiltrerat A. thaliana växter (figur 4D).
  5. Montera leaf skivan i den PFD fylld möta den infiltrerade (abaxial) sidan av bladet.
  6. Sätta en fyrkantig täckglas ovanpå leaf skivan och tryck försiktigt på det bilden täckglaset jämnt att försegla det med väl av observation gel och se till att inga luftbubblor förblir instängd (figur 4E).

6. imaging DiI-PNC i Leaf vävnader av konfokalmikroskopi

  1. Använd ett 40 X-objektiv i en inverterad laserscanning confocal mikroskopet.
  2. Släpp två till tre droppar ddH2O på toppen av de 40 X-objektivet.
  3. Placera beredd DiI-PNC infiltrerat leaf prov bilden ovanpå de inverterade 40 X objektiv lins.
    1. Kontrollera sidan täckglas men inte glaset Skjut kontakt direkt med ddH2O på objektivet.
  4. Hitta ett område av intresse i provet i Mikroskop med laserljus eller ljusa fält.
  5. Starta programvaran mikroskopet och slå på Argon laser (inställd på 20%).
  6. Ställ in pinhole att samla en optisk skiva mindre än 2 µm och en rad genomsnitt 4.
  7. Bild provet med confocal Mikroskop inställningar: 514 nm laser excitation (30%). Z-Stack snittjocklek: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (för DiI-PNC imaging); PMT2: 700-800 nm (för kloroplast imaging).
  8. Ta representativa confocal bilder av leaf prover från olika individer, minst tre biologiska replikat.

7. imaging PNC i vivo som ROS rensning av konfokalmikroskopi

  1. Förbereda 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA, ett färgämne för att indikera en allmän ROS) och 10 µM dihydroethidium (DHE, ett färgämne för att indikera superoxid anjon) färgämnen i TES infiltration buffert (pH 7,5) i 1,5 mL mikrocentrifugrör, separat.
  2. Använda en kork borer (diameter 0,2 cm) för att samla löv skivor från anpassade PNC infiltrerat A. thaliana växter.
    1. Använd den vassa spetsen av tången för att göra fyra hål på leaf skivor att påskynda dye lastning process.
  3. Överföring blad skivor till mikrocentrifugrör med H2DCFDA och DHE separat och inkubera i 30 min under mörker.
  4. Efter inkubation, skölj bladet skivor med ddH2O tre gånger och montera det i glaset glida med observation gel (se protokollet avsnitt 5).
  5. Placera bilden på mikroskopet confocal och manuellt fokus till en region av leaf mesophyll celler. Se protokoll avsnitt 6 för detaljer.
  6. Exponera leaf skivorna till UV-A (405 nm) laser för 3 min att generera ROS och registrera ändringen ROS signal intensiteten i tidsserier (”xyt”) per blad skiva.
  7. Bild leaf skivan med confocal Mikroskop inställningar: 40 X vatten mål; 496 nm laser magnetisering; PMT1: 500-600 nm (för DHE och DCFDA dye upptäckt); PMT2: 700-800 nm (för kloroplaster detection). Använd en växt som infiltrerade med enbart infiltration buffertlösning som negativ kontroll.

8. PNC rensning av H2O2in vitro

  1. Beteende katt (katalas) mimetiska aktiviteten av den syntetiserade PNC i vitro genom att följa metoderna i tidigare publikationer3,8,15
  2. Lägg till 45,4 µL av 1 x TES infiltration buffert (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, justeras av HCl), PNC (60 nM, 3 µL), och H2O2 (2 µM, 1 µL) i en brunn (vit rund botten 96 väl pläterar), och försiktigt blanda det genom pipettering.
  3. Lägga till 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (arbetande koncentration 100 µM, 0,5 µL) och pepparrotsperoxidas (HRP; arbetande koncentration 0,2 U/mL, 0.1 µL) i brunnen, försiktigt blanda det genom pipettering och inkubera det i 30 min. 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine reagerar med H2O2 och omvandlas till resorufin i närvaro av HRP.
    1. Wrap plattan med aluminiumfolie för att undvika ljus under ruvningen.
    2. Förbereda en negativ kontroll med hjälp av reaktion buffert eller vatten för att ersätta H2O2.
    3. Med undantag för stamlösningen, förbereda alla andra lösningar vid rumstemperatur.
  4. Efter inkubering, med en spektrofotometer, övervaka absorbansen vid 560 nm att använda resorufin som indikerar nivån på H2O2. Inställd tid regimen på 0, 2, 5, 10, 20 och 30 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PNC syntes och karakterisering .
PNC var syntetiseras, renas och kännetecknas följande metoden beskrivs i protokollet avsnitt 2. Figur 1 A visar färgning av lösningar av cerium nitrat, PAA, blandningen av cerium nitrat och PAA och PNC. En färgförändring från vit till ljusgul ses efter PNC syntetiseras. Efter rening med 10 kDa filter karakteriserades PNC med en UV-VIS-spektrofotometer. En topp av absorbansen för PNC observerades vid 271 nm (figur 1B). Den slutliga eluenten mättes också med UV-VIS att bekräfta att de icke-reagerade kemikalierna spolades under reningen. Hydrodynamiska diameter och zeta potential syntetiserade PNC mättes med en particle sizer och zeta potential analyzer (figur 1C).

PNC märkning med DiI färgämne .
För att bestämma fördelningen av nanopartiklar i vivo, PNC var märkt med ett fluorescerande DiI färgämne efter den metod som beskrivs i protokollet avsnitt3. DiI dye bäddar inom PNC beläggningen spontant eftersom det kan kapsla in de hydrofoba domänerna släpper polymera beläggningar nanoceria16. Efter att DiI dye till PNC lösningen, ändra en snabb färg till rosa observerades (figur 2A). Dierna märkt PNC var sedan renas med 10 kDa filter och kännetecknas av en UV-VIS spektrofotometri. Tre tydliga toppar av absorbansen för den DiI märkt PNC observerades (figur 2B). Den slutliga eluenten mättes genom UV-VIS spektrofotometri att bekräfta att de icke-reagerade kemikalierna spolades under reningen.

Leaf Lamina infiltration.
PNC eller DiI-PNC levererades till A. thaliana blad via leaf lamina infiltration metod som beskrivs i protokollet avsnitt 4. Leaf var infiltrerat på fyra olika ställen att säkerställa full leaf området var perfusion med PNC-lösning (figur 3A). Överbliven lösning har tagits bort från leaf ytan (figur 3B och 3 C). Leaf färgen förändrats under infiltration från grönt till mörkare grön (figur 3D). Sprutan var försiktigt pressas mot bladet att undvika fysisk skada.

Leaf provberedning för fluorescensmikroskopi.
Leaf prover var monterade på glasskivor inom en observation gel gjort väl fylld med PFD. Efter valsningen ärt storlek observation gelen i bilden (figur 4A och 4B), gjordes en väl mitt platta gelen (figur 4C). Sedan, nylagade leaf skivan överfördes till brunnen tidigare fylld med PFD lösning (figur 4D). Ett täckglas användes för att immobilisera leaf provet i bilden (figur 4E).

Confocal avbildning av DiI-PNC i vivo .
DiI-PNC infiltrerat A. thaliana bladen användes för att bestämma fördelningen av DiI-PNC i leaf mesophyll celler via confocal imaging (figur 5A och 5B). För att visualisera colocalization mellan DiI-PNC och kloroplaster, var DiI-PNC infiltrerat leaf prover glada med 514 nm laser. Utsläpp av DiI-PNC sattes vid 550-615 nm att undvika eventuella störningar av kloroplast pigment signaler efter ~ 650 nm17. Den klorofyll auto-fluorescensen från kloroplaster upptäcktes från 700-800 nm. Confocal imaging inställningarna sattes (laser makt och vinning) för att se till att inga DiI dye signaler upptäcktes i det stickprov som leaf (infiltrerade med enda buffert) (bild 5C). Colocalization av DiI-PNC med kloroplaster i leaf mesophyll celler kan observeras av vybilden av upptäckta DiI-PNC och kloroplast pigment autofluorescens (figur 5D).

Confocal avbildning av PNC ROS rensning i vivo .
PNC i 10 mM TES buffertlösning levererades till A. thaliana blad via metoden leaf lamina infiltration som beskrivs i protokollet avsnitt 7. DHE (dihydroethidium) och H2DCFDA (2′, 7-dichlorodihydrofluorescein diacetat) fluorescerande färgämnen används för att visualisera ROS i växt vävnader8,18. H2DCFDA är känd som ska konverteras till fluorescerande DCF (2′, 7-dichlorofluorescein, en indikator på graden av allmän oxidativ stress) på grund av klyvning av acetat grupper av ROS19. DHE är en mer specifik färgämne för superoxid anjon ha dess fluorescerande produkten (2-hydroxyethidium) öka vid reaktion med en superoxid anjon20. In vivo ROS rensning aktiveras av PNC övervakades i leaf skivor mäta DHE och DCF dye fluorescens intensitet förändringar (siffror 6A och 6B). PNC infiltrerat leaf prover var glada med 496 nm laser. Utsläpp av DHE och DCF dye fastställdes till 500-600 nm att undvika de eventuella störningen med kloroplast auto-fluorescens signaler. Pigment auto-fluorescens från kloroplaster upptäcktes från 700-800 nm. Efter 3 minuter av UV-stress, signaler ROS färgämnet i PNC och buffert-infiltrerade leaf prover var övervakas separat. Jämfört med kontrollen nr-nanopartiklar buffert (NNP), PNC infiltrerat blad visade betydligt mindre ROS-aktiverat fluorescerande DCF dye signal(figur 6). Liknande resultat hittades också med superoxid anjon-aktiverat DHE färgämnet, där PNC infiltrerat bladen hade betydligt mindre DHE dye intensitet än buffert infiltrerat kontroll blad (figur 6B).

PNC katt mimetisk aktivitet assay . Haltbestämning av PNC rensning av H2O2 beskrevs i protokollet avsnitt 8. En minskning av resorufin vilket indikerar H2O2 -nivå i reaktionsblandningen innehåller PNC observerades (figur 7), bekräftar katt mimetiska aktiviteten av syntetiserade PNC.

Figure 1
Figur 1 : Syntes och karakterisering av PNC. A. färgning av cerium nitrat, poly akrylsyra (PAA), blandning av cerium nitrat och PAA, och syntetiserade PNC (PAA belagda cerium oxide nanopartiklar, ljusgul). B. absorbansen spectrum av PNC mätt med UV-VIS spektrofotometri. C. Hydrodynamic diameter och zeta potential syntetiserade PNC. Menar ± medelfel (n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : PNC märkning med DiI fluorescerande färgämne. A. PNC (ljusgul) och DiI färga märkta PNC lösning (DiI-PNC, rosa). B. absorbansen spectrum av DiI-PNC lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Leaf lamina infiltration av PNC eller DiI-PNC. A. A. thaliana blad innan infiltration. Lösningen inuti sprutan är DiI-PNC. B. blad infiltrerade med DiI-PNC. C. den återstående rengöringsmedel från leaf ytan med delikat uppgift våtservetter. D. rengöras A. thaliana leaf infiltrerade med DiI-PNC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Beredning av leaf exempelbilder. A. mikroskopi glasskiva med ärt storlek observation geler. B. Skjut med platt observation geler. C. Skjut med platt observation gel med en brunn i mitten. D. Skjut med leaf skivor i observation gel väl fylld med perfluorodecalin (PFD) lösning. E. bild med leaf skivor orörlig med täckglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Imaging DiI-PNC i leaf mesophyll celler via konfokalmikroskopi. A. blad prov är monterad på en inverterad confocal Mikroskop med en 40 X vatten nedsänkning lins. B. en confocal Mikroskop används för imaging DiI-PNC och kloroplaster. C. kloroplast auto-fluorescens registreras i buffert infiltrerat leaf prover utan nanopartiklar (NNP). D. DiI-PNC signal och kloroplast auto-fluorescens är avbildade i DiI-PNC infiltrerat leaf prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Övervakning PNC ROS rensning i planta via konfokalmikroskopi. A. DCF fluorescerande färgämne (för övervakning av allmän ROS signal) är betydligt lägre i mesophyll celler av PNC infiltrerat växter än buffer control (inga nanopartiklar, NNP). B. minskad DHE fluorescerande färgämne (för övervakning superoxid anjon) i mesophyll celler av PNC infiltrerat växter i förhållande till buffert kontroll (NNP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Katalas (CAT) mimetiska aktiviteten av PNC. I närvaro av pepparrotsperoxidas, fluorescerande sonden reagerar med väteperoxid och konverteras till resorufin (absorbans 560 nm). Absorbans resorufin, som är vägledande för väteperoxid nivåer, övervakades på 560 nm. PNC visade en katt mimetisk aktivitet. Menar ± SE (standardfel) (n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll beskriver vi PNC syntes, karakterisering, fluorescerande färgämne märkning och confocal avbildning av nanopartiklarna inom mesophyll växtceller att ställa ut sin i vivo ROS rensning verksamhet. PNC syntetiseras från en blandning av cerium nitrat och PAA lösning i ammoniumhydroxid. PNC kännetecknas av absorption spectrophotomery och den koncentration som fastställs med hjälp av öl-Lamberts lag. Zeta potential mätningar bekräftade negativt laddade ytan av PNC för att förbättra leverans till kloroplaster8. Märkning av PNC med ett fluorescerande färgämne DiI gör i vivo imaging av konfokalmikroskopi inom leaf mesophyll celler där nanopartiklarna visar höga nivåer av colocalization med kloroplaster. Med DHE och DCF fluorescerande färger, bekräftade vi PNC akten som en potent asätare superoxid anjon och ROS i vivo.

Metoden för att syntetisera PNC är en enkel stegvis procedur som genererar cerium oxide nanopartiklar med kontrollerad storlek, negativ laddning och ROS rensning funktioner16. Andra metoder, såsom termisk hydrolys, kräver höga temperaturer och dyra kemi utrustning21,22. Syntes och karakterisering av PNC är en billig metod utförs med gemensamma laboratorieutrustning. Det kräver inte en brant inlärningskurva jämfört med molekylära metoder i växter utifrån överuttryck av en antioxidant enzymet, t.ex., SOD, APXoch katt, för rensning ROS arter i modell system23. PNC är en robust, vattenlösliga ROS katalytisk asätare som inte kräver mödosamma kloning och omvandling metoder som är beroende av anläggningens genetiska tractability och tillgängliga molekylär toolkit.

Ett avgörande steg i detta protokoll är sprutan-baserade infiltrationen av leaf mesophyll celler med PNC. Infiltration av nanopartiklar i levande växter bör göras försiktigt för att undvika fysiska skador till leaf24. Således, som i protokollet Steg4 av metoder, tryck försiktigt mot den blad-ytan med sprutan att undvika sönder eller punktera abaxial leaf ytan. Det är bättre att infiltrera från abaxial yta av A. thaliana blad eftersom den har högre stomatala densitet än den adaxial ytan25,26. Dessutom en buffrad lösning av PNC eller DiI-PNC inom fysiologiska pH-intervall (~ pH 7.5) bör användas under leaf lamina infiltration. En annan avgörande steg i detta protokoll är att tillämpa lämpliga koncentrationen av PNC på de studerat växtvävnad. I detta protokoll var 50 mg/L av PNC inte giftigt för A. thaliana bladen administratörsfunktioner katalytisk PNC ROS rensning. Vissa begränsningar av den nuvarande nanopartiklar leveransmetoden 1) inte är tillämpliga växtarter med tjock och vaxartad nagelbanden eller låg stomatala tätheter, 2) inte skalbar för applikationer i fältet (3) den höga kostnaden för ett konfokalmikroskopi-system för att övervaka i vivo nanopartiklar distribution och ROS rensning.

Detta protokoll visar tillämpningen av ROS rensning PNC för att studera och förbättra abiotisk stresstålighet i växter genom en lättköpt metod för leaf lamina infiltration. ROS ackumulering åtföljs av abiotiska betonar i växter, vilket i sin tur minskar växt fotosyntes, tillväxt, och ge8,27,28. Anläggningen genmodifieringar metoder för ROS manipulation i vivo är ofta begränsade till växtarter modell medan PNC ROS-rensning har potential att tillämpas på olika vildtyp växtarter. Leaf lamina infiltration är en praktisk forskningsmetod att öka ROS rensning i leaf vävnader för förståelse och tekniska anläggningen abiotisk stresstålighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd av University of California, Riverside och USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk, Hatch projektet 1009710 till J.P.G. Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation under Grant nr 1817363 till J.P.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cerium (III) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 238538-100G
Molecular Biology Grade Water, Corning VWR 45001-044 
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes VWR 14-959-49A
Poly (acrylic acid) 1,800 Mw Sigma-Aldrich 323667-100G
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-370
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer Fisher Scientific 02-215-391
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set Fisher Scientific 02-215-395
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 05002-1L
PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning VWR 13912-149 
RCT basic IKA 3810001
Eppendorf Microcentrifuge 5424 VWR 80094-126
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore-Sigma UFC901024
Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge Beckman Coulter B06314
UV-2600 Sptecrophotometer Shimadzu UV-2600 120V
Whatman Anotop 10 syringe filter Sigma-Aldrich WHA68091102
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-829-45
Zetasizer Nano S Malvern Panalytical Zen 1600
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma-Aldrich 42364-100MG
Dimethyl Sulfoxide, ACS VWR BDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1 Green Island Distributors, Inc 5212601.CFL080P
Adaptis 1000 Conviron A1000
TES, >99% (titration Sigma-Aldrich T1375-100G
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266-1KG
Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe Fisher Scientific 14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Carolina Observation Gel Carolina 132700
Corning microscope slides, frosted one side, one end Sigma-Aldrich CLS294875X25-72EA
Cork Borer Sets with Handles Fisher Scientific S50166A
Perfluorodecalin Sigma-Aldrich P9900-25G
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-045
Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 Leica Microsystems TCS SP5
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma-Aldrich D6883-250MG
Dihydroethidium Sigma-Aldrich D7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Eppendorf Uvette cuvettes Sigma-Aldrich Z605050-80EA
Chlorophyll meter  Konica Minolta SPAD-502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
  2. Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
  3. Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
  4. Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
  5. Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
  6. Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
  7. Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
  8. Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
  9. Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
  10. Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
  11. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
  12. Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
  13. Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
  14. Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
  15. Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
  16. Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
  17. Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
  18. Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
  19. Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
  20. Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
  21. Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
  22. Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
  23. Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
  24. Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
  25. Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
  26. Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
  27. Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
  28. Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).

Tags

Bioteknik fråga 138 abiotisk stress nanoceria confocal imaging leaf lamina infiltration växt ROS rensning
Katalytisk rensning av växten reaktivt syre arter <em>In Vivo</em> av anjon Cerium Oxide nanopartiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newkirk, G. M., Wu, H., Santana, I., More

Newkirk, G. M., Wu, H., Santana, I., Giraldo, J. P. Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (138), e58373, doi:10.3791/58373 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter