Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Katalytisk Scavenging plante reaktive ilt arter In Vivo af anioniske Cerium oxid nanopartikler

Published: August 26, 2018 doi: 10.3791/58373
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til syntese og karakterisering af cerium oxid nanopartikler (nanoceria) for ROS (reaktiv ilt arter) Gaderenovation i vivo, nanoceria imaging i plantevæv ved Konfokal mikroskopi og i vivo overvågning af nanoceria ROS scavenging af Konfokal mikroskopi.

Abstract

Reaktive ilt arter (ROS) akkumulering er kendetegnende for anlægget abiotisk stressrespons. ROS spiller en dobbelt rolle i planter ved at fungere som signalering molekyler på lavt niveau og beskadige molekyler på højt niveau. Ophobning af ROS i stressede planter kan beskadige metabolitter, enzymer, lipider og DNA, forårsager en reduktion af planternes vækst og udbytte. Evnen af cerium oxid nanopartikler (nanoceria) til katalytisk skyllepumpetab ROS i vivo giver et unikt værktøj til at forstå og bioengineer plante abiotisk stresstolerance. Vi præsenterer her, en protokol for at syntetisere og karakterisere poly (akryl) syre coated nanoceria (PNC), interface nanopartikler med planter via blad lamina infiltration og overvåger deres distribution og ROS Gaderenovation i vivo bruger Konfokal mikroskopi. Nuværende molekylære værktøjer til at manipulere ROS ophobning i planter er begrænset til model arter og kræve omstændelig transformation metoder. Denne protokol for i vivo ROS scavenging har potentiale til at blive anvendt til vildtype planter med brede blade og blade struktur som Arabidopsis thaliana.

Introduction

Cerium oxid nanopartikler (nanoceria) er udbredt i levende organismer, fra grundforskning til bioteknologi, på grund af deres forskellige katalytisk reaktive ilt arter (ROS) skylleluften evne1,2,3. Nanoceria har ROS scavenging evner på grund af et stort antal overflade ilt ledige stillinger, der veksler mellem to oxidation stater (CE-3 + og CE-4 +) 4,5,6. CE-3 + dinglende obligationer skyllepumpetab effektivt ROS mens gitter stammer på nanoplan fremme regenerering af disse defekt websteder via redox cykling reaktioner7. Nanoceria har også været brugt for nylig for at studere og engineering plant funktion8,9. Planter under abiotisk stress opleve ophobning af ROS, forårsager oxidative skader på lipider, proteiner og DNA10. I A. thaliana planter fører nanoceria katalytisk scavenging ROS i vivo til forbedret plante fotosyntese under høj lys, varme og nedkøling understreger8. Anvende nanoceria til jord også øger skyde biomasse, og korn udbytte af hvede (Triticum aestivum)11; raps (Brassica napus) planter behandlet med nanoceria har højere plantebiomasse under salt stress12.

Nanoceria tilbyder bioengineers og plante biologer en nanoteknologi-baseret værktøj til at forstå abiotisk stress svar og forbedre plante abiotisk stresstolerance. Nanocerias i vivo ROS skylleluften kapaciteter er uafhængige af plantearter, og den facile levering i plantevæv har potentiale til at aktiverer bred anvendelse uden for modelorganismer. Nanoceria kræver i modsætning til andre genetisk baserede metoder, ikke generere plante linjer med overekspression af antioxidant enzymer til højere ROS skylleluften evne13. Leaf lamina infiltration af nanoceria planter er en praktisk tilgang til lab-baseret forskning.

Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive 1) syntese og karakterisering af negativt ladede poly (akryl) syre nanoceria (PNC), 2) for levering og sporing af PNC hele blad celler, og 3) overvågningen af PNC-aktiveret ROS skylleluften i vivo. I denne protokol, er negativt ladede poly (akryl) syre nanoceria (PNC) syntetiseret og karakteriseret ved deres absorptionsspektrum, hydrodynamiske diameter og zeta potentiale. Vi beskriver et simpelt blad lamina infiltration metode til at levere PNC til plante blad væv. For i vivo billeddannelse af nanopartikel fordeling inden for mesofyllet celler, blev et fluorescerende farvestof (DiI) brugt til at mærke PNC (DiI-PNC) og observere nanopartikler via Konfokal Fluorescens mikroskopi. Endelig, vi forklare hvordan man kan overvåge i vivo PNC ROS scavenging gennem Konfokal mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voksende A. thaliana planter

  1. Soen A. thaliana frø i 5 cm x 5 cm engangs Potter fyldt med standard jord blanding. Sætte 32 af disse Potter i en plastik bakke fyldt med vand (~ 0,5 cm dybde) og overføre den plast bakke med planterne ind i en plante vækst kammer.
    1. Indstille væksten kammer indstillinger som følger: 200 µmol/ms fotosyntetiske aktive stråling (PARI), 24 ± 1 ° C dag og 21 ± 1 ° C natten, 60% fugtighed og 14/10 h dag/nat lys regime, henholdsvis.
  2. Tynde hver pot til at forlade kun én enkelt plante efter en uge efter spiring. Holde kommentar at holde planter med samme størrelse i hver potte.
  3. Vand potterne ved at hælde vand fra hanen direkte på plast bakken en gang hver to dage. Dyrke planterne i fire uger. A. thaliana planterne er klar til yderligere brug.

2. syntese og karakterisering af PNC

  1. 1.08 g af cerium (III) nitrat afvejes og opløses det i 2,5 mL vand af Molekylærbiologisk Institut i en 50 mL konisk slange.
  2. 4,5 g af poly (akryl) syre afvejes og opløses i 5 mL vand af Molekylærbiologisk Institut i en 50 mL konisk slange.
  3. Bland disse to løsninger grundigt på 2.000 omdr. / min. i 15 min. ved hjælp af en digital vortex-mixer.
  4. Overføre 15 mL af ammoniumhydroxid løsning (7,2 M) til en 50 mL glas bægerglas.
  5. Under omrøring på 500 rpm, tilføje blandingen fra trin 2.3 dråbevis til opløsningen ammoniumhydroxid og omrøres ved 500 rpm ved stuetemperatur i 24 timer i et stinkskab.
  6. Bægerglasset dækkes med et stykke papir til at undgå betydelige tab af løsning i løbet af natten reaktion.
  7. Efter 24 h, den resulterende opløsning overføres til en 50 mL konisk slange og centrifugeres ved 3.900 x g i 1 h til at fjerne ethvert muligt snavs og store vandbad.
  8. Overføre denne 22,5 mL af supernatanten løsning til tre 15 mL 10 kDa filtre og fylde den resterende del af filteret med vand af Molekylær renhed til at gøre en total udvanding af 45 mL.
  9. Rense supernatanten løsningen fra gratis polymerer og andre reagenser med en benchtop centrifugeres ved at tilføje supernatanten til en 15 mL 10 kDa filter og centrifugeres ved 3.900 x g i 15 min. Gentag trinnet mindst seks gange.
  10. Absorbansen af elueringsvæsken i hver cyklus med et UV-VIS Spektrofotometer fra 220-700 nm at sikre ingen gratis polymerer og andre reagenser er til stede i den endelige PNC løsning.
  11. De indsamlede PNC løsning der tages 5 mL sprøjte og filtrere det mod en 20 nm pore størrelse sprøjte filter. Indsamle de filtrerede PNC løsning i en 50 mL konisk slange.
  12. Tage et fortyndet endelige PNC løsning i en plastik kuvette og måle sin absorbans med UV-VIS spektrometeret fra 220-700 nm. PNC absorbans peak er på 271 nm.
  13. Beregne koncentrationen ved hjælp af øl-Lamberts lov: A = εCL. A er absorbansen af spidsværdien for en given prøve, ɛ er molær absorptionskoefficienten på PNC (cm-1 M-1), L er lysvej (kuvette bredde, 1 cm i denne metode), og C er den molære koncentration af målte nanopartikler.
  14. Måle den hydrodynamiske diameter og zeta potentiale af den syntetiserede PNC ved hjælp af en partikel størrelse og zeta potentielle analyzer (figur 1).
  15. Gemme den endelige PNC løsning i køleskab (4 ° C) indtil videre anvendelse.
    Bemærk: Der henvises til Wu mfl. 8 protokollen nærmere om PNC karakterisering.

3. mærkning PNC med DiI fluorescerende farvestof

  1. Bland 0,4 mL af 5 mM (58 mg/L) PNC med 3,6 mL af molekylær biologi klasse vand i en 20 mL hætteglas og rør ved 500 rpm.
  2. Tilføje 24 µL 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat farvestof løsning (DiI, 2,5 mg/mL, fortyndet i DMSO) i 176 µL af DMSO (dimethylsulfoxid) at gøre DiI farvestof løsning.
  3. Tilføje DiI farvestof dråbevis til opløsningen PNC, omrøring ved 1000 rpm i 1 minut ved stuetemperatur.
  4. Overføre denne resulterende blandingen i en 15 mL 10 kDa filter og fyld glasset til toppen med molekylær biologi klasse vand at gøre den samlede fortynding 15 mL.
  5. Rense DiI mærket PNC (DiI-PNC) løsning fra DMSO og ethvert muligt gratis DiI farvestof ved en benchtop centrifugering med 15 mL 10 kDa filter på 3.900 x g i 5 min.
    1. Gentag trin 3.5 mindst fem gange.
  6. Filtrere de endelige DiI-PNC løsninger gennem en 20 nm pore størrelse sprøjte filter.
  7. Absorbansen af endelige DiI-PNC af UV-VIS spektrofotometri og beregne sin koncentration i henhold til øl-Lamberts lov (figur 2). Se trin 2.13 for flere detaljer.
  8. Opbevar det i køleskab ved 4 ° C for yderligere brug.

4. infiltration af plante blade med PNC

  1. Der tilsættes 0,1 mL af infiltration buffer (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7,5, justeret med HCl) til 0,9 mL 0,5 mM PNC eller DiI-PNC løsning og vortex det. Brug en opløsning af 10 mM TES infiltration buffer som en negativ kontrol.
  2. Overføre 0,2 mL af PNC eller DiI-PNC infiltration opløsningen til en 1 mL sterilt needleless sprøjte. Tryk for at fjerne enhver mulig luftbobler.
  3. Hente anlægget fra vækst kammeret lige før infiltration med nanopartikler til at undgå mulige spalteåbninger lukning under værelse lysforhold.
  4. Før infiltration, måle klorofyl indholdet fra A. thaliana blade med samme størrelse ved hjælp af en klorofyl meter. Måle hvert blad med tre flergangsbestemmelser (hver replikat bestående af mindst tre målinger)14. Vælg A. thaliana blade med lignende indhold af klorofyl for infiltration eksperiment.
  5. Infiltrere bladene langsomt med den seneste rede PNC eller DiI-PNC løsning ved forsigtigt at trykke spidsen af den needleless sprøjte mod bunden af blad lamina (abaxial side) og presse stemplet (fig. 3A).
  6. Forsigtigt tørre den overskydende løsning, som forbliver på overfladen af blad lamina (fig. 3B) ved hjælp af en delikat opgave visker (figur 3C) og etiket anlægget. Bruge nye fine opgave klude for hver gruppe af blade.
  7. Holde det infiltreret A. thaliana planter på bænken til blad tilpasning og inkubering med PNC eller DiI-PNC til 3 h.
    Bemærk: Infiltreret A. thaliana planter er derefter klar til yderligere brug (figur 3D).

5. forberedelse af blad prøver for konfokalmikroskopi

  1. Kast en ært-størrelse mængden af observation gel til omkring en 1 cm radius (figur 4A) og derefter sprede det, indtil det er 1 mm tynde på et glas dias (fig. 4B).
  2. Bruge en cork soegeren (diameter 0,3 cm) til at skære en cirkulær sektion på center for observation gel på glas dias (fig. 4C).
  3. Fyld cut godt helt med perfluorodecalin (PFD) for dybere og bedre Konfokal billedbehandling løsning i blad væv.
  4. Bruge en cork soegeren (diameter 0,2 cm) til at indsamle blad diske fra den tilpasset DiI-PNC infiltreret A. thaliana planter (figur 4D).
  5. Montere blad disken i PFD fyldt godt; opad det infiltreret (abaxial) side af bladet.
  6. Sætte en firkantet coverslip på toppen af blad-disk og tryk forsigtigt på slide coverslip jævnt at forsegle det med godt observation gel og sikre, at ingen luftbobler blive fanget (figur 4E).

6. imaging DiI-PNC i blad væv af konfokalmikroskopi

  1. Bruge en 40 X mål linse i en inverteret laser scanning Konfokal mikroskop.
  2. Drop to til tre dråber af Hedeselskabet2O øverst på 40 X mål linsen.
  3. Placer den forberedte DiI-PNC infiltreret blad eksempeldias oven på de inverterede 40 X objektive linse.
    1. Kontroller, at coverslip siden, men ikke glasset skub kontakt direkte med ddH2O på objektivet.
  4. Find en region af interesse i prøven under mikroskop med enten laser lys eller lysfelt.
  5. Start programmet mikroskop og tænd Argon laser (sat til 20%).
  6. Indstille pinhole at indsamle en optisk skive mindre end 2 µm og en linje gennemsnittet af 4.
  7. Image prøve med Konfokal mikroskop indstillinger: 514 nm laser excitation (30%); Z-stakken snittykkelse: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (for DiI-PNC imaging); PMT2: 700-800 nm (for grønkorn imaging).
  8. Tage repræsentative Konfokal billeder af blad prøver fra forskellige individer, et minimum af tre biologiske replikater.

7. imaging PNC i vivo ROS Scavenging af konfokalmikroskopi

  1. Forberede 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA, et farvestof der angiver en generel ROS) og 10 µM dihydroethidium (DHE, et farvestof der angiver superoxid-anion) farvestoffer i TES infiltration buffer (pH 7,5) i 1,5 mL microcentrifuge rør, separat.
  2. Bruge en cork soegeren (diameter 0,2 cm) til at indsamle blad diske fra den tilpasset PNC infiltreret A. thaliana planter.
    1. Bruge den skarpe spids af pincet til at gøre tre til fire huller på blad diske til at fremskynde farvestof loading processen.
  3. Overførsel bladet diske til microcentrifuge rør med H2DCFDA og DHE separat og Inkuber i 30 min. i mørke.
  4. Efter inkubationen skyl bladet diske med ddH2O tre gange og montere den i glasset glider med observation gel (se protokollen afsnit 5).
  5. Sætte diaset på Konfokal mikroskop og manuelt fokus til en region af blad mesofyllet celler. Se protokollen afsnit 6 for detaljer.
  6. Udsætte blad diske til UV-A (405 nm) laser for 3 min til at generere ROS og registrere ROS signal intensitet ændringen i tid-serie ("xyt") pr. blad disc.
  7. Billede bladet disken med Konfokal mikroskop indstillinger: 40 X vand mål; 496 nm laser magnetisering; PMT1: 500-600 nm (til DHE og DCFDA dye påvisning); PMT2: 700-800 nm (for grønkorn detektion). Bruge en plante infiltreret med kun infiltration stødpudeopløsning som den negative kontrol.

8. PNC Scavenging af H2O2in vitro

  1. Gennemføre den kat (katalase) mimetiske aktivitet i syntetiserede PNC vitro ved at følge metoderne i tidligere publikationer3,8,15
  2. Tilføje 45,4 µL af 1 x TES infiltration buffer (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7,5, justeret med HCl), PNC (60 nM, 3 µL), og H2O2 (2 µM, 1 µL) i en brønd (hvid rund bund 96 godt plade), og bland det forsigtigt af pipettering.
  3. Tilføje 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (arbejdende koncentration 100 µM, 0,5 µL) og peberrodsperoxidase (HRP; arbejder koncentration 0,2 U/mL, 0,1 µL) i brønden, forsigtigt blandes det af pipettering, og der inkuberes i 30 min. 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine reagerer med H2O2 og omdannes til resorufin i HRP.
    1. Wrap plade med alufolie at undgå lys under inkubation.
    2. Forberede en negativ kontrol ved hjælp af reaktion buffer eller vand til at erstatte H2O2.
    3. Med undtagelse af stamopløsningen, forberede alle andre løsninger ved omgivelsestemperatur.
  4. Efter inkubering med en Pladelæser, overvåge absorbans på 560 nm bruge resorufin der angiver niveauet af H2O2. Sæt tid regime på 0, 2, 5, 10, 20 og 30 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PNC syntese og karakterisering .
PNC blev syntetiseret, renset og karakteriseret følgende metoden beskrevet i protokollen afsnit 2. Figur 1 A viser farvning af løsninger af cerium nitrat, PAA, blandingen af cerium nitrat og PAA og PNC. Et farveskift fra hvid til lys gul er set efter PNC er syntetiseret. Efter rensning med en 10 kDa filter, PNC blev præget med en UV-VIS Spektrofotometer. Et højdepunkt af absorbansen for PNC blev observeret på 271 nm (figur 1B). Den endelige elueringsvæsken blev også målt med UV-VIS at bekræfte, at de ikke reagerede kemikalier blev vasket under rensning. Den hydrodynamiske diameter og zeta potentiale af den syntetiserede PNC blev målt med en partikel sizer og zeta potentielle analyzer (figur 1C).

PNC mærkning med DiI farvestof .
For at fastlægge fordelingen af nanopartikler i vivo, PNC var mærket med en fluorescerende DiI farvestof følge metoden beskrevet i protokollen afsnit 3. DiI farvestof integrerer inden for PNC belægning spontant, da det kan indkapsle i de hydrofobe domæner inde polymer belægninger af nanoceria16. Efter tilføjer DiI farvestof til PNC løsning, en hurtig farve skift til pink blev observeret (fig. 2A). DiI mærket PNC blev så renset med 10 kDa filter og præget af en UV-VIS spektrofotometri. Tre klare toppene af absorbansen for DiI mærket PNC blev observeret (figur 2B). Den endelige elueringsvæsken blev målt ved UV-VIS spektrofotometri at bekræfte, at de ikke reagerede kemikalier blev vasket under rensning.

Leaf Lamina infiltration.
PNC eller DiI-PNC blev leveret i A. thaliana blad via blad lamina infiltration metode som beskrevet i protokollen afsnit 4. Blad var infiltreret på fire forskellige steder at sikre området fuld blad var perfunderet med PNC løsning (fig. 3A). Eventuelle resterende løsning blev fjernet fra bladets overflade (fig. 3B og 3 C). Blade farve ændres under infiltration fra grøn til mørkere grøn (figur 3D). Sprøjten blev forsigtigt trykket mod bladet at undgå fysiske skader.

Leaf prøveforberedelse til fluorescens mikroskopi.
Blad prøver blev monteret på glas dias i en observation gel lavet godt fyldt med PFD. Efter valsningen ært størrelse observation gel på diaset (figur 4A og 4B), foregik en brønd i midten af den flade gel (fig. 4C). Derefter, frisklavede blad disken blev overført til brønden tidligere fyldt med PFD løsning (figur 4D). En coverslip blev brugt til at immobilisere blad prøven på diaset (figur 4E).

Konfokal billeddannelse af DiI-PNC in vivo .
DiI-PNC infiltreret A. thaliana bladene blev brugt til at bestemme fordelingen af DiI-PNC i blad mesofyllet celler via Konfokal imaging (figur 5A og 5B). For at visualisere colocalization mellem DiI-PNC og kloroplaster, var DiI-PNC infiltreret blad prøver begejstrede med en 514 nm laser. Emission af DiI-PNC blev sat på 550-615 nm til at undgå den mulige indblanding fra grønkorn pigmenter signaler efter ~ 650 nm17. Klorofyl auto-fluorescens fra grønkorn blev opdaget fra 700-800 nm. Konfokal billeddiagnostiske indstillingerne blev sat (laser magt og vinding) for at sikre ingen DiI farvestof signaler blev opdaget i blad kontrolprøve (infiltreret med kun buffer) (figur 5C). Colocalization af DiI-PNC med grønkorn i blad mesofyllet celler kan overholdes af overlay billed af detekterede DiI-PNC og grønkorn pigment autofluorescence (fig. 5D).

Konfokal billeddannelse af PNC ROS scavenging i vivo .
PNC i 10 mM TES stødpudeopløsning blev leveret til A. thaliana blade via blad lamina infiltration metode som beskrevet i protokollen afsnit 7. DHE (dihydroethidium) og H2DCFDA (2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetat) fluorescerende farvestoffer anvendes til at visualisere ROS i anlægget væv8,18. H2DCFDA er kendt skal konverteres til fluorescerende DCF (2′, 7 '-dichlorofluorescein, en indikator for graden af generelle oxidativt stress) på grund af kløvningen af acetat grupper af ROS19. DHE er en mere specifik farvestof til superoxid anion at have sin fluorescerende produkt (2-hydroxyethidium) øge ved reaktion med en superoxid anion20. In vivo ROS scavenging aktiveret af PNC blev overvåget i blad diske måling DHE og DCF farvestof fluorescens intensitet ændringer (tal 6A og 6B). PNC infiltreret blad prøver var begejstrede med 496 nm laser. Emission af DHE og DCF dye blev fastsat til 500-600 nm til at undgå den mulige indblanding med grønkorn auto-fluorescens signaler. Pigment auto-fluorescens fra grønkorn blev opdaget fra 700-800 nm. Efter 3 minutter af UV understrege, signaler ROS farvestof i PNC og buffer-infiltreret blad prøver blev overvåget separat. I forhold til kontrolelementet no-nanopartikel buffer (Birgits), PNC infiltreret blade viste betydeligt mindre ROS-aktiveret fluorescerende DCF farvestof signal (figur 6A). Lignende resultater blev også fundet med superoxid anion-aktiveret DHE farvestof, hvor PNC infiltreret blade havde betydeligt mindre DHE farvestof intensitet end buffer infiltreret kontrol blade (fig. 6B).

PNC kat mimetiske aktivitet assay . Analysen af PNC scavenging H2O2 blev beskrevet i protokollen afsnit 8. Et fald i resorufin, som angiver H2O2 niveau i reaktionsblandingen indeholdende PNC blev observeret (figur 7), bekræfter den kat mimetiske aktivitet af den syntetiserede PNC.

Figure 1
Figur 1 : Syntese og karakterisering af PNC. A. farvning af cerium nitrat, poly akrylsyre (PAA), blanding af cerium nitrat og PAA, og den syntetiserede PNC (PAA belagt cerium oxid nanopartikler, lys gul). B. absorbans spektrum af PNC målt ved UV-VIS spektrofotometri. C. hydrodynamiske diameter og zeta potentiale i den syntetiserede PNC. Betyde ± standardafvigelse (n = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : PNC mærkning med DiI fluorescerende farvestof. A. PNC (lysegul) og DiI farvestof mærket PNC løsning (DiI-PNC, pink). B. absorbans spektrum af DiI-PNC løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Blad lamina infiltration af PNC eller DiI-PNC. A. A. thaliana blad før infiltration. Løsning inde i sprøjten er DiI-PNC. B. blad infiltreret med DiI-PNC. C. rengøring den resterende løsning fra bladets overflade med delikat opgave tørrer. D. renset A. thaliana blad infiltreret med DiI-PNC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Forberedelse af blad prøve dias. A. mikroskopi glas dias med ært størrelse observation geler. B. dias med flad observation geler. C. Skub med flad observation gel har en brønd på midten. D. Skub med blad diske i observation gel godt fyldt med perfluorodecalin (PFD) løsning. E. dias med blad diske immobiliserede af cover slip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Imaging DiI-PNC i blad mesofyllet celler via konfokalmikroskopi. A. blad prøven er monteret på en inverteret Konfokal mikroskop har en 40 X vand fordybelse linse. B. en Konfokal mikroskop bruges til imaging DiI-PNC og grønkorn. C. grønkorn auto-Fluorescens er indspillet i buffer infiltreret blad prøver uden nanopartikler (Birgits). D. DiI-PNC signal og grønkorn auto-Fluorescens er afbildet i DiI-PNC infiltreret blad prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Overvågning PNC ROS skylleluften i planta via konfokalmikroskopi. A. DCF fluorescerende farvestof (for overvågning generelle ROS signal) er betydeligt lavere i mesofyllet celler af PNC infiltreret planter end buffer kontrol (ingen nanopartikler, Birgits). B. reduceret DHE fluorescerende farvestof (for overvågning superoxid-anion) i mesofyllet celler af PNC infiltreret planter i forhold til buffer kontrol (Birgits). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Katalase (kat) mimetiske aktivitet af PNC. Idet peberrodsperoxidase fluorescerende sonden reagerer med brintoverilte og er konverteret til resorufin (absorbans 560 nm). Absorbansen af resorufin, som er vejledende for brintoverilte niveauer, blev overvåget på 560 nm. PNC viste en kat mimetiske aktivitet. Betyde ± SE (standardfejl) (n = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol beskriver vi PNC syntese, karakterisering, fluorescerende farvestof mærkning og konfokal billeddannelse af nanopartikler i mesofyllet planteceller til at udstille deres i vivo ROS skylleluften aktivitet. PNC er syntetiseret fra en blanding af cerium nitrat og PAA løsning i ammoniumhydroxid. PNC er karakteriseret ved absorption spectrophotomery og koncentrationen bestemmes ved hjælp af øl-Lamberts lov. Zeta potentielle målinger bekræftet PNC negativt ladede overflade for at øge levering til grønkorn8. Mærkning af PNC med en fluorescerende DiI farvestof giver i vivo billeddannelse af Konfokal mikroskopi inden for blad mesofyllet celler hvor nanopartikler viser høje niveauer af colocalization med grønkorn. Ved hjælp af DHE og DCF fluorescerende farvestoffer, bekræftet vi at PNC act som en potent ådselsæder af superoxid-anion og ROS i vivo.

Metoden til syntese PNC er en enkel trinvis procedure, der genererer cerium oxid nanopartikler med kontrolleret størrelse, negativ ladning, og ROS scavenging kapaciteter16. Andre metoder, såsom termisk hydrolyse, kræver høje temperaturer og dyre kemi udstyr21,22. Syntese og karakterisering af PNC er en billig metode udføres med fælles laboratorieudstyr. Det kræver ikke en stejl indlæringskurve sammenlignet med molekylære metoder i anlæg baseret på overekspression af en antioxidant enzym, fx, SOD, APXog kat, for scavenging ROS arter i model systemer23. PNC er en robust, vandopløselige ROS katalytisk ådselsæder der ikke kræver besværlige kloning og transformation metoder, der er afhængige af plantens genetiske sporbarhed og tilgængelige Molekylær toolkit.

Et afgørende skridt i denne protokol er sprøjte-baserede infiltration af blad mesofyllet celler med PNC. Infiltration af nanopartikler i levende planter skal gøres forsigtigt for at undgå fysisk beskadigelse blad24. Således som i protokollen trin 4 af metoderne, skub forsigtigt mod bladets overflade med sprøjten at undgå rive eller punktering abaxial bladets overflade. Det er bedre at infiltrere fra abaxial overflade, A. thaliana blad, da det har højere spalteåbningernes densitet end adaxial overflade25,26. Derudover en bufferopløsning PNC eller DiI-PNC inden fysiologisk pH (~ pH 7,5) bør anvendes under blad lamina infiltration. En anden afgørende skridt i denne protokol er at anvende den passende koncentration af PNC til de studerede plantevæv. I denne protokol var 50 mg/L af PNC ikke giftigt for A. thaliana blade ved aktivering af katalytisk PNC ROS scavenging. Nogle begrænsninger i den nuværende nanopartikel leveringsmetode gælder 1) ikke at plante arter har tykke og voksagtig neglebånd eller lav spalteåbningernes tætheder, 2) ikke skalerbar til applikationer i feltet, 3) de høje udgifter til en Konfokal mikroskopi system til at overvåge i vivo nanopartikel distribution og ROS scavenging.

Denne protokol viser anvendelsen af ROS scavenging PNC for at studere og forbedre abiotisk stresstolerance i planter gennem en letkøbt metode til blad lamina infiltration. ROS ophobning er ledsaget af abiotiske understreger i planter, som til gengæld reducerer plante fotosyntese, vækst og udbytte8,27,28. Plante genetiske modifikationer metoder for ROS manipulation i vivo er ofte begrænset til model plantearter, mens PNC ROS-scavenging har potentiale til at blive anvendt til forskellige vildtype plantearter. Leaf lamina infiltration er en praktisk Forskningsmetode til at øge ROS Gaderenovation i blad væv til at forstå og engineering plant abiotisk stresstolerance.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af University of California, Riverside og USDA National Institute for fødevarer og landbrug, Hatch projektet 1009710 til J.P.G. Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Grant nr. 1817363 til J.P.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cerium (III) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 238538-100G
Molecular Biology Grade Water, Corning VWR 45001-044 
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes VWR 14-959-49A
Poly (acrylic acid) 1,800 Mw Sigma-Aldrich 323667-100G
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-370
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer Fisher Scientific 02-215-391
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set Fisher Scientific 02-215-395
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 05002-1L
PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning VWR 13912-149 
RCT basic IKA 3810001
Eppendorf Microcentrifuge 5424 VWR 80094-126
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore-Sigma UFC901024
Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge Beckman Coulter B06314
UV-2600 Sptecrophotometer Shimadzu UV-2600 120V
Whatman Anotop 10 syringe filter Sigma-Aldrich WHA68091102
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-829-45
Zetasizer Nano S Malvern Panalytical Zen 1600
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma-Aldrich 42364-100MG
Dimethyl Sulfoxide, ACS VWR BDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1 Green Island Distributors, Inc 5212601.CFL080P
Adaptis 1000 Conviron A1000
TES, >99% (titration Sigma-Aldrich T1375-100G
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266-1KG
Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe Fisher Scientific 14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Carolina Observation Gel Carolina 132700
Corning microscope slides, frosted one side, one end Sigma-Aldrich CLS294875X25-72EA
Cork Borer Sets with Handles Fisher Scientific S50166A
Perfluorodecalin Sigma-Aldrich P9900-25G
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-045
Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 Leica Microsystems TCS SP5
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma-Aldrich D6883-250MG
Dihydroethidium Sigma-Aldrich D7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Eppendorf Uvette cuvettes Sigma-Aldrich Z605050-80EA
Chlorophyll meter  Konica Minolta SPAD-502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
  2. Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
  3. Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
  4. Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
  5. Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
  6. Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
  7. Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
  8. Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
  9. Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
  10. Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
  11. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
  12. Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
  13. Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
  14. Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
  15. Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
  16. Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
  17. Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
  18. Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
  19. Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
  20. Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
  21. Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
  22. Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
  23. Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
  24. Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
  25. Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
  26. Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
  27. Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
  28. Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 138 abiotiske stress nanoceria Konfokal imaging leaf lamina infiltration plante ROS scavenging
Katalytisk Scavenging plante reaktive ilt arter <em>In Vivo</em> af anioniske Cerium oxid nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newkirk, G. M., Wu, H., Santana, I., … More

Newkirk, G. M., Wu, H., Santana, I., Giraldo, J. P. Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (138), e58373, doi:10.3791/58373 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter