Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nettoyage catalytique de plante oxygénées espèces In Vivo par des nanoparticules d’oxyde de cérium anioniques

Published: August 26, 2018 doi: 10.3791/58373
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la synthèse et la caractérisation des nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) BR (espèces réactives de l’oxygène) nettoyage en vivo, nanoceria d’imagerie dans les tissus végétaux par microscopie confocale et in vivo surveillance de nanoceria ROS lessivage par microscopie confocale.

Abstract

Accumulation de réactives de l’oxygène (DRO) est une caractéristique de la réponse des plantes aux stress abiotiques. ROS jouer un double rôle chez les plantes en agissant comme des molécules à de faibles niveaux de signalisation et d’endommager les molécules à des niveaux élevés. Accumulation de ROS dans les plantes stressées peut endommager les métabolites, enzymes, les lipides et l’ADN, provoquant une diminution de la croissance des plantes et des rendements. La capacité des nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) pour piéger catalytiquement ROS en vivo fournit un outil unique pour comprendre et la tolérance au stress abiotique bioingénieur plante. Nous présentons ici un protocole pour synthétiser et caractériser les nanoceria enduit acide poly (acrylique) (PNC), interface des nanoparticules avec plantes par infiltration du limbe foliaire et surveiller leur distribution et ROS nettoyage in vivo à l’aide de confocal microscopie. Cours outils moléculaires pour manipuler les accumulation de ROS dans les plantes se limitent aux espèces modèles et nécessitent des méthodes de transformation laborieuse. Ce protocole pour in vivo ROS nettoyage a le potentiel pour être appliquée aux plantes de type sauvage avec des feuilles larges et structure de la feuille comme thaliana d’Arabidopsis.

Introduction

Nanoparticules d’oxyde de cérium (nanoceria) sont largement utilisés dans les organismes vivants, de la recherche fondamentale à la bio-ingénierie, en raison de leurs espèces distinctes catalytique réactives de l’oxygène (ROS) nettoyage capacité1,2,3. Nanoceria ai ROS nettoyage capacités en raison d’un grand nombre de places de surface d’oxygène qui alternent entre deux oxydation États (Ce3 + et Ce4 +) 4,5,6. Ce3 + ballants obligations piéger efficacement ROS, tandis que les souches de réseau à l’échelle nanométrique favoriser la régénération de ces sites de défaut via redox réactions7de cyclisme. Nanoceria ont également été récemment utilisé pour l’étude et ingénierie végétale fonction8,9. Plantes sous stress abiotique expérience accumulation de ROS, causant des dommages oxydatifs à lipides, protéines et ADN10. Chez les plantes Arabidopsis , nanoceria nettoyage catalytique des ROS dans vivo mène à la photosynthèse végétale améliorée sous forte luminosité, chaleur et froid souligne8. L’application nanoceria dans le sol aussi augmentations shoot de rendement biomasse et grain de blé (Triticum aestivum)11; des plants de canola (Brassica napus) traités par nanoceria ont une plus grande biomasse de plantes sous stress salin,12.

Nanoceria offrent des bioingénieurs et planter des biologistes un outil basés sur la nanotechnologie afin de comprendre les réactions au stress abiotique et améliorer la tolérance au stress abiotique plante. En vivo ROS nettoyage capacités de Nanoceria est indépendants des espèces de plantes, et la livraison facile dans les tissus de la plante a le potentiel pour permettre à une application générale en dehors des organismes modèles. Contrairement aux autres méthodes génétiquement, nanoceria ne nécessitent pas de générer les lignes de la plante avec la surexpression des enzymes antioxydantes supérieures br nettoyage capacité13. Infiltration de limbe foliaire de nanoceria aux plantes est une approche pratique pour la recherche en laboratoire.

L’objectif général du présent protocole est de décrire 1) la synthèse et la caractérisation de poly chargée négativement (acrylique) acide nanoceria (PNC), 2) la livraison et la suivi des PNC dans les cellules de la feuille et 3) le contrôle de PNC-activé ROS nettoyage en vivo. Dans ce protocole, poly chargée négativement (acrylique) acide nanoceria (PNC) sont synthétisés et caractérisés par leur spectre d’absorption, diamètre hydrodynamique et potentiel zêta. Nous décrivons une méthode d’infiltration lamina feuille simple pour livrer des PNC en usine de tissus foliaires. En vivo imagerie des nanoparticules de distribution dans les cellules du mésophylle, un colorant fluorescent (DiI) a été utilisé pour étiqueter les PNC (DiI-PNC) et observer les nanoparticules par microscopie confocal fluorescence. Enfin, nous expliquons comment surveiller en vivo PNC ROS fouillant dans la microscopie confocale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. la culture de plantes a. thaliana

  1. Semer les graines d’Arabidopsis en pots jetables de 5 cm x 5 cm remplis de mélange de terre standard. Mettre 32 de ces pots dans un bac en plastique rempli d’eau (~ 0,5 cm de profondeur) et transférer le plateau en plastique avec les plantes dans une chambre de croissance des plantes.
    1. Régler la croissance chambre comme suit : 200 µmol/ms photosynthétique active radiation (PAR), 24 ± 1 ° C jour et 21 ± 1 ° C la nuit, 60 % d’humidité et régime de lumière jour/nuit 14/10 h, respectivement.
  2. Mince de chaque pot pour laisser seule plante individuelle après une semaine de la germination. Prenez note de garder les plants ayant les mêmes taille dans chaque pot.
  3. Les pots d’eau de couler l’eau du robinet directement sur le plateau en plastique tous les deux jours. Cultiver les plantes pendant quatre semaines. A. thaliana plantes sont prêts pour une utilisation ultérieure.

2. synthèse et caractérisation de PNC

  1. Environ 1,08 g de nitrate de cérium (III) et dissoudre dans 2,5 mL d’eau de qualité biologie moléculaire dans un tube conique de 50 mL.
  2. Environ 4,5 g d’acide poly (acrylique) et dissoudre dans 5 mL d’eau de qualité biologie moléculaire dans un tube conique de 50 mL.
  3. Mélanger ces deux solutions soigneusement à 2 000 tr/min pendant 15 min à l’aide d’un mélangeur vortex numérique.
  4. Transfert de 15 mL de solution d’hydroxyde d’ammonium (7,2 M) dans un bécher de verre de 50 mL.
  5. Tout en remuant à 500 tr/min, ajouter le mélange de l’étape 2.3 goutte à goutte la solution d’hydroxyde d’ammonium et remuez à 500 tr/min à température ambiante pendant 24 heures dans une hotte de laboratoire.
  6. Couvrir le bécher avec un morceau de papier afin d’éviter la perte importante de la solution lors de la réaction pendant la nuit.
  7. Après 24h, transvaser la solution obtenue dans un tube conique de 50 mL et il centrifuger à 3 900 g pendant 1 h enlever tout débris possible et gros agglomérats.
  8. Transférer cette 22,5 mL de la solution surnageante dans trois filtres de 15 mL 10 kDa et remplir le reste du filtre avec l’eau de qualité moléculaire pour réaliser une dilution totale de 45 mL.
  9. Purifier la solution surnageante de polymères libres et autres réactifs avec une centrifugeuse de paillasse en ajoutant le surnageant dans un filtre de 15 mL 10 kDa et centrifuger à 3 900 x g pendant 15 min. Répétez cette étape au moins six fois.
  10. Mesurer l’absorbance de l’éluant à chaque cycle avec un spectrophotomètre UV-VIS de 220 à 700 nm pour n’assurer aucun libres polymères et autres réactifs sont présents dans la solution finale de la PNC.
  11. Tenir la seringue de 5 mL de la solution PNC recueillie et filtrez-le contre un filtre de seringue de taille de pore nm 20. Recueillir la solution filtrée de la PNC dans un tube conique de 50 mL.
  12. Prenez une solution diluée de PNC finale dans une cuvette en plastique et mesurer l’absorbance avec le spectrophotomètre UV-VIS de 220 à 700 nm. PIC d’absorbance PNC est à 271 nm.
  13. Calculer la concentration en utilisant la Loi de Beer-Lambert : A = εCL. A est l’absorbance de la valeur de crête pour un échantillon donné, ɛ est le coefficient d’absorption molaire du PNC (cm-1 M-1), L est la longueur du trajet optique (largeur de la cuvette, 1 cm de cette méthode), et C est la concentration molaire de nanoparticules mesurées.
  14. Mesurer le diamètre hydrodynamique et le potentiel zêta de la PNC synthétisée à l’aide d’un analyseur potentiel particules taille et zeta (Figure 1).
  15. Conserver la solution finale de la PNC dans un réfrigérateur (4 ° C) jusqu'à l’utilisation ultérieure.
    Remarque : Veuillez vous référer à Wu et al. 8 pour plus de détails sur la caractérisation de la PNC protocole.

3. étiquetage des PNC par DiI agent Fluorescent

  1. Mélanger 0,4 mL de 5 mM (58 mg/L) PNC avec 3,6 mL de biologie moléculaire, l’eau de qualité dans un flacon de verre de 20 mL et remuez à 500 tr/min.
  2. Ajouter 24 µL 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tétraméthylindocarbocyanine solution de colorant perchlorate (DiI, 2,5 mg/mL ; diluées dans le DMSO) dans 176 µL de DMSO (diméthyl sulfoxyde) de faire la solution de colorant DiI.
  3. Ajouter le colorant DiI goutte à la solution de la PNC, en remuant à 1 000 tr/min pendant 1 min à température ambiante.
  4. Transférer ce mélange qui en résulte dans un filtre de 15 mL 10 kDa et de remplir le tube vers le haut avec l’eau de qualité biologie moléculaire pour réaliser la dilution au totale 15 mL.
  5. Purifier le DiI étiqueté solution PNC (DiI-PNC) de DMSO et n’importe quel colorant de DiI libre possible par une centrifugation de benchtop avec le filtre de kDa 15 mL 10 à 3 900 x g pendant 5 min.
    1. Répétez l’étape 3.5 au moins cinq fois.
  6. Les solutions de DiI-PNC finales filtrer sur un filtre de seringue de taille de pore nm 20.
  7. Mesurer l’absorbance de final DiI-PNC par spectrophotométrie UV-visible et calculer sa concentration selon la Loi de Beer-Lambert (Figure 2). Pour plus de détails, voir étape 2.13.
  8. Conserver au réfrigérateur à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.

4. infiltration d’usine de feuilles avec des PNC

  1. Ajouter 0,1 mL d’infiltration tampon (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, ajusté par HCl) dans 0,9 mL de solution PNC ou DiI-PNC de 0,5 mM et vortex il. Utilisez une solution de tampon de l’infiltration de TES 10 mM comme témoin négatif.
  2. Transférer 0,2 mL de la solution d’infiltration PNC ou DiI-PNC à une seringue sans aiguille stérile de 1 mL. Robinet pour enlever les bulles d’air possible.
  3. Récupérer l’usine de la chambre de croissance juste avant infiltration avec des nanoparticules pour éviter la fermeture des stomates possible en conditions de luminosité ambiante.
  4. Avant infiltration, mesurer la teneur en chlorophylle des feuilles d’a. thaliana avec une taille similaire à l’aide d’un compteur de chlorophylle. Mesurer chaque feuille avec trois répétitions (chaque réplicat composé d’au moins trois mesures)14. Choisissez que l' Arabidopsis quitte avec la teneur en chlorophylle similaire pour l’expérience de l’infiltration.
  5. Infiltrez les feuilles lentement avec la solution récemment préparée de PNC ou DiI-PNC en appuyant doucement sur l’embout de la seringue sans aiguille contre la partie inférieure du limbe foliaire (côté abaxial) et appuyer sur le poussoir (Figure 3A).
  6. Doucement essuyer l’excédent de solution qui reste sur la surface du limbe de la feuille (Figure 3B) à l’aide d’un essuie-glace de tâche délicate (Figure 3C) et l’étiquette de la plante. Utiliser nouvelle tâche délicate lingettes pour chaque groupe de feuilles.
  7. Gardez les infiltrés a. thaliana plantes sur le banc pour adaptation de feuilles et d’incubation avec le PNC ou DiI-PNC pendant 3 h.
    NOTE : Infiltrés a. thaliana plantes sont alors prêts pour une utilisation ultérieure (Figure 3D).

5. préparation des échantillons de feuilles pour la microscopie confocale

  1. Rouler une quantité de la grosseur d’un pois de l’observation de gel à un rayon de 1 cm (Figure 4A) et puis l’étaler jusqu'à ce qu’il est de 1 mm d’épaisseur sur une lame de verre (Figure 4B).
  2. Utiliser un perce-bouchon (diamètre 0,3 cm) découper une section circulaire au centre du gel d’observation sur la lame de verre (Figure 4C).
  3. Remplissez la coupe bien entièrement avec perfluorodecalin (VFI) pour plus profonde et mieux confocale résolution d’imagerie dans les tissus foliaires.
  4. Utiliser un perce-bouchon (diamètre 0,2 cm) pour recueillir des disques foliaires de la DiI-PNC adaptée infiltré chez a. thaliana plantes (Figure 4D).
  5. Monter le disque de feuille dans le PFD rempli bien ; relever le côté (abaxial) infiltré de la feuille.
  6. Mettre une lamelle carrée sur le dessus le disque de feuille et appuyez doucement sur la lamelle couvre-objet diapositive uniformément à sceller avec le puits du gel d’observation et d’assurer qu'aucune bulle d’air ne reste piégés (Figure 4E).

6. l’imagerie DiI-PNC dans les tissus foliaires par microscopie confocale

  1. Utilisez un objectif de 40 X à un microscope confocal à balayage laser inversé.
  2. Déposer deux à trois gouttes de ddH2O sur le dessus de l’objectif X 40.
  3. Placez la diapositive d’échantillon foliaire de DiI-PNC infiltré préparée sur le dessus de l’inversé 40 X objectif grand-angulaire.
    1. Assurez-vous que le côté de la lamelle couvre-objet, mais pas le verre glisser contact directement avec les ddH2O sur la lentille.
  4. Trouver une région d’intérêt dans l’échantillon au microscope avec lumière laser ou champ lumineux.
  5. Lancez le logiciel de microscope et allumer le laser Argon (fixé à 20 %).
  6. Définissez le sténopé pour recueillir une optique tranche inférieure à 2 µm et une moyenne de ligne de 4.
  7. L’image de l’échantillon avec les paramètres de microscope confocal : excitation de laser 514 nm (30 %) ; Épaisseur de coupe Z-pile : 2 µm ; PMT1 : 550-615 nm (pour l’imagerie DiI-PNC) ; PMT2 : 700 à 800 nm (pour l’imagerie des chloroplastes).
  8. Prendre des images confocales représentatifs d’échantillons de feuilles de différentes personnes, un minimum de trois réplicats biologiques.

7. l’imagerie PNC en vivo ROS lessivage par microscopie confocale

  1. Préparer 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (H2DCFDA, un colorant pour indiquer un ROS générales) et 10 µM dihydroethidium (DHE, un colorant pour indiquer l’anion superoxyde) colorants dans le tampon de l’infiltration de TES (pH 7.5) dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL, séparément.
  2. Utiliser un perce-bouchon (diamètre 0,2 cm) pour recueillir les feuilles disques de la PNC adaptée se sont infiltrés dans les plantes Arabidopsis .
    1. Le bout pointu de la pince permet d’effectuer trois ou quatre trous dans les disques foliaires pour accélérer le processus de chargement de colorant.
  3. Transfert la feuille disques à tubes de microcentrifuge avec H2DCFDA et DHE séparément et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité.
  4. Après incubation, rincer la feuille disques avec FD2O trois fois et Mont dans le verre glisser avec observation de gel (voir protocole Section 5).
  5. Mettre la lame sur la microscopie confocale et mise au point manuelle à une zone de cellules du mésophylle foliaire. Voir protocole Section 6 pour plus de détails.
  6. Exposer les disques foliaires pour les UV-A (405 nm) laser pendant 3 min générer les ROS et enregistrer le changement d’intensité de signal ROS en série chronologique (« xyt ») par disque de feuille.
  7. Image du disque de feuille avec des paramètres de microscope confocal : 40 X eau objectif ; excitation de laser 496 nm ; PMT1 : 500-600 nm (pour détection colorant DHE et DCFDA) ; PMT2 : 700 à 800 nm (pour la détection des chloroplastes). Utiliser une plante infiltrée avec seulement la solution tampon infiltration comme contrôle négatif.

8. PNC nettoyage de H2O2in vitro

  1. Exercer l’activité mimétique de CAT (catalase) du synthétisées PNC in vitro en suivant les méthodes précédentes publications3,8,15
  2. Ajouter 45,4 µL d’infiltration de x TES 1 tampon (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, ajusté par HCl), PNC (60 nM, 3 µL) et H2O2 (2 µM, 1 µL) dans un puits (puits plaque de fond rond blanc 96) et le mélanger doucement en pipettant également.
  3. Ajouter 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine (travail concentration 100 µM, 0,5 µL) et la peroxydase de raifort (HRP ; travail concentration 0,2 U/mL, 0,1 µL) dans le puits, doucement mélangez-le en pipettant également et il incuber pendant 30 min. 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine réagit avec H2O2 et est convertie en résorufine en présence de la HRP.
    1. Enrouler la plaque avec du papier aluminium pour éviter la lumière durant l’incubation.
    2. Préparer un contrôle négatif en utilisant le tampon de réaction ou de l’eau en remplacement de H2O2.
    3. À l’exception de la solution mère, préparer toutes les autres solutions à température ambiante.
  4. Après l’incubation, avec un lecteur de plaque, surveiller l’absorbance à 560 nm à utiliser résorufine pour indiquer le niveau de H2O2. Régime de l’heure définie à 0, 2, 5, 10, 20 et 30 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Caractérisation et synthèse PNC .
PNC ont été synthétisés, purifié et caractérisé suivant la méthode décrite dans la Section 2 du protocole. Figure 1 A montre la coloration des solutions de nitrate de cérium, AAP, le mélange de nitrate de cérium et AAP et PNC. Un changement de couleur du blanc au jaune clair est vu après que PNC est synthétisé. Après purification avec un filtre de 10 kDa, PNC ont été caractérisés avec un spectrophotomètre UV-VIS. Un pic d’absorbance pour PNC a été observé à 271 nm (Figure 1B). L’éluant final a été également mesurée avec UV-VIS pour confirmer que les produits non-réagi chimiques ont été lavés pendant la purification. Le diamètre hydrodynamique et le potentiel zêta de la PNC synthétisée ont été mesurés avec un analyseur potentiel particules sizer et zeta (Figure 1C).

PNC marquage avec le colorant DiI .
Pour déterminer la répartition des nanoparticules en vivo, PNC ont été marquées avec un colorant fluorescent de DiI suivant la méthode décrite dans le Protocole N° 3 de la Section. DiI colorant incorpore dans le revêtement de la PNC spontanément car il peut encapsuler dans les domaines hydrophobes dans les revêtements de polymère de nanoceria16. Après avoir ajouté DiI colorant à la solution de la PNC, une couleur rapide changer de rose a été observée (Figure 2A). Le DiI PNC marqué étaient alors purifié avec un filtre de 10 kDa et caractérisée par une spectrophotométrie UV-visible. Trois pics clairs d’absorbance pour le DiI étiqueté PNC ont été observés (Figure 2B). L’éluant final a été mesurée par spectrophotométrie UV-visible à confirmer que les produits chimiques de non-réagi étaient délavées au cours de la purification.

Infiltration de limbe foliaire.
PNC ou DiI-PNC ont été livrés en feuille d’Arabidopsis via la méthode de l’infiltration pour le limbe foliaire, comme décrit dans le Protocole N° 4 de la Section. Feuille a été infiltrée en quatre points différents à s’assurer que la surface foliaire complet a été perfusée avec solution PNC (Figure 3A). Toute solution restante a été prélevée à la surface de la feuille (Figure 3B et 3C). La couleur de la feuille a changé au cours de l’infiltration du vert au vert foncé (Figure 3D). La seringue a été délicatement pressée contre la feuille pour éviter tout dommage physique.

Préparation d’échantillons de feuilles pour la microscopie de fluorescence.
Les échantillons de feuilles ont été montées sur des lames de verre dans un gel d’observation faite bien rempli de VFI. Après le gel d’observation de taille de pois de roulement sur la lame (Figure 4A et 4 b), un puits a été effectué dans le milieu du gel plat (Figure 4C). Ensuite, le disque de feuilles fraîchement préparée a été transféré dans le puits précédemment rempli de solution PFD (Figure 4D). Une lamelle a été utilisée pour immobiliser l’échantillon foliaire sur la lame (Figure 4E).

Imagerie confocale de DiI-PNC in vivo .
DiI-PNC infiltré chez a. thaliana feuilles étaient utilisées pour la détermination de la distribution de DiI-PNC dans les cellules du mésophylle foliaire via l’imagerie confocale (Figure 5A et 5 b). Pour visualiser la colocalisation entre le DiI-PNC et les chloroplastes, les échantillons de feuilles de DiI-PNC infiltré étaient excitées avec un laser à 514 nm. L’émission de DiI-PNC a été fixée à 550-615 nm pour éviter l’interférence possible des signaux de pigments chloroplastiques après ~ 650 nm17. L’auto-fluorescence de la chlorophylle de chloroplastes ont été détectés de 700 à 800 nm. Les paramètres d’imagerie confocale ont été fixés (puissance du laser et gain) pour s’assurer qu’aucun signal de colorant DiI ont été détectées dans l’échantillon de feuilles de contrôle (infiltré avec tampon seul) (Figure 5C). La co-localisation de DiI-PNC avec chloroplastes des cellules du mésophylle foliaire peut être observée par l’image de superposition de DiI-PNC détecté et chloroplastique pigment autofluorescence (Figure 5D).

Imagerie confocale de PNC ROS nettoyage en vivo .
PNC en solution de tampon TES 10 mM ont été livrés en feuilles d’a. thaliana via la méthode d’infiltration de limbe foliaire comme décrit dans la Section 7 de protocole. DHE (dihydroethidium) et H2DCFDA (2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacétate) les colorants fluorescents sont utilisés pour visualiser les ROS à l’usine tissus8,18. H2DCFDA est connu à convertir en fluorescent DCF (2′, 7′-dichlorofluorescéine, un indicateur du degré de stress oxydatif général) en raison du clivage des groupes acétate par ROS19. DHE est une teinture plus spécifique pour superoxyde anion ayant son produit fluorescent (2-hydroxyethidium) augmente par réaction avec un anion de superoxyde20. In vivo ROS nettoyage activée par la PNC a été suivie dans des disques foliaires mesurer les variations intensité de fluorescence à colorant DHE et DCF (Figures 6 a et 6 b). PNC se sont infiltrés dans la feuille des échantillons ont été excités avec 496 laser nm. L’émission de colorant DHE et DCF a été fixée à 500-600 nm pour éviter l’interférence possible avec des signaux de fluorescence auto chloroplastique. Pigment auto-fluorescence de chloroplastes ont été détectés de 700 à 800 nm. Après que 3 minutes d’UV le stress, la teinture ROS signaux dans PNC et tampon-se sont infiltrés dans les échantillons de feuilles ont été mesurés séparément. Par rapport au contrôle tampon no-NANOPARTICULE (NNP), PNC se sont infiltrés dans les feuilles a montré nettement moins activés par ROS fluorescent colorant signal DCF (Figure 6A). Des résultats similaires ont aussi étés avec le colorant DHE d’activés anion superoxyde, où les feuilles PNC infiltré ont significativement plus faible intensité de colorant DHE que tampon s’est infiltré dans les feuilles de contrôle (Figure 6B).

Analyse d’activité mimétique de PNC CAT . Dosage des PNC nettoyage H2O2 a été décrite dans le protocole de l’article 8. Une diminution de résorufine qui indique le niveau de2 H2O dans le mélange réactionnel contenant PNC a été observée (Figure 7), confirmant l’activité mimétique de CAT de la PNC synthétisée.

Figure 1
Figure 1 : Synthèse et caractérisation de PNC. A. coloration de nitrate de cérium, acide acrylique de poly (AAP), mélange de nitrate de cérium et AAP et le PNC synthétisé (nanoparticules de d’oxyde de cérium AAP enduit, jaune-clair). B. spectre d’absorbance de de PNC mesurée par spectrophotométrie UV-visible. Diamètre C. hydrodynamique et zeta potentiels du PNC synthétisée. Moyenne ± écart-type (n = 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : PNC étiquetage avec colorant fluorescent DiI. A. PNC (jaune clair) et DiI teignent étiquetée solution PNC (DiI-PNC, rose). B. spectre d’absorbance de de solution de DiI-PNC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Feuille d’infiltration de la lamina de PNC ou DiI-PNC. A. a. thaliana feuille avant infiltration. La solution à l’intérieur de la seringue est DiI-PNC. B. feuilles infiltré avec DiI-PNC. C. nettoyage du reste de la solution de la surface de la feuille avec la tâche délicate de lingettes. D. nettoyer Arabidopsis leaf infiltré avec DiI-PNC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Préparation de diapositives échantillon foliaire. Lame de verre A. microscopie avec pois taille observation des gels. B. faites glisser avec des gels de plat d’observation. C. Glissez avec gel observation plat ayant un puits au milieu. D. faire glisser avec des disques foliaires dans le gel d’observation bien rempli d’une solution perfluorodecalin (PFD). E. faire glisser avec des disques foliaires immobilisés par lamelle couvre-objet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Imagerie DiI-PNC dans le mésophylle de la feuille des cellules par l’intermédiaire de la microscopie confocale. Échantillon d’a. Leaf est monté sur un microscope confocal inversé ayant un objectif d’immersion de l’eau X 40. B. un microscope confocal est utilisé pour l’imagerie DiI-PNC et les chloroplastes. C. chloroplaste auto-fluorescence est enregistrée dans les échantillons de feuilles tampon infiltré sans nanoparticules (NNP). D. DiI-PNC signal et chloroplaste auto-fluorescence est photographiée sur les échantillons de feuilles de DiI-PNC infiltré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Surveillance des PNC ROS nettoyage en planta par microscopie confocale. Le colorant fluorescent A. DCF (pour le suivi général ROS signal) est significativement plus faible dans les cellules du mésophylle de plantes PNC infiltré que contrôle tampon (sans nanoparticules, NNP). Fluorescentes DHE réduit de B. dye (pour la surveillance de l’anion superoxyde) dans les cellules du mésophylle de plantes PNC infiltré par rapport à celle du contrôle (NNP) de la mémoire tampon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Activité mimétique de la catalase (CAT) de PNC. En présence de peroxydase de raifort, la sonde fluorescente réagit avec le peroxyde d’hydrogène et est convertie en résorufine (absorbance 560 nm). Absorbance de résorufine, qui indique des niveaux de peroxyde d’hydrogène, a été suivie à 560 nm. PNC ont montré une activité mimétique de la CAT. Moyenne ± écart type (erreur standard) (n = 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons les PNC synthèse, caractérisation, étiquetage de colorant fluorescent et imagerie confocale des nanoparticules dans les cellules du mésophylle plante à exposer leur en vivo ROS activité anti-radicalaire. PNC sont synthétisés à partir d’un mélange de nitrate de cérium et AAP solution hydroxyde d’ammonium. PNC sont caractérisés par la spectrophotomery de l’absorption et la concentration déterminée à l’aide de la Loi de Beer-Lambert. Mesures de potentiel zêta a confirmé la surface chargée négativement de PNC pour améliorer la prestation aux chloroplastes8. Étiquetage des PNC avec un colorant fluorescent de DiI permet l’imagerie in vivo par microscopie confocale dans les cellules du mésophylle foliaire où les nanoparticules montrent des niveaux élevés de co-localisation avec chloroplastes. À l’aide de colorants fluorescents DHE et DCF, nous a confirmé cet acte PNC comme un piège puissant de l’anion superoxyde et ROS in vivo.

La méthode de synthèse des PNC est une simple procédure par étapes qui génère des nanoparticules d’oxyde de cérium avec taille contrôlée, la charge négative et ROS nettoyage capacités16. Autres méthodes, telles que l’hydrolyse thermique, exigent des températures élevées et chimie coûteux équipement21,22. La synthèse et la caractérisation des PNC est une méthode de faible coût réalisée avec appareil de laboratoire commun. Il ne nécessite pas une courbe d’apprentissage abrupte par rapport à des méthodes moléculaires chez les plantes basés sur la surexpression d’une enzyme antioxydante, par exemple, SOD, APXet CAT, pour le nettoyage des espèces ROS dans modèle systèmes23. PNC est un charognard catalytique ROS à la fois robuste, soluble dans l’eau qui ne nécessite pas de clonage laborieux et des méthodes de transformation qui sont tributaires de la traçabilité génétique de la plante et la boîte à outils moléculaire disponible.

Une étape cruciale dans le présent protocole est l’infiltration axée sur la seringue des cellules du mésophylle foliaire avec PNC. Infiltration des nanoparticules dans les plantes vivantes doit être faite délicatement pour éviter des dégâts physiques à la feuille24. Ainsi, comme dans protocole étape 4 des méthodes, poussez doucement contre la surface de la feuille avec la seringue pour éviter la déchirure ou perforation de la face abaxiale. Il est préférable de s’infiltrer depuis la surface abaxiale de Arabidopsis leaf puisqu’il a une densité stomatique plus élevée que la surface adaxiale25,26. En outre, une solution tampon des PNC ou DiI-PNC au sein de la gamme des pH physiologiques (~ pH 7,5) doit être utilisé au cours de l’infiltration du limbe foliaire. Une autre étape cruciale dans ce protocole consiste à appliquer la concentration appropriée de PNC pour les tissus végétaux étudiés. Dans ce protocole, 50 mg/L de PNC n’était pas toxique pour les feuilles d’a. thaliana tout en permettant aux catalytique PNC ROS nettoyage. Certaines limitations de la méthode actuelle de prestation des nanoparticules s’appliquent 1) pas de planter des espèces ayant des cuticules cireuses et épais ou faible densité des stomates, 2) pas évolutive pour les applications dans le domaine, 3) le coût élevé d’un système de microscopie confocale à surveiller en vivo distribution de nanoparticules et de nettoyage de ROS.

Ce protocole illustre l’application de ROS nettoyage PNC pour étudier et améliorer la tolérance au stress abiotique dans les plantes grâce à une méthode facile d’infiltration du limbe foliaire. Accumulation de ROS est accompagnée de stress abiotiques chez les plantes, qui à son tour réduit la photosynthèse végétale, croissance et le rendement de27,8,28. Des méthodes de modifications génétiques végétaux pour ROS manipulation in vivo ne se limitent souvent à planter des espèces modèles alors que les PNC ROS-nettoyage a le potentiel pour être appliqué aux espèces végétales diverses type sauvage. Infiltration du limbe foliaire est une méthode de recherche pratique pour augmenter les ROS nettoyage dans les tissus foliaires pour la compréhension et la tolérance au stress abiotique plante d’ingénierie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l’Université de Californie à Riverside et USDA National Institute of Food et Agriculture, Hatch projet 1009710 à J.P.G. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous Grant no 1817363 à J.P.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cerium (III) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 238538-100G
Molecular Biology Grade Water, Corning VWR 45001-044 
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes VWR 14-959-49A
Poly (acrylic acid) 1,800 Mw Sigma-Aldrich 323667-100G
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-370
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer Fisher Scientific 02-215-391
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set Fisher Scientific 02-215-395
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 05002-1L
PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning VWR 13912-149 
RCT basic IKA 3810001
Eppendorf Microcentrifuge 5424 VWR 80094-126
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Millipore-Sigma UFC901024
Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge Beckman Coulter B06314
UV-2600 Sptecrophotometer Shimadzu UV-2600 120V
Whatman Anotop 10 syringe filter Sigma-Aldrich WHA68091102
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-829-45
Zetasizer Nano S Malvern Panalytical Zen 1600
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Sigma-Aldrich 42364-100MG
Dimethyl Sulfoxide, ACS VWR BDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1 Green Island Distributors, Inc 5212601.CFL080P
Adaptis 1000 Conviron A1000
TES, >99% (titration Sigma-Aldrich T1375-100G
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266-1KG
Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe Fisher Scientific 14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Carolina Observation Gel Carolina 132700
Corning microscope slides, frosted one side, one end Sigma-Aldrich CLS294875X25-72EA
Cork Borer Sets with Handles Fisher Scientific S50166A
Perfluorodecalin Sigma-Aldrich P9900-25G
Micro Cover Glasses, Square, No. 1 VWR 48366-045
Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 Leica Microsystems TCS SP5
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate Sigma-Aldrich D6883-250MG
Dihydroethidium Sigma-Aldrich D7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Eppendorf Uvette cuvettes Sigma-Aldrich Z605050-80EA
Chlorophyll meter  Konica Minolta SPAD-502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
  2. Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
  3. Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
  4. Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
  5. Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
  6. Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
  7. Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
  8. Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
  9. Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
  10. Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
  11. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
  12. Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
  13. Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
  14. Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
  15. Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
  16. Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
  17. Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
  18. Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
  19. Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
  20. Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
  21. Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
  22. Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
  23. Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
  24. Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
  25. Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
  26. Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
  27. Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
  28. Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).

Tags

Numéro 138 stress abiotique nanoceria imagerie confocale bio-ingénierie infiltration de limbe foliaire plante ROS nettoyage
Nettoyage catalytique de plante oxygénées espèces <em>In Vivo</em> par des nanoparticules d’oxyde de cérium anioniques
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Newkirk, G. M., Wu, H., Santana, I., … More

Newkirk, G. M., Wu, H., Santana, I., Giraldo, J. P. Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (138), e58373, doi:10.3791/58373 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter