Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Synthese und Charakterisierung von Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria) für ROS (reaktive Sauerstoffspezies) in Vivo, Nanoceria im Pflanzengewebe durch konfokale Mikroskopie und in-Vivo imaging Aufräumvorgang Überwachung des Nanoceria ROS Aufräumvorgang konfokalen Mikroskopie.
Abstract
Reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS)-Ansammlung ist ein Markenzeichen der Pflanze abiotischen Stress-Reaktion. ROS spielen eine Doppelrolle in Pflanzen als Signalmoleküle auf einem niedrigen Niveau und Moleküle auf einem hohen Niveau zu beschädigen. Anhäufung von ROS in gestresste Pflanzen kann Stoffwechselprodukte, Enzyme, Lipide und DNA, was zu einer Reduzierung des Pflanzenwachstums und der Ertrag beschädigen. Die Fähigkeit der Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria), katalytisch ROS in Vivo Aufräumen bietet ein einzigartiges Werkzeug zu verstehen und Biotechnologe Pflanzenverträglichkeit abiotischem Stress. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu synthetisieren und Poly (Acryl) Säure beschichteten Nanoceria (PNC) zu charakterisieren, Schnittstelle die Nanopartikel mit Pflanzen über Blatt-Lamina-Infiltration und Überwachung ihrer Verteilung und ROS Aufräumvorgang in Vivo konfokale mit Mikroskopie. Aktuelle Molekulare Werkzeuge zur Manipulation der ROS-Akkumulation in Pflanzen sind nur die Modell-Arten und mühsamer Wandel Methoden erfordern. Dieses Protokoll für in Vivo ROS Aufräumvorgang hat das Potenzial, zu Wildtyp-Pflanzen mit breiten Blättern und Blattstruktur wie Arabidopsis Thalianaangewendet werden.
Introduction
Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria) sind in lebenden Organismen, von der Grundlagenforschung zur Biotechnologie, aufgrund ihrer unterschiedlichen katalytischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Aufräumvorgang Fähigkeit1,2,3verbreitet. Nanoceria haben ROS Aufräumvorgang Fähigkeiten aufgrund einer großen Anzahl von Oberfläche Sauerstoff stellen, die abwechselnd zwei Oxidation Staaten (Ce3 + und CE-4 +) 4,5,6. Die CE-3 + baumelnden Bindungen Aufräumen effektiv ROS während der Gitter-Stämme im Nanobereich die Regeneration dieser defekt Seiten über Redox fördern-Reaktionen7Radfahren. Nanoceria haben auch vor kurzem verwendet, für das Studium und Engineering Anlagenbau Funktion8,9. Pflanzen unter abiotischen Stress erleben Anhäufung von ROS, oxidativen Schäden an Lipiden, Proteinen und DNA-10. In A. Thaliana Pflanzen führt Nanoceria katalytische Aufräumvorgang von ROS in Vivo zu verbesserten pflanzlichen Photosynthese unter hohen Licht, Wärme und Kühlung betont8. Anwendung Nanoceria auch erhöht Shooting Biomasse und Korn-Ertrag von Weizen (Triticum Aestivum)11Boden; Raps (Brassica Napus) Pflanzen mit Nanoceria behandelt haben höhere pflanzlicher Biomasse unter salzstress12.
Nanoceria bieten Bioingenieure und Biologen eine Nanotechnologie-basierte Tool, um abiotischem Stress-Reaktionen zu verstehen und zu verbessern Pflanzenverträglichkeit abiotischem Stress zu Pflanzen. Nanoceria der in Vivo ROS Aufräumvorgang Fähigkeiten sind unabhängig von Pflanzenarten und einfache Lieferung ins Pflanzengewebe hat das Potenzial, breite Anwendung außerhalb von Modellorganismen zu ermöglichen. Im Gegensatz zu anderen Methoden genetisch bedingt Nanoceria erfordern keine Generierung von Pflanzenlinien mit der Überexpression von antioxidativen Enzymen für höhere ROS Aufräumvorgang Fähigkeit13. Blatt-Lamina Infiltration von Nanoceria Pflanzen ist ein praktischer Ansatz für die Labor-basierte Forschung.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, (1) die Synthese und Charakterisierung von negativ geladenen Poly (Acryl) Säure Nanoceria (PNC), (2) die Lieferung und Verfolgung von PNC im gesamten Blattzellen und (3) die Kontrolle der PNC-fähigen ROS Aufräumvorgang beschreiben Vivo. In diesem Protokoll sind negativ geladenen Poly (Acryl) Säure Nanoceria (PNC) synthetisiert und charakterisiert durch ihr Absorptionsspektrum, hydrodynamische Durchmesser und Zetapotenzial. Wir beschreiben eine einfache Blatt Lamina Infiltration-Methode um PNC in Pflanze Blatt Gewebe liefern. Für die in-Vivo Bildgebung der Verteilung der Nanopartikel im Mesophyll Zellen wurde ein Fluoreszenzfarbstoff (DiI) zur PNC (DiI-PNC) beschriften und beobachten die Nanopartikel über konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Schließlich erklären wir, wie in Vivo PNC ROS Abfangen durch konfokale Mikroskopie zu überwachen.
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Protocol
1. A. Thaliana Pflanzen
- Säen Sie A. Thaliana in 5 x 5 cm Einweg-Töpfe mit einheitserde Mischung gefüllt. 32 dieser Töpfe in ein Kunststoff-Tablett mit Wasser gefüllt genommen (~ 0,5 cm Tiefe) und die Kunststoff-Tablett mit den Pflanzen in einer Pflanze Wachstum Kammer übertragen.
- Einstellen des Wachstums Kammer wie folgt: 200 µmol/ms fotosynthetisch aktive Strahlung (PAR), 24 ± 1 ° C Tag und 21 ± 1 ° C Nacht 60 % Luftfeuchtigkeit und 14/10 h Tag/Nacht Licht Regime, beziehungsweise.
- Dünne jeden Topf um nur eine einzelne Pflanze nach einer Woche der Keimung zu verlassen. Beachten Sie die Sämlinge mit ähnlicher Größe in jeden Topf zu halten.
- Wasser die Töpfe von strömendem Wasser direkt an der Plastikschale einmal alle zwei Tage. Wachsen Sie die Pflanzen, für vier Wochen. A. Thaliana Pflanzen sind für die weitere Verwendung bereit.
(2) Synthese und Charakterisierung von PNC
- CER (III) Nitrat 1,08 g wiegen und in 2,5 mL Molekularbiologie Grade Wasser in einem 50 mL konische Röhrchen auflösen.
- Poly (Acryl) Säure 4,5 g wiegen und in 5 mL Molekularbiologie Grade Wasser in einem 50 mL konische Röhrchen auflösen.
- Mischen Sie diese beiden Lösungen gründlich auf 2.000 u/min für 15 min mit einem digitalen Vortex Mixer.
- Übertragen Sie 15 mL Ammonium Hydroxid-Lösung (7,2 M) auf ein 50-mL-Becherglas.
- Unter ständigem Rühren bei 500 u/min, die Mischung aus Schritt 2.3 tropfenweise das Ammonium Hydroxid Projektmappe hinzufügen und rühren bei 500 u/min bei Raumtemperatur für 24 Stunden in einer Dampfhaube.
- Decken Sie das Becherglas mit einem Stück Papier, um den erheblichen Verlust Lösung während der Nacht Reaktion zu vermeiden.
- Übertragen Sie nach 24 h die resultierende Lösung auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren sie bei 3.900 x g für 1 h um mögliche Ablagerungen und große Agglomerate zu entfernen.
- Übertragen Sie diese 22,5 mL der überstehenden Lösung in drei 15 mL 10 kDa Filter und füllen Sie den Rest des Filters mit molekularen Grade Wasser zu einer totalen Verdünnung von 45 mL.
- Reinigen Sie die überstehende Lösung aus freien Polymeren und anderen Reagenzien mit einer Benchtop-Zentrifuge, indem Sie eine 15 mL 10 kDa Filter und Zentrifuge bei 3.900 x g für 15 min. Überstands hinzufügen wiederholen Sie diesen Schritt mindestens sechsmal.
- Messen Sie die Absorption der Eluent in jedem Zyklus mit einem UV-VIS Spektralphotometer von 220-700 nm, keine freie Polymere zu gewährleisten und andere Reagenzien in der endgültigen PNC-Lösung vorhanden sind.
- Nehmen Sie die gesammelten PNC-Lösung in 5 mL Spritze und gegen einen 20 nm Pore Größe Spritze Filter filtern. Sammeln Sie die gefilterten PNC-Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen.
- Nehmen Sie eine verdünnte Lösung für endgültige PNC in Kunststoff Küvette und Messen Sie seine Absorption mit UV-VIS Spektralphotometer von 220-700 nm zu. PNC Extinktion Gipfel ist 271 nm.
- Seine Konzentration mit Bier-Lambert Gesetz berechnen: A = εCL. A ist die Extinktion der Peak-Wert für eine gegebene Probe, Mundarten ist die molare Absorptionskoeffizienten von PNC (cm-1 M-1), L ist die optische Weglänge (Küvette Breite, 1 cm in dieser Methode), und C ist die molare Konzentration der gemessenen Nanopartikel.
- Messen Sie die hydrodynamischen Durchmesser und Zeta-Potential des synthetisierten PNC mit einem Partikel Größe und Zeta potenzielle Analyzer (Abbildung 1).
- Die endgültige PNC-Lösung im Kühlschrank (4 ° C) bis zur weiteren Verwendung zu speichern.
Hinweis: Siehe Wu Et Al. 8 weitere Protokoll-Informationen über PNC Charakterisierung.
3. Kennzeichnung PNC mit DiI Fluoreszenzfarbstoff
- 0,4 mL 5 mm (58 mg/L) PNC mit 3,6 mL der Molekularbiologie Grade Wasser in ein 20 mL-Glasflasche verrühren Sie und bei 500 Umdrehungen pro Minute.
- Fügen Sie 24 µL 1, 1'-Dioctadecyl-3,3, 3', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat Farbstofflösung (DiI, 2,5 mg/mL; verdünnter in DMSO) in 176 µL DMSO (Dimethyl Sulfoxid), die DiI Farbstofflösung zu machen.
- Die DiI-Farbstoff tropfenweise die PNC Projektmappe fügen Sie hinzu, rühren bei 1.000 u/min für 1 min bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie dieses resultierende Mischung in einen 15 mL 10 kDa Filter und füllen Sie das Rohr an der Spitze mit Molekularbiologie Grade Wasser, damit die gesamte Verdünnung 15 mL.
- Reinigen Sie die DiI PNC (DiI-PNC) Lösung von DMSO und jede mögliche freie DiI Farbstoff durch ein Benchtop-Zentrifugation mit 15 mL 10 kDa Filter bei 3.900 x g für 5 min beschriftet.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5 mindestens fünfmal.
- Filtern Sie die endgültigen DiI-PNC-Lösungen durch einen 20 nm Pore Größe Spritze Filter.
- Messen Sie die Extinktion des endgültigen DiI-PNC durch UV-VIS-Spektrophotometrie und berechnen Sie die Konzentration nach Bier-Lambert Gesetz (Abbildung 2). Näheres hierzu finden Sie unter Schritt 2.13.
- Bewahren Sie es im Kühlschrank bei 4 ° C für die weitere Verwendung.
(4) Infiltration der Pflanze Blätter mit PNC
- Fügen Sie 0,1 mL der Infiltration Puffer (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, durch HCl eingestellt) in 0,9 mL 0,5 mM PNC oder DiI-PNC-Lösung und Wirbel es. Verwenden Sie eine Lösung aus 10 mM TES Infiltration Puffer als Negativkontrolle.
- Übertragen Sie auf eine sterile nadellosen Spritze 1 mL 0,2 mL der PNC oder DiI-PNC Infiltration Lösung. Tippen Sie auf, um mögliche Luftblasen zu entfernen.
- Abrufen der Pflanzenschutzmittels aus der Wachstums-Kammer kurz vor Infiltration mit Nanopartikeln möglich Spaltöffnungen Schließung unter Zimmer Lichtverhältnissen zu vermeiden.
- Messen Sie vor Infiltration der Chlorophyllgehalt von A. Thaliana Blätter mit ähnlicher Größe mit einem Chlorophyll Meter. Messen Sie jedes Blatt mit drei Wiederholungen (jedes replizieren, bestehend aus mindestens drei Messungen)14. Wählen Sie A. Thaliana mit ähnlichen Chlorophyllgehalt für die Infiltration Experiment verlässt.
- Infiltrieren Sie die Blätter langsam mit der vor kurzem hergestellte PNC oder DiI-PNC Lösung durch leichtes drücken die Spitze der nadellosen Spritze gegen die Unterseite der Blatt-Lamina (abaxial Seite) und drücken Sie den Kolben(Abbildung 3).
- Vorsichtig wischen Sie die überschüssige Lösung, die auf der Oberfläche des Blattes Lamina (Abbildung 3B) mit einer heiklen Aufgabe Wischer (Abb. 3C) bleibt und beschriften Sie die Pflanze. Verwenden Sie neue heikle Aufgabe Tücher für jede Gruppe von Blättern.
- Halten Sie die infiltrierten A. Thaliana auf der Bank für Blatt Anpassung und Inkubation mit PNC oder DiI-PNC für 3 h Pflanzen.
Hinweis: Infiltrierten A. Thaliana Pflanzen sind dann bereit für den weiteren Einsatz (Abbildung 3D).
5. Vorbereitung des Blattproben für die konfokale Mikroskopie
- Roll eine erbsengroße Menge der Beobachtung über einen Radius von 1 cm (Abb. 4A) gel und dann breitete sie bis 1 mm dünn auf einen Glasobjektträger (Abbildung 4B) ist.
- Verwenden Sie einen Korken Borer (Durchmesser 0,3 cm) schneiden Sie einen kreisförmigen Querschnitt in der Mitte des Gels Beobachtung auf dem Objektträger (Abb. 4C).
- Füllen Sie den Schnitt auch komplett mit Perfluorodecalin (PFD) für tiefer und besser konfokale bildgebenden Auflösung im Blatt Gewebe.
- Verwenden Sie einen Korken Borer (Durchmesser 0,2 cm) zum Blattscheiben von angepassten DiI-PNC zu sammeln infiltriert A. Thaliana Pflanzen (Abbildung 4D).
- Montieren Sie die Blatt-Scheibe in der PFD gut gefüllt; die infiltrierte (abaxial) Seite des Blattes aufgedeckt.
- Setzen Sie ein Quadrat Deckglas auf der Blatt-CD und drücken Sie vorsichtig auf die Folie Deckglas gleichmäßig, mit dem Brunnen der Beobachtung Gel versiegeln und sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen (Abbildung 4E) bleiben.
6. Bildgebung DiI-PNC in Blatt Geweben durch konfokale Mikroskopie
- Verwenden Sie eine 40 X Objektiv in einem invertierten Laserscanning confocal Mikroskop.
- Legen Sie zwei bis drei Tropfen DdH2O auf der Oberseite 40 X Objektiv.
- Legen Sie die vorbereitete DiI-PNC infiltriert Blatt Probe Folie auf der Oberseite der invertierten 40 X Objektiv Objektiv.
- Stellen Sie sicher, das Deckglas Seite aber nicht das Glas schieben Sie Kontakt direkt mit dem DdH2O auf der Linse.
- Eine Region of Interest in der Probe unter dem Mikroskop mit Laserlicht oder Hellfeld zu finden.
- Starten Sie die Mikroskop-Software und schalten Sie die Argon-Laser (auf 20 % gesetzt).
- Festlegen der Lochkamera, eine optische Scheibe weniger als 2 µm und eine Linie Durchschnitt von 4 zu sammeln.
- Bild die Probe mit confocal Mikroskop Einstellungen: 514 nm Laseranregung (30 %); Z-Stapel Schnittdicke: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (für DiI-PNC-Tomographie); PMT2: 700-800 nm (für die Chloroplasten Bildgebung).
- Nehmen Sie repräsentative konfokale Bilder von Blattproben von verschiedenen Individuen, ein Minimum von drei biologische repliziert.
(7) imaging PNC in Vivo ROS Aufräumvorgang konfokalen Mikroskopie
- Bereiten Sie 25 µM 2', 7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (H2DCFDA, ein Farbstoff zur Angabe einer allgemeinen ROS) und 10 µM Dihydroethidium (DHE, ein Farbstoff zur Anzeige von Superoxid-Anion) Farbstoffe in TES Infiltration Puffer (pH 7,5) in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen separat zu bestellen.
- Verwenden Sie einen Korken Borer (Durchmesser 0,2 cm), um Blatt zu sammeln Scheiben aus den angepassten PNC infiltriert A. Thaliana Pflanzen.
- Verwenden Sie die scharfe Spitze der Zange um drei bis vier Löcher auf den Blattscheiben Farbstoff Ladevorgang zu beschleunigen.
- Übertragung der Leaf Scheiben für Mikrozentrifugenröhrchen mit H2DCFDA und DHE separat und inkubieren Sie für 30 min unter Dunkelheit.
- Nach der Inkubation gel spülen das Blatt mit DdH2O dreimal discs und montieren es ins Glas gleiten mit Beobachtung (siehe Protokoll Abschnitt 5).
- Setzen Sie die Folie auf das konfokale Mikroskop und manuell zu fokussieren Sie, zu einer Region des Mesophyll Blattzellen. Details siehe Protokoll Abschnitt 6.
- Setzen die Blattscheiben, die UV-A (405 nm) Laser für 3 min ROS zu generieren und die Signaländerung Intensität ROS in Zeitreihen ("Xyt") pro Blatt Disc aufzeichnen.
- Die Blatt-Scheibe mit confocal Mikroskop Einstellungen Bild: 40 X Wasser Ziel; 496 nm Laseranregung; PMT1: 500-600 nm (für DHE und DCFDA Farbstoff-Erkennung); PMT2: 700-800 nm (für Chloroplasten-Erkennung). Verwenden Sie eine Anlage mit nur Infiltration Pufferlösung als der Negativkontrolle infiltriert.
(8) PNC Aufräumvorgang von H2O2in vitro
- Die Katze (Katalase) mimetische Aktivität des synthetisierten PNC in Vitro zu führen, indem Sie die Methoden in früheren Publikationen3,8,15
- Hinzufügen von 45,4 µL 1 X TES Infiltration-Puffer (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, durch HCl eingestellt), PNC (60 nM, 3 µL), und H2O2 (2 µM, 1 µL) in einen Brunnen (weiße Rundboden 96-well-Platte), und mischen Sie es sanft durch pipettieren.
- Fügen Sie 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine (arbeiten Konzentration 100 µM, 0,5 µL) und Meerrettich-Peroxidase (HRP; arbeiten Konzentration 0,2 U/mL, 0,1 µL) in den Brunnen sanft durch pipettieren mischen und 30 min. 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine inkubieren reagiert mit H2O2 und in Resorufin in Anwesenheit von HRP umgewandelt wird.
- Wickeln Sie die Platte mit Aluminium-Folie, Licht während der Inkubation zu vermeiden.
- Bereiten Sie eine Negativkontrolle mit Reaktion Puffer oder Wasser, um H2O2zu ersetzen.
- Mit Ausnahme der Stammlösung bereiten Sie alle anderen Lösungen bei Umgebungstemperatur vor.
- Nach der Inkubation mit einem Lesegerät Platte überwachen die Extinktion bei 560 nm, Resorufin zu verwenden, geben Sie die Höhe der H2O2. Zeitregime auf 0, 2, 5, 10, 20 und 30 min festgelegt.
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Representative Results
PNC-Synthese und Charakterisierung .
PNC wurden synthetisiert, gereinigt und zeichnet sich im folgenden die Protokoll Abschnitt 2 beschrieben. Abbildung 1 A zeigt die Färbung der Cerium Nitrat, PAA, die Mischung aus Cerium Nitrat und PAA und PNC-Lösungen. Ein Farbwechsel von weiß bis hellgelb ist gesehen, nachdem PNC synthetisiert wird. Nach der Reinigung mit einem 10 kDa-Filter PNC zeichneten sich mit einem UV-VIS Spektralphotometer. Ein Höhepunkt der Extinktion für PNC wurde beobachtet bei 271 nm (Abbildung 1B). Die endgültige Laufmittel wurde auch mit UV-VIS zu bestätigen, dass die Chemikalien nicht reagiert während der Reinigung gewaschen wurden gemessen. Die hydrodynamischen Durchmesser und Zeta-Potential des synthetisierten PNC wurden mit einem Particle Sizer und Zeta potenzielle Analyzer (Abbildung 1C) gemessen.
PNC Kennzeichnung mit DiI Farbstoff .
Um die Verteilung der Nanopartikel in Vivozu ermitteln, wurden mit einem Fluoreszenzfarbstoff DiI nach der Methode in Protokoll Abschnitt 3 beschriebenen PNC beschriftet. DiI Farbstoff bettet spontan innerhalb der PNC-Beschichtung, da es in den hydrophoben Domänen innerhalb der Polymerbeschichtungen Nanoceria16Kapseln kann. Nachdem die PNC-Lösung DiI Farbstoff hinzugefügt, eine schnelle Farbwechsel Rosa beobachtet (Abb. 2A). Die DiI beschrifteten PNC wurden dann mit einem 10 kDa-Filter gereinigt und zeichnet sich durch eine UV-VIS-Spektrophotometrie. Drei klare Spitzen der Absorption für die DiI beschriftet PNC beobachtet (Abb. 2B). Die endgültige Laufmittel wurde durch UV-VIS-Spektrophotometrie zu bestätigen, dass die Chemikalien nicht reagiert während der Reinigung ausgewaschen wurden gemessen.
Blatt-Lamina-Infiltration.
PNC waren DiI-PNC geliefert oder in A. Thaliana Blatt über Blatt-Lamina-Infiltration-Methode wie im Protokoll Abschnitt 4 beschrieben. Blatt wurde an vier verschiedenen Stellen um sicherzustellen, dass die gesamte Blattfläche mit PNC-Lösung(Abbildung 3)durchblutet wurde infiltriert. Jede verbleibende Lösung wurde von der Blattoberfläche (Abbildung 3B und 3 C) entfernt. Die Blattfarbe während Infiltration von grün auf dunklere grün (Abbildung 3D) geändert. Die Spritze wurde sanft gegen das Blatt gedrückt, um eine Beschädigung zu vermeiden.
Blatt-Probenvorbereitung für die Fluoreszenz-Mikroskopie.
Blattproben wurden auf Objektträger innerhalb einer Beobachtung Gel gemacht gut gefüllt mit PFD montiert. Nach dem Walzen der Erbse Größe Beobachtung Gel auf der Folie (Abbildung 4A und 4 b), wurde ein Brunnen in der Mitte der flachen Gel (Abb. 4C). Dann wurde die frisch zubereiteten Blatt Disc zum Brunnen vorher gefüllt mit PFD-Lösung (Abbildung 4D) übertragen. Ein Deckglas wurde verwendet, um das Blatt-Muster auf der Folie (Abbildung 4E) zu immobilisieren.
Konfokale DiI-PNC in-vivo-Bildgebung .
DiI-PNC infiltriert A. Thaliana Blätter dienten zur Bestimmung der Verteilung der DiI-PNC im Mesophyll Blattzellen mittels confocal Imaging (Abb. 5A und 5 b). Um ns1 zwischen der DiI-PNC und Chloroplasten zu visualisieren, freuten sich die DiI-PNC infiltriert Blattproben mit 514 nm Laser. Die Emission von DiI-PNC wurde bei 550-615 nm eingesetzt, um mögliche Störungen der Chloroplasten Pigmente Signale nach ~ 650 nm17zu vermeiden. Die Auto-chlorophyllfluoreszenz aus Chloroplasten wurden von 700-800 nm nachgewiesen. Die konfokale Bildgebung wurden eingestellt (Laserleistung und Gewinn), um sicherzustellen, dass keine DiI Farbstoff Signale erkannt wurden, in der Kontrollprobe Blatt (mit nur Puffer infiltriert) (Abbildung 5C). Die ns1 der DiI-PNC mit Chloroplasten im Mesophyll Blattzellen kann durch das Overlay-Bild erkannten DiI-PNC und Chloroplasten Pigment Autofluoreszenz (Abbildung 5D) beobachtet werden.
Confocal Imaging von PNC ROS Aufräumvorgang in vivo .
PNC in 10 mM TES Pufferlösung lieferte in A. Thaliana Blätter über die Blatt-Lamina-Infiltration-Methode, wie im Protokoll Abschnitt 7 beschrieben. DHE (Dihydroethidium) und H2DCFDA (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat) fluoreszierende Farbstoffe werden verwendet, um ROS in pflanzlichen Geweben8,18zu visualisieren. H2ist DCFDA bekannt, in fluoreszierenden DCF (2′, 7-dichlorofluoresceins, ein Indikator für den Grad der allgemeinen oxidativen Stress) konvertiert werden durch die Spaltung von Acetatgruppen durch ROS19. DHE ist ein spezifischer Farbstoff für Superoxid Anion seine fluoreszierende Produkt (2-Hydroxyethidium) bei der Reaktion mit einem Superoxid-Anion-20erhöhen. In vivo ROS Abfangen von PNC aktiviert wurde in Blattscheiben Messung DHE und DCF Farbstoff Fluoreszenz Intensität (Abbildungen 6A und 6 b) überwacht. PNC infiltriert Blatt, Proben mit 496 nm Laser angeregt wurden. Die Emission von DHE und DCF Farbstoff wurde bei 500-600 nm eingesetzt, um die möglichen Interferenzen mit Chloroplasten Auto-Fluoreszenz Signale zu vermeiden. Pigment Auto-Fluoreszenz aus Chloroplasten wurden von 700-800 nm nachgewiesen. Nach 3 Minuten UV-stress, Signale der ROS-Farbstoff in PNC und Puffer-infiltriert Blattproben separat überwacht wurden. Im Vergleich zu den keine-Nanopartikel Puffer Kontrolle (NNP), infiltriert PNC Blätter zeigten deutlich weniger ROS aktiviert DCF Farbstoff Fluoreszenzsignal(Abbildung 6). Ähnliche Ergebnisse wurden auch gefunden, mit dem Superoxid Anion aktiviert DHE Farbstoff, wo PNC infiltriert Blätter hatte deutlich weniger DHE Farbstoff Intensität als Puffer Kontrolle Blätter (Abb. 6B) infiltriert.
PNC-CAT mimetische Aktivität assay . Test der PNC Aufräumvorgang H2O2 wurde im Protokoll Abschnitt 8 beschrieben. Eine Abnahme der Resorufin, was darauf, dass H2O2 -Ebene in das Reaktionsgemisch mit PNC (Abbildung 7) beobachtet wurde hindeutet, bestätigt die Katze mimetische Aktivität des synthetisierten PNC.
Abbildung 1 : Synthese und Charakterisierung von PNC. A. Färbung der Cerium-Nitrat, Poly Acrylsäure (PAA), Mischung aus Cerium Nitrat und PAA, und die synthetisierten PNC (PAA beschichtet Cerium-oxid-Nanopartikel, hellgelb). B. Absorptionsspektrum des PNC durch UV-VIS-Spektrophotometrie gemessen. C. hydrodynamisches Durchmesser und Zeta potential der synthetisierten PNC. Meine ± Standardfehler (n = 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : PNC Kennzeichnung mit Fluoreszenzfarbstoff DiI. A. PNC (hellgelb) und DiI färben gekennzeichneten PNC-Lösung (DiI-PNC, rosa). B. Absorptionsspektrum der DiI-PNC-Lösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Blatt-Lamina Infiltration von PNC oder DiI-PNC. A. A. Thaliana Blatt vor Infiltration. Die Lösung in die Spritze ist DiI-PNC. B. Blatt mit DiI-PNC infiltriert. C. die restliche Lösung aus der Blattoberfläche mit heiklen Aufgabe Reinigungstücher. D. gereinigt A. Thaliana Blatt mit DiI-PNC infiltriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Vorbereitung der Probe Folien Blatt. A. Mikroskopie Objektträger mit Erbsen Größe Beobachtung Gele. B. Schieben Sie B. mit flachen Beobachtung Gele. C. Schieben Sie C. mit flachen Beobachtung Gel mit einem Brunnen in der Mitte. D. Schieben Sie mit Blattscheiben im Beobachtung Gel gut gefüllt mit Perfluorodecalin (PFD) Lösung. E. Folie mit Blattscheiben von Deckglas immobilisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Imaging DiI-PNC in Blatt Mesophyll Zellen über konfokalen Mikroskopie. A. Leaf Probe wird auf einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem 40 X Wasser eintauchen Objektiv montiert. B. einem confocal Mikroskop dient für imaging-DiI-PNC und Chloroplasten. C. Chloroplast Auto-Fluoreszenz wird im Puffer infiltriert Blattproben ohne Nanopartikel (NNP) aufgezeichnet. D. DiI-PNC Signal und Chloroplasten Auto-Fluoreszenz wird in DiI-PNC infiltriert Blattproben abgebildet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Überwachung PNC ROS in Planta über konfokalen Mikroskopie Aufräumvorgang. A. DCF Fluoreszenzfarbstoff (zur Überwachung der allgemeinen ROS-Signal) ist deutlich geringer im Mesophyll Zellen infiltriert PNC Pflanzen als Puffer-Steuerelement (keine Nanopartikel, NNP). B. reduziert DHE fluoreszierenden Farbstoff (zur Überwachung der Superoxid-Anion) im Mesophyll Zellen infiltriert PNC Anlagen im Verhältnis zu dem Puffer Kontrolle (NNP). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Katalase (CAT) mimische Aktivität der PNC. In Anwesenheit von Meerrettich Peroxidase die fluoreszierende Sonde reagiert mit Wasserstoffperoxid und ist Resorufin (Extinktion 560 nm) umgewandelt. Absorption von Resorufin, was bezeichnend für Wasserstoffperoxid Ebenen, wurde überwacht, bei 560 nm. PNC zeigte eine Katze mimetische Aktivität. Meine ± SE (Standardfehler) (n = 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir PNC Synthese, Charakterisierung, Fluoreszenzfarbstoff Kennzeichnung und konfokale Imaging der Nanopartikel im Mesophyll Pflanzenzellen ihre in Vivo ROS Aufräumvorgang Aktivität aufweisen. PNC werden aus einer Mischung von Cerium Nitrat und Ammonium Hydroxid-PAA Lösung synthetisiert. PNC zeichnen sich durch Absorption Spectrophotomery und die Konzentration über Bier-Lamberts Gesetz ermittelt. Zeta mögliche Messungen bestätigt die negativ geladene Oberfläche des PNC zur Verbesserung der Lieferung an Chloroplasten8. Kennzeichnung von PNC mit einem Fluoreszenzfarbstoff DiI ermöglicht in Vivo Bildgebung durch konfokale Mikroskopie im Mesophyll Blattzellen wo die Nanopartikel hohe ns1 mit Chloroplasten zeigen. DHE und DCF fluoreszierende Farbstoffe verwenden, haben wir diese PNC Handlung als ein potenter Fänger von Superoxid-Anion und ROS in Vivobestätigt.
Die Methode zur Synthese von PNC ist eine einfache schrittweise Prozedur, die Cerium oxid-Nanopartikel mit kontrollierten Größe, negative Ladung und ROS Aufräumvorgang Fähigkeiten16generiert. Andere Methoden, wie z. B. thermische Hydrolyse, erfordern hohe Temperaturen und teure Chemie Anlagen21,22. Die Synthese und Charakterisierung von PNC ist eine kostengünstige Methode mit gemeinsamen Laborausrüstung durchgeführt. Es erfordert keine steile Lernkurve im Vergleich mit molekularen Methoden in Anlagen mit Überexpression des eine antioxidative Enzym, z.B. SOD, APXund CAT, für Aufräumvorgang ROS in Modell Systeme23Arten. PNC ist eine robuste, wasserlösliche ROS katalytische Schnitzeljagd, die nicht mühsam Klonen erfordern und Umwandlung Methoden, mit die die Pflanze genetische Lenkbarkeit und verfügbaren Molekulare Toolkit abhängig sind.
Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Spritze-basierte Infiltration des Mesophyll Blattzellen mit PNC. Infiltration von Nanopartikeln in lebenden Pflanzen sollte vorsichtig erfolgen, zur Vermeidung von Schäden an Blatt24. So, wie in Schritt 4 Protokoll der Methoden drücken Sie vorsichtig gegen die Blattoberfläche mit der Spritze, reißen oder Punktion der abaxial Blattoberfläche zu vermeiden. Es ist besser, von der abaxial Oberfläche von A. Thaliana Blatt zu infiltrieren, da sie höheren Stomata Dichte als die adaxial Oberfläche25,26hat. Darüber hinaus eine gepufferte Lösung von PNC oder DiI-PNC in der physiologischen pH-Bereich (~ pH 7,5) sollte verwendet werden, während Blatt Lamina Infiltration. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist das Studium Pflanzengewebe die entsprechende Konzentration von PNC zuweisen. In diesem Protokoll war 50 mg/L von PNC nicht giftig für A. Thaliana Blätter gleichzeitig katalytische PNC ROS abfangen. Einige Einschränkungen der aktuellen Nanopartikel Lieferung Methode gelten (1) nicht für Pflanzenarten, die dick und wachsartige Nagelhaut oder niedrige Stomata dichten (2) nicht skalierbar für Anwendungen im Feld (3) die hohen Kosten für ein konfokalen Mikroskopie-System zur Überwachung in Vivo Nanopartikel Verteilung und ROS abfangen.
Dieses Protokoll demonstriert die Anwendung von ROS scavenging PNC für Studium und abiotische Stresstoleranz von Pflanzen durch eine einfache Methode der Blatt-Lamina-Infiltration zu verbessern. ROS-Ansammlung wird begleitet von abiotischen Stress in Pflanzen, die wiederum reduziert die Pflanze Photosynthese, Wachstum und Ertrag8,27,28. Pflanze Genveränderungen Methoden für ROS Manipulation in Vivo sind oft begrenzt, Modell Arten zu Pflanzen, während PNC ROS Aufräumvorgang hat das Potenzial, auf diverse Wildtyp Pflanzenarten angewendet werden. Blatt-Lamina-Infiltration ist eine praktische Forschungsmethode ROS Aufräumvorgang in Blatt-Geweben für Verständnis und engineering-Werk abiotische Stresstoleranz erhöhen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der University of California, Riverside und USDA nationalen Institut für Lebensmittelwissenschaften und Landwirtschaft, Luke Projekt 1009710 JPG unterstützt. Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation unter Grant Nr. 1817363 zu JPG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
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