Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese e caracterização de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) de ROS (espécies reativas de oxigênio) eliminação na vivo, nanoceria de imagens em tecidos vegetais por microscopia confocal e na vivo monitoramento de nanoceria ROS eliminação pela microscopia confocal.
Abstract
Acumulação de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio é uma marca registrada da resposta ao estresse abiótico planta. ROS desempenham um papel duplo em plantas actuando como sinalização moléculas em níveis baixos e danificando moléculas em níveis elevados. Acumulação de ROS em plantas estressadas pode danificar metabolitos, enzimas, lipídeos e DNA, causando uma redução do crescimento das plantas e o rendimento. A capacidade de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) para eliminar cataliticamente ROS na vivo fornece uma única ferramenta para compreender e tolerância de estresse abiótico bioengineer planta. Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar e caracterizar nanoceria revestido poli (acrílico), ácido (PNC), interface as nanopartículas com plantas através de infiltração de lâmina de folha e monitorar sua distribuição e eliminação na vivo usando confocal de ROS microscopia. Atuais ferramentas moleculares para manipular a acumulação de ROS em plantas são limitadas a espécie de modelo e exigem métodos de transformação laborioso. Este protocolo para na vivo ROS eliminação tem potencial para ser aplicado ao tipo selvagem plantas com folhas largas e estrutura da folha como Arabidopsis thaliana.
Introduction
Nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) são amplamente utilizadas em organismos vivos, de pesquisa básica de bioengenharia, devido a suas espécies distintas catalítico reativas de oxigênio (ROS) eliminação de capacidade1,2,3. Nanoceria ter ROS eliminação habilidades devido a um grande número de vagas de superfície oxigênio que alternam entre dois oxidação Estados (Ce3 + e4 +Ce) 4,5,6. Os Ce3 + oscilação títulos efetivamente eliminar ROS enquanto as cepas de treliça em nanoescala promovem a regeneração destes sites de defeito através de redox reações7de ciclismo. Nanoceria também têm sido usados recentemente para estudar e engenharia planta função8,9. Plantas sob estresse abiótico experimentam acúmulo de ROS, causando danos oxidativos de lipídios, proteínas e DNA10. Em plantas da . thaliana , nanoceria catalítico eliminação de ROS na vivo leva a fotossíntese da planta melhorada sob alta luz, calor e refrigeração salienta8. Aplicação nanoceria para o solo também aumentos atirar rendimento da biomassa e o grão de trigo (Triticum aestivum)11; as plantas de canola (Brassica napus) tratadas com nanoceria têm maior biomassa de plantas sob estresse sal12.
Nanoceria oferecer bioengineers e biólogos da planta uma ferramenta baseada em nanotecnologia para compreender as respostas de estresse abiótico e aumentar a tolerância de estresse abiótico de planta. Na vivo ROS eliminação capacidades do Nanoceria são independentes das espécies de plantas, e a entrega fácil nos tecidos vegetais tem o potencial para permitir ampla aplicação fora de organismos modelo. Ao contrário de outros métodos baseados em geneticamente, nanoceria não exigem gerando linhas de planta com a superexpressão de enzimas antioxidantes para ROS maior eliminação de capacidade13. Infiltração de lâmina de folha de nanoceria de plantas é uma abordagem prática para a pesquisa em laboratório.
O objetivo geral do presente protocolo é para descrever 1) a síntese e caracterização de poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC), 2) a entrega e rastreamento de PNC em toda as células da folha e 3) a vigilância de eliminação ROS PNC-habilitado em vivo. Neste protocolo, poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC) são sintetizados e caracterizada pelo seu espectro de absorção, diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta. Nós descrevemos um método de infiltração de lâmina de folha simples para lançar PNC para fábrica de tecidos da folha. Para imagens em vivo de nanopartículas distribuição dentro das células do mesofilo, uma tintura fluorescente (DiI) foi usada para rotular PNC (DiI-PNC) e observar as nanopartículas através de microscopia de fluorescência confocal. Finalmente, vamos explicar como monitorar na vivo PNC ROS eliminação através de microscopia confocal.
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Protocol
1. cultivo de plantas da . thaliana
- A. thaliana semear em potes descartáveis 5 cm x 5 cm, preenchidos com mistura de solo padrão. Colocar 32 destes vasos em uma bandeja de plástico cheia de água (~ 0,5 cm de profundidade) e transferir a bandeja plástica com as plantas em uma câmara de crescimento de planta.
- Definir o crescimento câmara configurações como segue: 200 µmol/ms fotossinteticamente ativa radiação (PAR), 24 ± 1 ° C de dia e 21 ± 1 ° C à noite, 60% de umidade e regime de luz de dia/noite h 14/10, respectivamente.
- Diluir cada pote para deixar apenas uma planta individual após uma semana de germinação. Tome nota para manter as mudas com tamanho similar em cada vaso.
- Água os potes deitando água de torneira diretamente na bandeja de plástico uma vez a cada dois dias. Crescem as plantas durante quatro semanas. A. thaliana plantas estão prontas para utilização posterior.
2. síntese e caracterização de PNC
- Pesar de 1,08 g de nitrato de cério (III) e dissolvê-lo em 2,5 mL de água de grau biologia molecular em um tubo cónico de 50 mL.
- Pesa 4,5 g de ácido poli (acrílico) e dissolvê-lo em 5 mL de água de grau biologia molecular em um tubo cónico de 50 mL.
- Misture estas duas soluções completamente a 2.000 rpm durante 15 minutos usando um mixer digital de vórtice.
- Transferi 15 mL de solução de hidróxido de amônio (7,2 M) para um copo de vidro de 50 mL.
- Ao agitar a 500 rpm, adicionar a mistura de passo 2.3 gota a gota para a solução de hidróxido de amônio e agitar a 500 rpm, à temperatura ambiente durante 24 horas em uma coifa.
- Cubra o copo com um pedaço de papel para evitar a perda substancial de solução durante a reação durante a noite.
- Após 24 h, transferir a solução resultante para um tubo cónico de 50 mL e centrifuga-lo a 3.900 x g, durante 1 h remover quaisquer detritos possíveis e grandes aglomerados.
- Transferir este 22,5 mL da solução sobrenadante em três filtros de 15 mL 10 kDa e preencher o restante do filtro com água molecular da classe tornar-se uma diluição total de 45 mL.
- Purificar a solução sobrenadante de polímeros grátis e outros reagentes com uma centrífuga de bancada, adicionando o sobrenadante para um filtro de 15 mL 10 kDa e centrifugar 3.900 x g por 15 min. Repita este passo pelo menos seis vezes.
- Medir a absorvância de eluente em cada ciclo com um espectrofotômetro UV-VIS de 220-700 nm para não garantir nenhuma enciclopédia polímeros e outros reagentes estão presentes na solução final PNC.
- Pegue a solução PNC coletada para a seringa de 5 mL e filtrá-la contra um filtro de seringa de tamanho de poro de 20 nm. Recolha a solução PNC filtrada em um tubo cónico de 50 mL.
- Pegue uma solução diluída de PNC final em uma cubeta plástica e medir a absorvância com o espectrofotômetro UV-VIS de 220-700 nm. Pico de absorbância PNC é a 271 nm.
- Calcule a sua concentração, usando a lei de Beer-Lambert: A = εCL. A é a absorvância do valor de pico para uma determinada amostra, ɛ é o coeficiente de absorção molar do PNC (cm-1 M-1), L é o comprimento do percurso óptico (largura da cubeta, neste método de 1 cm) e C é a concentração molar de nanopartículas medidas.
- Medir o diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta do PNC sintetizado usando uma partícula tamanho e zeta potencial analisador (Figura 1).
- Armazene a solução final do PNC no frigorífico (4 ° C) até utilização posterior.
Nota: Por favor, consulte Wu et al. 8 para mais detalhes do protocolo sobre caracterização de PNC.
3. rotulagem PNC com corante fluorescente DiI
- Misture a 0,4 mL de 5mm (58 mg/L) PNC com 3,6 mL de biologia molecular da classe água em um frasco de vidro de 20 mL e agitar a 500 rpm.
- Adicionar 24 µ l 1 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine solução de tintura de perclorato (DiI, 2,5 mg/mL; diluído em DMSO) em µ l 176 de DMSO (Dimetilsulfóxido) para fazer a solução de tintura de DiI.
- Adicione o corante DiI gota a gota à solução de PNC, agitando a 1.000 rpm por 1 min à temperatura ambiente.
- Transfira esta mistura resultante em um filtro de kDa 15 mL 10 e encher o tubo até o topo com água de grau biologia molecular para fazer a diluição total 15 mL.
- Purifica o DiI rotulado solução PNC (DiI-PNC) de DMSO e qualquer tintura de DiI livre possível por uma centrifugação de bancada com o filtro de kDa 15 mL 10 a 3.900 x g por 5 min.
- Repita a etapa 3.5 pelo menos cinco vezes.
- Filtre as soluções DiI-PNC finais através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 20 nm.
- Medir a absorvância da final DiI-PNC por espectrofotometria UV-VIS e calcular sua concentração de acordo com a lei de Beer-Lambert (Figura 2). Consulte Passo 2.13 para mais detalhes.
- Armazená-lo em um refrigerador a 4 ° C para utilização posterior.
4. infiltração da planta deixa com PNC
- Adicionar 0,1 mL de infiltração buffê (100mm TES, 100 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado pelo HCl) em 0,9 mL de solução PNC ou DiI-PNC de 0,5 mM e vórtice-lo. Use uma solução de 10 mM de tampão de infiltração TES como controlo negativo.
- Transferência de 0,2 mL da solução de infiltração de PNC ou DiI-PNC a uma seringa de agulhas esterilizadas 1ml. Torneira para remover quaisquer bolhas de ar possível.
- Recupere a planta da câmara de crescimento antes de infiltração com nanopartículas para evitar o fechamento de estômatos possível sob condições de luz do quarto.
- Antes da infiltração, medir o teor de clorofila das folhas da . thaliana com tamanho similar usando um medidor de clorofila. Medir cada folha com três repetições (cada replicação consistindo de pelo menos três medições)14. Escolha que a a. thaliana deixa com conteúdo de clorofila semelhante para o experimento de infiltração.
- Infiltrar as folhas lentamente com a solução recentemente preparada de PNC ou DiI-PNC pressionando suavemente a ponta da seringa auto-injeções contra a parte inferior da lâmina da folha (abaxial lado) e pressione o êmbolo(Figura 3).
- Gentilmente Limpe a excesso solução que permanece na superfície da lâmina de folha (Figura 3B) usando um limpador de delicada tarefa (Figura 3C) e rotular a planta. Utilize toalhetes de delicada tarefa nova para cada grupo de folhas.
- Mantenha os infiltrados a. thaliana plantas no banco para adaptação de folha e incubação com PNC ou DiI-PNC para 3h.
Nota: Plantas infiltradas a. thaliana então estão prontas para utilização posterior (Figura 3-D).
5. preparação de amostras de folha para a microscopia Confocal
- Rolo uma quantidade do tamanho de ervilha de observação do gel para um raio de 1 cm(Figura 4)e então espalhe até 1 mm fina sobre uma lâmina de vidro (Figura 4B).
- Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,3 cm) para cortar uma secção circular no centro do gel observação sobre a lâmina de vidro (Figura 4C).
- Enchem o corte bem inteiramente perfluorodecalin (PFD) para resolução de imagem mais profunda e melhor confocal nos tecidos da folha.
- Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,2 cm) coletar os discos de folha do DiI-PNC adaptado se infiltrou a. thaliana plantas (Figura 4-D).
- Montar o disco de folha no PFD preenchido Encare o lado infiltrado (abaxial) da folha.
- Colocar uma lamela quadrada em cima do disco de folha e pressione suavemente sobre a lamela de slide uniformemente para selá-lo com o poço do gel de observação e garantir que não há bolhas de ar permanecem presos (Figura 4E).
6. imaging DiI-PNC em tecidos de folha por microscopia Confocal
- Use uma lente de objetiva 40 X em um laser invertido microscópio confocal de varredura.
- Deixe duas a três gotas de DDQ2O na parte superior a 40 X da lente objetiva.
- Coloque o slide de amostra de folha DiI-PNC infiltrou-se preparado em cima o invertido 40 X lente objetiva.
- Certifique-se de lado a lamela, mas não o vidro deslizar contato diretamente com o ddH2O na lente.
- Encontre uma região de interesse na amostra ao microscópio com luz laser ou campo brilhante.
- Inicie o software do microscópio e ligue o laser de argônio (fixado em 20%).
- Defina o pinhole para coletar uma fatia óptica inferior a 2 µm e uma média de linha de 4.
- Imagem da amostra com as configurações do microscópio confocal: excitação de laser 514 nm (30%); Espessura de corte de Z-pilha: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (para a imagem latente de DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (para a imagem latente do cloroplasto).
- Leve imagens confocal representante de amostras de folhas de indivíduos diferentes, um mínimo de três repetições biológicas.
7. imaging PNC na vivo ROS eliminação por microscopia Confocal
- Preparar 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, um corante para indicar uma ROS geral) e dihydroethidium de 10 µM (DHE, um corante para indicando o anião superóxido) corantes em buffer de infiltração de TES (pH 7,5) em tubos de microcentrifuga de 1,5 mL, separadamente.
- Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,2 cm) para coletar a folha discos do PNC adaptado se infiltrou a. thaliana plantas.
- Use a ponta afiada da pinça para fazer três ou quatro furos nos discos folha para acelerar o processo de carregamento de tinta.
- Transferência da folha discos para tubos microcentrifuga com H2DCFDA e DHE separadamente e incube por 30 minutos sob a escuridão.
- Após a incubação, enxágue a folha discos com DDQ2O três vezes e montar ele no vidro deslizar com observação gel (ver protocolo seção 5).
- Colocar o slide no microscópio confocal e manualmente o foco para uma região de células do mesofilo de folha. Consulte o protocolo seção 6 para obter detalhes.
- Expor os discos de folha para o UV-A (405 nm) laser para 3 min gerar ROS e registrar a mudança de intensidade do sinal ROS em séries temporais ("xyt") por disco de folha.
- Imagem do disco de folha com as configurações do microscópio confocal: 40 X água objetivo; excitação de laser 496 nm; PMT1: 500-600 nm (DHE DCFDA corante detecção e); PMT2: 700-800 nm (para a deteção de cloroplastos). Use uma planta infiltrada com solução de tampão só da infiltração como controlo negativo.
8. PNC eliminação de H2O2em vitro
- Realizar a atividade mimética CAT (catalase) do sintetizado PNC em vitro , seguindo os métodos em publicações anteriores3,8,15
- Adicionar 45,4 µ l de 1 x TES de infiltração de buffer (10mm TES, 10 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado pelo HCl), PNC (60 nM, 3 µ l) e H2O2 (2 µM, 1 µ l) em um poço (prato bem fundo redondo branco 96) e misture suavemente pipetando.
- Adicionar 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine (trabalho concentração 100 µM, 0,5 µ l) e a peroxidase de rábano (HRP; concentração de trabalho 0,2 U/mL, 0,1 µ l) dentro do poço, delicadamente misturar pipetando e incube-lo por 30 min. 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reage com o H2O2 e é convertido em resorufin na presença de HRP.
- Embrulhe o prato com papel de alumínio para evitar a luz durante a incubação.
- Prepare um controlo negativo usando amortecedor da reação ou água para substituir o H2O2.
- Exceto para a solução-mãe, prepare todas as outras soluções à temperatura ambiente.
- Após a incubação, com um leitor de placas, monitorar a absorvância a 560 nm usar resorufin para indicar o nível de H2O2. Regime de tempo definido em 0, 2, 5, 10, 20 e 30 min.
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Representative Results
Caracterização e síntese PNC .
PNC foram sintetizados, purificada e caracterizada a seguir o método descrito na seção de protocolo 2. Figura 1 A mostra a coloração das soluções de nitrato de cério, PAA, a mistura de nitrato de cério e PAA e PNC. Uma mudança de cor do branco para amarelo claro é vista depois de PNC é sintetizado. Após a purificação com um filtro de 10 kDa, PNC foram caracterizados com um espectrofotômetro UV-VIS. Observou-se um pico de absorbância para PNC em 271 nm (Figura 1B). O eluente final também foi medido com UV-VIS para confirmar que os químicos não reagidos foram lavados durante a purificação. O diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta do PNC sintetizado foram medidos com uma partícula sizer e zeta potencial analyzer (Figura 1C).
PNC etiquetando com tintura de DiI .
Para determinar a distribuição de nanopartículas na vivo, PNC foram rotulados com um corante fluorescente de DiI seguindo o método descrito na seção de protocolo 3. Tintura de DiI incorpora dentro do revestimento do PNC espontaneamente desde que ele pode encapsular em domínios de hidrofóbicos dentro dos revestimentos de polímero de nanoceria16. Depois de adicionar o corante DiI para a solução PNC, uma cor rápida mudar para rosa foi observada(Figura 2). A DiI rotulado PNC foram então purificada com um filtro de 10 kDa e caracterizada por uma espectrofotometria UV-VIS. Três picos claros de absorvância para o DiI rotulado PNC foram observados (Figura 2B). O eluente final foi medido por espectrofotometria UV-VIS para confirmar que os químicos não reagidos foram danificados durante a purificação.
Infiltração de lâmina de folha.
PNC ou DiI-PNC foram entregues em folhas da . thaliana através do método de infiltração de lâmina de folha, conforme descrito na seção de protocolo 4. Folha foi infiltrada em quatro pontos diferentes para assegurar que a área cheia de folhas foi perfundida com solução PNC(Figura 3). Qualquer solução remanescente foi removida da superfície da folha (Figura 3B e 3 C). A cor da folha alterado durante a infiltração de verde para verde mais escuro (Figura 3-D). A seringa delicadamente foi pressionada contra a folha para evitar danos físicos.
Preparação da amostra de folha para microscopia de fluorescência.
Amostras de folhas foram montadas em lâminas de vidro dentro de um gel de observação feita bem cheio de PFD. Após a laminagem do gel de observação do tamanho de ervilha no slide (Figura 4A e 4B), tornou-se um poço no meio do gel plano (Figura 4C). Em seguida, o disco de folha preparada na hora foi transferido para o poço previamente preenchido com solução PFD (Figura 4-D). Uma lamela foi usada para imobilizar a amostra de folha no slide (Figura 4E).
Imagem latente confocal de DiI-PNC em vivo .
Folhas da . thaliana DiI-PNC infiltrado foram usadas para determinar a distribuição de DiI-PNC em células do mesofilo folha através de imagem latente confocal (Figura 5A e 5B). Para visualizar o colocalization entre o DiI-PNC e cloroplastos, amostras de folha DiI-PNC se infiltrou estavam animadas com um laser de 514 nm. A emissão de DiI-PNC foi fixada em 550-615 nm para evitar a possível interferência de sinais de pigmentos do cloroplasto após ~ 650 nm17. A autofluorescência da clorofila de cloroplastos foram detectados de 700-800 nm. As configurações da imagem latente confocal foram definidas (poder do laser e ganho) para certificar-se de que não há sinais de tintura DiI foram detectados na amostra de folha de controle (infiltrada com buffer único) (Figura 5-C). O colocalization de DiI-PNC com cloroplastos em células do mesofilo de folha pode ser observado pela imagem sobreposição de DiI-PNC detectado e autofluorescência de pigmentos do cloroplasto (Figura 5-D).
Imagem latente confocal de PNC ROS eliminação na vivo .
PNC em solução-tampão 10mm TES foram entregues em folhas da . thaliana através do método de infiltração de lâmina de folha, conforme descrito na seção de protocolo 7. DHE (dihydroethidium) e corantes fluorescentes da H2DCFDA (2 ′, diacetato de 7 '-dichlorodihydrofluorescein) são usados para visualizar ROS em tecidos de planta8,18. H2DCFDA é conhecido para ser convertido em fluorescente DCF (2 ', 7 '-diclorofluoresceína, um indicador do grau de estresse oxidativo geral) devido a clivagem dos grupos acetato por ROS19. Ela é uma tintura mais específica para superóxido ânion tendo seu produto fluorescente (2-hydroxyethidium) aumenta mediante reação com o ânion superóxido20. Na vivo ROS eliminação habilitada pelo PNC foi monitorado em discos de folha medindo DHE e DCF tintura fluorescência intensidade alterações (6B e figuras 6A). PNC se infiltrou folha amostras estavam animadas com 496 nm do laser. A emissão de corante DHE e DCF foi fixada em 500-600 nm para evitar a possível interferência com sinais de autofluorescência de cloroplasto. Autofluorescência de pigmentos de cloroplastos foram detectados de 700-800 nm. Depois de 3 minutos de UV salientar, a tintura ROS sinais no PNC e reserva-se infiltrou amostras de folhas foram monitoradas separadamente. Comparado com o controle de buffer não-nanopartículas (NNP), PNC se infiltrou folhas mostrou significativamente menos ROS-ativado fluorescente DCF tintura sinal (Figura 6A). Resultados semelhantes foram encontrados também com o superóxido ativado ânion DHE corante, onde folhas PNC infiltrado tinham significativamente menos intensidade corante DHE do tampão infiltrou-se folhas de controle (Figura 6B).
Ensaio da atividade mimética PNC CAT . Ensaio de PNC eliminação de H2O2 foi descrito no protocolo seção 8. Um decréscimo de resorufin que indica o nível de H2O2 na mistura reacional contendo PNC foi observada (Figura 7), confirmando a atividade mimética CAT o PNC sintetizada.
Figura 1 : Síntese e caracterização de PNC. R. coloração de nitrato de cério, ácido acrílico de poli (PAA), mistura de nitrato de cério e PAA e o PNC sintetizado (nanopartículas de óxido de cério PAA revestido, luz-amarelo). B. espectro de absorbância de de PNC medido por espectrofotometria UV-VIS. C. Hydrodynamic diâmetro e zeta potencial do PNC sintetizada. Quer dizer ± erro-padrão (n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : PNC rotulagem com corante fluorescente DiI. R. PNC (amarelo claro) e DiI tintura rotulada solução PNC (DiI-PNC, rosa). B. espectro de absorvância da solução DiI-PNC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Folha infiltração da lâmina de PNC ou DiI-PNC. A. a. thaliana folha antes de infiltração. A solução dentro da seringa é DiI-PNC. B. folha infiltrada com DiI-PNC. C. a solução restante da superfície da folha com a delicada tarefa de limpeza limpa. D. limpar a. thaliana folha infiltrada com DiI-PNC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Preparação de slides de amostra folha. Lâmina de vidro r. microscopia com géis de observação de tamanho de ervilha. B. Deslize com géis simples observação. C. Slide com gel de observação plana, tendo um poço no meio. D. deslizar com discos de folha no gel observação bem preenchido com solução perfluorodecalin (PFD). E. Slide com discos de folha imobilizados por lamínula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Imagem latente DiI-PNC no mesofilo da folha células através de microscopia confocal. Amostra r. Leaf é montada em um microscópio confocal invertido tendo uma lente de imersão de água X 40. B. um microscópio confocal é usado para imagiologia DiI-PNC e cloroplastos. Chloroplast C. autofluorescência é gravado em amostras de folha de reserva que se infiltrou sem nanopartículas (NNP). M. DiI-PNC sinal e cloroplasto autofluorescência é fotografada em amostras de folha DiI-PNC se infiltrou. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Monitoramento PNC ROS eliminação em planta através de microscopia confocal. Tintura fluorescente r. DCF (para monitoramento de sinais em geral ROS) é significativamente menor nas células do mesofilo de plantas PNC infiltrado que controle amortecedor (sem nanopartículas, NNP). Fluorescente de B. reduzido DHE tingir (para monitorar o anião superóxido) nas células do mesofilo de plantas PNC infiltrou-se em relação ao controle de buffer (NNP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Atividade mimética de catalase (CAT) da PNC. Na presença de peroxidase de rábano, a sonda fluorescente reage com peróxido de hidrogênio e é convertida em resorufin (absorvância 560 nm). Absorvância do resorufin, que é indicativo de níveis de peróxido de hidrogênio, foi monitorada em 560 nm. PNC mostrou uma atividade mimética da CAT. Média ± SE (erro padrão) (n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos PNC síntese, caracterização, tintura fluorescente rotulagem e imagem latente confocal das nanopartículas dentro de células do mesofilo de vegetais para expor seu na vivo ROS eliminação atividade. PNC são sintetizados a partir de uma mistura de PAA solução de hidróxido de amónio e nitrato de cério. PNC caracterizam-se por spectrophotomery de absorção e a concentração de determinada usando a lei da cerveja-Lambert. Medições de potencial zeta confirmaram a superfície carregada negativamente do PNC para melhorar a entrega de cloroplastos8. Rotulagem do PNC com um corante fluorescente de DiI permite imagens na vivo pela microscopia confocal dentro de células do mesofilo folha onde as nanopartículas apresentam altos níveis de colocalization com cloroplastos. Usando corantes fluorescentes DHE e DCF, confirmamos esse ato PNC como um potente limpador de ânion superóxido e ROS na vivo.
O método para a síntese de PNC é um procedimento passo a passo simples que gera nanopartículas de óxido de cério com tamanho controlado, carga negativa e ROS eliminação recursos16. Outros métodos, como a hidrólise térmica, requerem altas temperaturas e química caro equipamento21,22. A síntese e caracterização de PNC é um método de baixo custo, realizado com equipamentos comuns de laboratório. Não exige uma curva de aprendizagem em comparação com métodos moleculares em plantas com base em superexpressão de uma enzima antioxidante, por exemplo, SOD, APXe CAT, para eliminação de espécies ROS no modelo de sistemas23. PNC é um robusto, water-soluble ROS catalítica ao tesouro que não exigirão a clonagem laborioso e métodos de transformação que são dependentes de rastreabilidade genética da planta e kit de ferramentas molecular disponível.
Um passo crítico no presente protocolo é baseado em seringa infiltração de células do mesofilo de folha com PNC. Infiltração de nanopartículas de plantas vivas deve ser feita com cuidado para evitar danos físicos a folha24. Assim, como no protocolo passo 4 dos métodos, empurre suavemente contra a superfície da folha com a seringa para evitar rasgar ou furar a superfície abaxial da folha. É melhor se infiltrar da superfície abaxial da folha a. thaliana , uma vez que tem maior densidade estomática do que a superfície adaxial25,26. Além disso, uma solução tamponada de PNC ou DiI-PNC dentro da faixa de pH fisiológico (~ pH 7,5) deve ser utilizado durante a infiltração de lâmina de folha. Outro passo crítico neste protocolo é aplicar a concentração adequada de PNC no tecido de planta estudada. Neste protocolo, 50 mg/L de PNC não era tóxico para folhas da . thaliana permitindo catalítico PNC ROS eliminação. Algumas limitações do método atual para a entrega de nanopartículas 1) não são aplicáveis para plantar espécies ter cutículas grossas e cerosas ou baixa densidade estomática, 2) não escaláveis para aplicações no campo, 3) o alto custo de um sistema de microscopia confocal para monitorar na vivo nanopartículas distribuição e eliminação de ROS.
Este protocolo demonstra a aplicação de ROS eliminação PNC para estudar e melhorar a tolerância de estresse abiótico em plantas através de um método fácil de infiltração de lâmina de folha. Acumulação de ROS é acompanhada por estresses abióticos em plantas, que por sua vez reduz a fotossíntese da planta, crescimento e rendimento de27,8,28. Métodos de modificação genética planta ROS manipulação na vivo muitas vezes são limitados a modelo espécies de plantas, enquanto PNC ROS-eliminação tem potencial para ser aplicada a espécies de plantas de diverso tipo selvagem. Infiltração de lâmina de folha é um método de pesquisa prática para aumentar a eliminação de ROS em tecidos de folha para a compreensão e a tolerância de estresse abiótico de planta de engenharia.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Riverside e USDA National Institute of Food e agricultura, projeto Hatch 1009710 para J.P.G. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. 1817363 de J.P.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
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