Summary
Здесь мы представляем собой протокол для синтеза и характеристика наночастиц оксида церия (nanoceria) для ROS (реактивнооксигенных видов) очистки в естественных условиях, nanoceria изображений в тканях растений confocal микроскопии, и в естественных условиях мониторинг nanoceria Рось очистки от конфокальной микроскопии.
Abstract
Накопление реактивнооксигенных видов (ров) является отличительной чертой реакцию растений абиотического стресса. ROS играть двойную роль в растениях, действуя в качестве сигнальных молекул на низком уровне и повреждения молекул на высоком уровне. Накопление рос в стресс растений могут повредить метаболиты, ферменты, липиды и ДНК, вызывая сокращение роста растений и урожай. Способность наночастиц оксида церия (nanoceria) каталитически Мусоробот рос в естественных условиях дает уникальный инструмент для понимания и биоинженер завод абиотическому стрессу. Здесь мы представляем протокол синтезировать и характеризуют поли (акрил) кислоты с покрытием nanoceria (НГП), интерфейс наночастиц с растениями через листовой пластинки инфильтрации и следить за их распределения и очистки в естественных условиях с помощью конфокальной ROS микроскопия. Текущий молекулярной инструменты для манипулирования ROS накопления в растениях ограничиваются модель видов и требуют кропотливого преобразования методов. Этот протокол в естественных условиях рос очистки имеет потенциал для применения к дикого типа растения с широким листьями и структура листьев как Arabidopsis thaliana.
Introduction
Наночастицы оксида церия (nanoceria) широко используются в живых организмов, от фундаментальных исследований к биоинженерии, из-за их собственный каталитического реактивнооксигенных видов (ров) очистки способность1,2,3. Nanoceria имеют ROS очистки способности из-за большого числа вакансий поверхности кислорода, которые чередуются между двумя окисления государств (Ce3 + и Ce4 +) 4,5,6. Ce3 + оборванных связей эффективно собирать рос в то время как решетка штаммов на наноуровне способствуют регенерации этих дефектов сайтов через окислительно-восстановительные реакции7Велоспорт. Nanoceria недавно использовались также для изучения и инженерии растений функция8,9. Растения абиотическому стрессу опыт накопление ROS, оксидативного повреждения липидов, белков и ДНК10. В A. thaliana растений nanoceria каталитическую очистку рос в vivo приводит к улучшение завод фотосинтеза под высокие света, тепла и охлаждения подчеркивает8. Применение nanoceria почв также увеличивает стрелять биомассы и зерна урожая пшеницы (Triticum aestivum)11; растения рапса (Brassica napus), лечение с nanoceria имеют выше биомассы растений под соль стресс12.
Nanoceria предлагают биогенетики и растений биологи средство на основе нанотехнологий понять ответы абиотического стресса и улучшения завод абиотическому стрессу. Nanoceria в в естественных условиях рос очистки возможности не зависят от видов растений, и поверхностным доставки в тканях растений имеет потенциал для включения широкого применения вне модели организмов. В отличие от других методов, основанных на генетически nanoceria не требуют генерации линий завода с гиперэкспрессия антиоксидантных ферментов для высших ROS, очистки способность13. Листовой пластинки проникновения nanoceria для растений является практический подход на основе лабораторных исследований.
Общая цель настоящего Протокола заключается в описать 1) синтез и характеристика отрицательно заряженных поли (акрил) кислоты nanoceria (НГП), 2) доставки и отслеживания НГП всей ячейки листа и 3) мониторинг очистки НГП с поддержкой рос в VIVO. В этом протоколе отрицательно заряженных поли (акрил) кислоты nanoceria (НГП) синтезируется и характеризуется их спектр поглощения, гидродинамические диаметр и Зета потенциал. Мы опишем простой лист пластинки инфильтрации способ доставить НГП в завод листовой ткани. Для изображений в vivo наночастиц распределения внутри клетки мезофилл, флуоресцентные краски (дии) был использован ярлык НГП (дии-НГП) и соблюдать наночастиц через конфокальный флуоресцентной микроскопии. Наконец мы объясним, как контролировать в vivo НГП ROS очистку через confocal микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. A. thaliana растения
- Сеять семена A. thaliana в 5 х 5 см одноразовые горшки, заполнены с стандартным почвенной смеси. Положите 32 эти горшки в пластиковый лоток с водой (~ 0,5 см Глубина) и передачи пластиковый лоток с растениями в камере роста растений.
- Настройки рост палата следующим образом: 200 мкмоль/ms фотосинтетической активного излучения (PAR), день 24 ± 1 ° C и 21 ± 1 ° C ночью, влажность 60% и светового режима день/ночь 14/10 h, соответственно.
- Тонкий каждый банк, чтобы оставить только один отдельных растений после одной недели прорастания. Принять к сведению держать саженцев с одинаковой в каждом банке.
- Воды горшки, поливая водопроводной водой непосредственно на пластиковый лоток каждые два дня. Растут растения в течение четырех недель. A. thaliana растений, пригодных для дальнейшего использования.
2. Синтез и характеристика КНП
- Весят 1.08 г нитрата церия (III) и растворить его в 2,5 мл воды класса молекулярной биологии в 50 мл Конические трубки.
- Вес 4,5 г кислоты поли (акрил) и растворяют в 5 мл воды класса молекулярной биологии в 50 мл Конические трубки.
- Смешайте эти два решения тщательно при 2000 об/мин, 15 мин, с использованием цифровой вихревой смеситель.
- Перенести стакан стекла 50 мл 15 мл раствора гидроксида аммония (7,2 М).
- Во время перемешивания на 500 об/мин, добавить смесь из шаг 2.3 каплям раствора гидроксида аммония и перемешать в 500 об/мин при комнатной температуре на 24 hr в зонта.
- Обложка стакан с куском бумаги, чтобы избежать существенные потери раствора во время ночи реакции.
- После 24 часов передать полученный раствор 50 мл Конические трубки и центрифуги на 3900 x g за 1 ч до удаления любых возможных мусора и крупных агломератов.
- Перевести этот 22,5 мл супернатанта раствора на три 15 мл 10 кДа фильтры и заполнить оставшуюся часть фильтра с молекулярного уровня воды, чтобы сделать общее ослабление 45 мл.
- Очистить супернатанта решение от свободного полимеров и других реагентов с настольная центрифуга, добавив супернатант 15 мл 10 кДа фильтрации и центрифугирования при 3900 x g 15 мин повторить этот шаг по крайней мере шесть раз.
- Измерьте absorbance элюента в каждом цикле с Спектрофотометр UV-VIS от 220-700 Нм для обеспечения нет свободного полимеры и другие реагенты присутствуют в окончательном решении НГП.
- Берут собранных НГП раствор в шприц 5 мл и фильтровать его против фильтр шприц поры размер 20 Нм. Сбор, отфильтрованный раствор НГП в 50 мл Конические трубки.
- Разбавленный раствор окончательный НГП в пластиковых кювет и измерить его поглощения с Спектрофотометр UV-VIS от 220-700 Нм. Пик поглощения НГП находится в 271 Нм.
- Рассчитать его концентрации с использованием пиво-Lambert закон: A = εCL. A это поглощение пикового значения для данного образца, ɛ коэффициент молярной абсорбции НГП (см-1 M-1), L-Длина оптического пути (кювет ширина, 1 см в этом методе), и C Молярная концентрация измеряемых наночастиц.
- Измерьте гидродинамические диаметр и Зета потенциал синтезированных НГП, используя размер и Зета потенциальных анализатора частиц (рис. 1).
- Храните окончательное решение НГП в холодильнике (4 ° C) до дальнейшего использования.
Примечание: Обратитесь к Ву и др. 8 протокол, Подробнее о характеристике НГП.
3. Маркировка НГП с флуоресцентных красителей DiI
- Смешать 0,4 мл 5 мм (58 мг/Л) НГП с 3,6 мл молекулярной биологии класса воды в стеклянный флакон 20 мл и размешать в 500 об/мин.
- Добавить 24 мкл 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3, 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлората раствор красителя (дии, 2,5 мг/мл; разбавляют в ДМСО) в 176 мкл ДМСО (диметилсульфоксид) чтобы сделать раствор красителя DiI.
- Добавьте красителя DiI каплям решение НГП, помешивая на 1000 об/мин за 1 мин при комнатной температуре.
- Перевести этот полученную смесь в 15 мл 10 кДа фильтр и заполнить трубу в верхней с молекулярной биологии класса воды, чтобы сделать общее разрежения 15 мл.
- Очищайте DiI помечены НГП (дии-НГП) решение от ДМСО и любые возможные бесплатные красителя DiI центрифугированием benchtop 15 мл 10 кДа фильтра на 3900 x g за 5 мин.
- Повторите шаг 3.5 по крайней мере пять раз.
- Фильтр окончательного решения DiI НГП через фильтр шприц поры размер 20 Нм.
- Измерьте absorbance окончательного DiI-НГП UV-VIS спектрофотометрии и вычислить его концентрация согласно закону пиво-Ламбер (рис. 2). Для получения более подробной информации смотрите 2.13 шаг.
- Храните его в холодильнике при температуре 4 ° C для дальнейшего использования.
4. проникновение растений листья с ЧПУ
- Добавить 0,1 мл инфильтрация буфера (100 мм TES, 100 MgCl2, pH 7.5, регулируется HCl) в 0,9 мл 0,5 мм НГП или DiI-НГП решения и вихревой его. Используйте решение 10 мм TES проникновения буфера как отрицательный контроль.
- Передать 0,2 мл НГП или DiI-НГП проникновения раствора 1 мл стерильного безыгольной шприц. Нажмите, чтобы удалить любые возможные воздушные пузыри.
- Извлечь растение из рост палата незадолго до проникновения с наночастицами, чтобы избежать возможных устьиц закрытие номер легких условиях.
- До проникновения Измерьте содержание хлорофилла от A. thaliana листья с аналогичного размера, с помощью хлорофилла метр. Измерить каждый лист с тремя реплицирует (каждый реплицировать, состоящий из по крайней мере три измерения)14. Выберите A. thaliana листья с аналогичным содержанием хлорофилла для проникновения эксперимента.
- Проникновения листья медленно с недавно приготовленный раствор НГП или DiI-НГП, осторожно нажав кончик безыгольной шприца против нижней части листовой пластинки (abaxial сторона) и угнетают Плунжер (рисA).
- Осторожно протрите избыточное решение, которое остается на поверхности листовой пластинки (рис. 3B) используя деликатную задачу стеклоочистителя (рис. 3C) и этикетки завода. Используйте новые деликатную задачу салфетки для каждой группы листьев.
- Держите проникли A. thaliana растений на скамейке лист адаптации и инкубации с КНП или DiI-НГП за 3 ч.
Примечание: Проникли A. thaliana растения готовы затем для дальнейшего использования (рис. 3D).
5. подготовка проб листьев для Confocal микроскопии
- Roll гороха размер, количество наблюдений гель о радиусе 1 см (рис. 4A) и затем разложил его, до тех пор, пока это 1 мм толщиной на слайде стекла (рис. 4B).
- Используйте сверло Корк (диаметром 0,3 см) вырезать круглого сечения в центре наблюдения геля на слайде стекла (рис. 4C).
- Заполните срез хорошо полностью с Перфтордекалин (ПФО) для глубже и лучше конфокальный разрешающей в тканях листа.
- Используйте сверло Корк (диаметр 0,2 см) для сбора листьев диски от адаптированы DiI-НГП проникли A. thaliana растений (рис. 4D).
- Смонтировать диск листьев в ПФО, заполнены хорошо; противостоять проникли (abaxial) стороне листа.
- Поместите квадратные coverslip поверх листа диска и аккуратно нажмите на слайд coverslip равномерно, чтобы запечатать его с хорошо наблюдения геля и убедитесь, что нет пузырьков воздуха остаются захваченных (Рисунок 4E).
6. Визуализация DiI НГП в ткани листьев, конфокальная микроскопия
- Используйте 40 X объектив в Перевернутый лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп.
- Перетащите два-три капли ddH2O на вершине 40 X объектив.
- Поместите подготовленные DiI-НГП проникли лист образец слайда на вершине Перевернутый 40 X объективные линзы.
- Убедитесь, что на стороне coverslip но не стекло слайд контакт непосредственно с ddH2O на объективе.
- Найти область интереса в образце под микроскопом с лазерный свет или яркие области.
- Запустите программу микроскоп и включите Аргонового лазера (устанавливается на уровне 20%).
- Установите обскуры собирать оптических срез менее 2 мкм и среднюю линию из 4.
- Изображение образца с параметрами конфокального микроскопа: 514 Нм лазер возбуждения (30%); Z-стека в разделе Толщина: 2 мкм; PMT1: 550-615 Нм (для ДИИ-НГП изображений); PMT2: 700-800 Нм (для хлоропластов воображения).
- Принять представителя конфокальный изображения образцов листьев от разных людей, как минимум, три биологических реплицирует.
7. imaging НГП в естественных условиях рос очистки, конфокальная микроскопия
- Подготовка 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein диацетата (H2DCFDA, краситель для указания общего ROS) и 10 мкм dihydroethidium (DHE, краситель для индикации супероксид анион) красители в TES проникновения буфере (рН 7,5) в 1,5 мл microcentrifuge трубы, отдельно.
- Используйте сверло Корк (диаметр 0,2 см) для сбора листьев диски из адаптированных НГП проникли A. thaliana растений.
- Используйте острый кончик щипцы сделать три-четыре отверстия на лист диски для ускорения краситель, процесс загрузки.
- Передача лист диски microcentrifuge трубы с H2DCFDA и DHE отдельно и Инкубируйте 30 мин в темноте.
- После инкубации промыть листья диски с ddH2O 3 раза и горе его в стакан слайд с замечанием гель (см. раздел 5 протокола).
- Поместите слайд на confocal микроскопа и вручную фокус в область ячеек мезофилл листа. Подробнее смотрите раздел 6 протокола.
- Разоблачить листьев диски к UV-A (405 нм) лазер для 3 мин для создания рос и записывать изменения интенсивности сигнала рос в ряды («xyt») в конечный диск.
- Изображение листа диска с параметрами конфокального микроскопа: 40 X воды цели; 496 Нм лазер возбуждения; PMT1: 500-600 Нм (для DHE DCFDA краситель обнаружения и); PMT2: 700-800 Нм (для обнаружения хлоропластов). Использование растений, проникли с только проникновение буферного раствора как отрицательный контроль.
8. НГП очистки H2O2в пробирке
- Поведения кошки (каталаза) подражательный деятельность синтезированных НГП в пробирке , следуя методы в предыдущих публикациях3,8,15
- Добавить 45,4 мкл 1 x TES инфильтрации буфера (10 мм TES, MgCl 10 мм2, pH 7.5, регулируется HCl), НГП (60 Нм, 3 мкл) и H2O2 (2 мкм, 1 мкл) в колодец (белая круглая 96 хорошо днище) и осторожно перемешать, закупорить.
- Добавить 10-ацетил-3,7-dihydroxyphenoxazine (рабочие концентрации 100 мкм, 0.5 мкл) и пероксидазы (HRP; рабочие концентрации 0,2 ед/мл, 0.1 мкл) в колодец, осторожно смешать его, закупорить и Инкубируйте 30 мин 10-ацетил-3,7-dihydroxyphenoxazine реагирует с H2O2 и превращается в resorufin присутствии пх.
- Оберните тарелку с алюминиевой фольгой, чтобы избежать свет во время инкубации.
- Подготовьте отрицательный контроль с помощью реакции буфер или воды для замены H2O2.
- За исключением Стоковый раствор Подготовьте все другие решения при комнатной температуре.
- После инкубации, с читателем пластины, контролировать поглощения на 560 Нм использовать resorufin для индикации уровня H2O2. Задать время режима на 0, 2, 5, 10, 20 и 30 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Синтез НГП и характеристика .
НГП были синтезированы, очищенной и характеризуется ниже метода описано в разделе 2 протокола. Рисунок 1 A показывает окраски растворов церий азотнокислый, ПАА, смесь церий азотнокислый и ПАА и НГП. Изменение цвета от белого до светло-желтого рассматривается после синтезируется НГП. После очистки с помощью фильтра 10 кДа Спектрофотометр UV-VIS характеризовались НГП. Пик поглощения для КНП было отмечено на 271 Нм (рис. 1Б). Окончательный элюента также была измерена с UV-VIS для подтверждения, что химические вещества не отреагировали были смыты во время очистки. Гидродинамические диаметр и Зета потенциал синтезированных НГП были измерены с ММД и Зета потенциальных анализатора частиц (рис. 1C).
НГП маркировки с красителями DiI .
Чтобы определить распределение наночастиц в естественных условиях, НГП были помечены флуоресцентного красителя DiI после метода, описанного в статье 3 протокола. Красителя DiI внедряет в рамках НГП покрытие спонтанно так, как он может инкапсулировать в гидрофобных домены внутри полимерные покрытия nanoceria16. После добавления красителя DiI решение НГП, быстрый цвет изменить на розовый было отмечено (рисA). DiI помечены НГП были затем очищается с помощью фильтра 10 кДа и характеризуется UV-VIS спектрофотометрии. Три четкие пики поглощения для дии, помечены НГП были замечены (рис. 2B). Окончательный элюента был измерен методом спектрофотометрии UV-VIS для подтверждения, что химические вещества не отреагировали были размыты во время очистки.
Проникновение листовой пластинки.
НГП или DiI-НГП были доставлены в A. thaliana листьев через листовой пластинки инфильтрации метод, как описано в разделе 4 протокола. Лист был проникли в четырех разных точках, чтобы убедиться, что области полный лист был увлажненную НГП раствором (рисA). Любой оставшийся раствор был удален из поверхности листа (рис. 3B и 3 C). Цвет листьев, изменился во время проникновения от зеленого до темнее зеленый (рис. 3D). Шприц нежно прижать лист избежать любой физический ущерб.
Лист Пробоподготовка для микроскопии флуоресцирования.
Лист образцы были смонтированы на стеклянных скольжениях в рамках наблюдения гель, сделал хорошо заполнены с PFD. После прокатки гороха размер наблюдения гель на слайде (рис. 4A и 4B), хорошо было сделано в середине плоских гель (рис. 4C). Затем диск свежеприготовленные лист был переведен в колодец, ранее заполнены раствором PFD (рис. 4D). Coverslip был использован для иммобилизации лист образца слайда (Рисунок 4E).
Конфокальная томография DiI-НГП в естественных условиях .
Дии-НГП проникли A. thaliana листья были использованы для определения распределения DiI-НГП в клетках мезофилл листа через конфокальная томография (рис. 5A и 5B). Чтобы визуализировать colocalization между DiI НГП и хлоропластов, DiI-НГП проникли лист образцы были в восторге с 514 Нм лазер. Выбросов DiI-НГП была установлена в 550-615 Нм чтобы избежать возможные вмешательства хлоропласта пигменты сигналов после ~ 650 Нм17. Auto флуоресценции хлорофилла от хлоропластов были обнаружены от 700-800 Нм. Конфокальный изображений параметры были установлены (мощность лазера и прибыль), чтобы убедиться, что никакие сигналы красителя DiI были обнаружены в образце листа управления (проникли с только буфер) (рис. 5C). Colocalization дии-НГП с хлоропластов в клетках мезофилл листа можно наблюдать накладываемое изображение обнаруженных DiI-НГП и хлоропласта пигмент аутофлюоресценция (рис. 5D).
Конфокальная томография PNC ROS очистки в естественных условиях .
НГП в 10 мм TES буферный раствор были доставлены в A. thaliana листья через метод проникновения пластинки листа, как описано в разделе 7 протокола. DHE (dihydroethidium) и H2DCFDA (2′, диацетата 7′-dichlorodihydrofluorescein) флуоресцентных красителей используются для визуализации рос в тканях растений8,18. H2DCFDA известно быть преобразованы в флуоресцентные DCF (2′, 7′-dichlorofluorescein, показатель степени общего Оксидативный стресс) за счет расщепления ацетат групп ROS19. DHE является более конкретных краситель для супероксид анион, сделав его флуоресцентные продукт (2-hydroxyethidium) увеличить при реакции с супероксид анион20. В естественных условиях ROS очистки, активизируемые НГП контролировался в конечные диски измерения DHE и DCF краситель флуоресценции интенсивности изменений (цифры 6A и 6B). НГП проникли листьев, что образцы были в восторге с 496 Нм лазер. Выбросов DHE и DCF краска была установлена в 500-600 Нм чтобы избежать возможные помехи хлоропласта auto флуоресценции сигналов. Пигмент auto флуоресценции из хлоропластов были обнаружены от 700-800 Нм. После 3 минут УФ стресс, краситель ROS сигналов в НГП и буфера-проникли образцы листьев контролировалось отдельно. По сравнению с без наночастиц буфер управления (НПП), НГП проникли листья, показали значительно меньше ROS-активированный флуоресцентные DCF-краситель сигнал(рис. 6). Аналогичные результаты были обнаружены с супероксид анион активированный DHE краситель, где НГП проникли листья были значительно меньше интенсивности окрашивания DHE чем буфер проникли управления листья (Рисунок 6B).
НГП CAT подражательный деятельности пробирного . Пробирного НГП очистки H2O2 был описан в статье 8 протокола. Снижение resorufin, который указывает, что H2O2 уровня в реакционной смеси, содержащие НГП было отмечено (рис. 7), подтверждающее CAT подражательный активность синтезированных НГП.
Рисунок 1 : Синтез и характеристика PNC. A. Окраска церий азотнокислый, полиакриловой кислоты (ПАА), смеси нитрата церия и ПАА и синтезированных НГП (ПАА покрытием наночастиц оксида церия, светло-желтый). B. absorbance спектр НГП, измеряется UV-VIS спектрофотометрии. C. гидродинамические диаметр и Зета потенциал синтезированных НГП. Средняя погрешность ± стандарт (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : НГП маркировки с флуоресцентных красителей DiI. A. НГП (светло-желтый) и DiI красителя меченных решение НГП (дии НГП, розовый). B. absorbance спектр DiI НГП решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Листовой пластинки проникновения НГП или DiI-НГП. A. A. thaliana листьев до проникновения. Решение внутри шприца-дии-НГП. B. лист проникли с дии-НГП. C. оставшиеся решение от поверхности листа с деликатной задачей очистки салфетки. D. уборка листьев A. thaliana проникли с дии-НГП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Подготовка лист образца слайдов. A. микроскопии стеклянное скольжение с горошину размер наблюдения гели. B. слайд с плоской наблюдения гели. C. слайд с плоской наблюдения гель, имея хорошо в середине. D. слайд с листьев диски в геле наблюдения, хорошо заполнены раствором из перфтордекалина (ПФО). E. слайд с дисками листьев, иммобилизованных на крышку выскальзования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Визуализация DiI-НГП в мезофилл листа клетки через confocal микроскопии. A. лист образец монтируется на Перевернутый конфокального микроскопа, имея объектив погружения воды 40 X. B. Конфокальный микроскоп используется для визуализации DiI-НГП и хлоропластов. C. хлоропласта auto флуоресценции записывается в буфер проникли лист образцов без наночастиц (НПП). D. DiI-НГП сигнал и хлоропласта auto флуоресценции отображаемого в пробах листьев DiI-НГП проникли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Мониторинг PNC ROS очистки в planta через confocal микроскопии. A. DCF Люминесцентную краску (для мониторинга общего сигнала ROS) значительно ниже в мезофилл клеток растений НГП проникли чем буфер управления (без наночастиц, НПП). Б. снижение DHE люминесцентные краски (для мониторинга супероксид анион) в клетках мезофилл НГП проникли растений по сравнению с буфера элемента управления (НПП). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Подражательный активности каталазы (кат) PNC. Присутствии пероксидаза флуоресцентный зонд реагирует с перекисью водорода и преобразуется в resorufin (поглощение 560 Нм). Абсорбция resorufin, что свидетельствует о перекиси водорода уровней, контролируется на 560 Нм. НГП показал кошку подражательный деятельности. Средний ± SE (стандартная ошибка) (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы описываем НГП синтеза, характеристика, Флюоресцентная краска маркировки и конфокальная томография наночастиц в клетки растений мезофилл выставить их в естественных условиях рос очистки деятельности. НГП синтезируются из смеси нитрата церия и ПАА раствор гидроксида аммония. НГП характеризуются spectrophotomery поглощения и концентрация определяется с помощью законодательства Lamberts пиво. Измерение потенциала Зета подтвердил отрицательно заряженной поверхности КНП для повышения эффективности в хлоропластах8. Маркировка НГП с флуоресцентных красителей DiI позволяет в vivo изображений на confocal микроскопии внутри клетки мезофилл листа, где наночастиц показывают высокие уровни colocalization с хлоропластов. С помощью DHE и DCF флуоресцентных красителей, мы подтвердили что НГП акт как мощный поглотитель супероксид анион и рос в естественных условиях.
Метод синтеза, PNC является простая процедура поэтапного, которая генерирует наночастиц оксида церия с контролируемый размер, отрицательный заряд и рос, очистки возможности16. Другие методы, такие как тепловой гидролиза, требуют высоких температур и дорогих химии оборудование21,22. Синтез и характеристика НГП — лоу кост метод с общей лабораторного оборудования. Она требует крутой кривой обучения, по сравнению с молекулярными методами в растениях, основанный на гиперэкспрессия антиоксидантной фермента, например, SOD, APXи кошка, для очистки видов рос в модели систем23. НГП является надежной, водорастворимые ROS каталитического мусорщика, не требует трудоемкой клонирования и методы преобразования, которые зависят от завода отслеживаемости генетических и доступные молекулярной инструментарий.
Важнейшим шагом в этот протокол является проникновение на основе шприц клеток мезофилл листа с ЧПУ. Проникновение наночастиц в живые растения должно быть сделано аккуратно, чтобы избежать физического повреждения листьев24. Таким образом как и протокол шаг 4 методов, аккуратно вставьте против поверхности листа с шприц чтобы избежать разрывов или прокола abaxial листовой поверхности. Это лучше проникнуть на abaxial поверхности листа A. thaliana , так как он имеет плотность устьичного чем adaxial поверхности25,26. Кроме того раствор НГП или DiI-НГП в пределах физиологических рН (~ рН 7,5) должны быть использованы во время проникновения листовой пластинки. Еще один важный шаг в этом протоколе является применение соответствующей концентрации НГП в исследованных растений ткани. В этом протоколе 50 мг/Л КНП был не токсичен для A. thaliana листья позволяя каталитического PNC ROS очистки. Некоторые ограничения текущего метода доставки наночастиц 1) не применяются к имея толстые и восковой смазывают видов растений или низкой устьичного плотности, 2) не масштабируемость для приложений, в поле, 3) высокая стоимость confocal микроскопии системы мониторинга в естественных условиях распределение наночастиц и ROS очистки.
Этот протокол демонстрирует применение ROS очистки КНП для изучения и улучшения абиотическому стрессу в растениях через поверхностным методом листовой пластинки инфильтрации. ROS накопление сопровождается абиотическим стрессам в растениях, которые в свою очередь уменьшает фотосинтеза растений, роста и выход8,27,28. Завод генетические модификации методов ROS манипуляции в естественных условиях часто ограничиваются модель видов растений, в то время как PNC ROS-очистки имеет потенциал, чтобы применяться к видов растений различных дикого типа. Листовой пластинки инфильтрации является методом практических исследований для увеличения ROS очистки в тканях листа для понимания и инженерных растений абиотическому стрессу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана университет Калифорнии, Риверсайд и USDA национального института продовольствия и сельского хозяйства, Люк проекта 1009710 J.P.G. Этот материал основан на работе, поддержке Национального научного фонда под Грант № 1817363 для J.P.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
