Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

Published: November 21, 2018 doi: 10.3791/58375
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Entomology, Louisiana State University AgCenter, 2Department of Entomology, Virginia Tech, 3Department of Entomology and Nematology, Emerging Pathogens Institute, University of Florida

Summary

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي تنازلي للنظام العصبي المركزي melanogaster المورفولوجية لتمكين فعالة من حيث التكلفة ومريحة لاختبار وكلاء الدوائية، الطفرات الوراثية للبروتينات العصبية، و/أو دور مسارات الفيزيولوجية غير مستكشفة.

Abstract

تستهدف معظم المبيدات الحشرية المتوفرة حاليا في الجهاز العصبي والطفرات الوراثية من اللافقاريات البروتينات العصبية في كثير من الأحيان تسفر عن عواقب وخيمة، ولكن الأساليب الحالية لتسجيل النشاط العصبي للفرد الحيوان مكلفة وشاقة. هذا الشفط الكهربائي إعداد النظام العصبي المركزي اليرقات الطور الثالث من melanogaster المورفولوجية، نظام المرونة لاختبار الآثار الفسيولوجية لوكلاء نيورواكتيفي، تحديد دور مختلف العصبية الفسيولوجية مسارات لنشاط الجهاز العصبي المركزي، فضلا عن تأثير الطفرات الوراثية للوظيفة العصبية. يتطلب هذا الإعداد السابقين فيفو معتدلة فقط تشريح المهارة والخبرة الكهربية لتوليد تسجيلات استنساخه من الحشرات نشاط الخلايا العصبية. يمكن تطبيق مجموعة متنوعة واسعة من المغيرون الكيميائية، بما في ذلك الببتيدات، ثم مباشرة إلى الجهاز العصبي في الحل مع المحلول الملحي الفسيولوجي لقياس تأثير على نشاط الجهاز العصبي المركزي. ويمكن تطبيق التكنولوجيات الوراثية، وأخرى، مثل نظام GAL4/UAS، بشكل مستقل، أو بالترادف مع وكلاء الدوائية لتحديد دور قنوات أيون معين أو الناقلين أو مستقبلات لوظيفة الجهاز العصبي المركزي المفصلية. وفي هذا السياق، الاختبارات المبينة في هذا التقرير من اهتمام كبير للسميات المبيدات الحشرية وفسيولوجي الحشرات، وعلماء الأحياء التنموية التي ميلانوجاستير دال- كائن حي نموذجية المتبعة. والهدف من هذا البروتوكول لوصف أسلوب الكهربية لتمكين قياس اليكتروجينيسيس للجهاز العصبي المركزي في الحشرة النموذجية، melanogaster المورفولوجية، ومفيدة لاختبار مجموعة متنوعة من العلمية فرضيات.

Introduction

والهدف العام لهذا النهج أن تمكن الباحثين من قياس سرعة اليكتروجينيسيس النظام العصبي المركزي (CNS) في الحشرة النموذجية، melanogaster المورفولوجية. هذا الأسلوب موثوق بها وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لإجراء التجارب الفسيولوجية والسمية. الجهاز العصبي المركزي أمر ضروري للحياة، ومن ثم، الفسيولوجية المسارات الحرجة لتم استكشاف الوظيفة العصبية المناسبة على نطاق واسع في محاولة لفهم أو تعديل الوظيفة العصبية. توصيف لمسارات الإشارات داخل CNS المفصلية مكن اكتشاف عدة فئات المواد الكيميائية من مبيدات الحشرات التي تعطل وظيفة العصبية اللافقاريات للحث على معدل الوفيات مع الحد من عواقب خارج الهدف. وهكذا، القدرة على قياس النشاط العصبي للحشرات أهمية كبيرة في ميدان علم السموم الحشرات وعلم وظائف الأعضاء منذ العصبي هو النسيج المستهدف الأغلبية من مبيدات الحشرات المنتشرة1. حتى الآن، استمر نمو المعرفة الأساسية والتطبيقية المتعلقة بالحشرات الجهاز العصبي يتطلب تقنيات متقدمة العصبية التي تقتصر في جدوى، نظراً للتقنيات الحالية هي كثيفة العمالة، وتتطلب من نفقات عالية، الحشرات خطوط الخلايا العصبية محدودة، و/أو محدودية الوصول إلى نهايات المركزية معظم المفصليات. حاليا، يتطلب توصيف معظم البروتينات العصبية الحشرات المستهدفة لتكون المخدرات اللاحقة المستنسخة، وأعربت عن هيتيرولوجوسلي لاكتشاف والتسجيلات الكهربية، كما وصفت لقنوات البوتاسيوم مقومة الحشرات إلى الداخل2 ، ريانوديني الحشرات مستقبلات3، والبعوض حساسة للجهد ك+ قنوات4وغيرها. للتخفيف من الحاجة إلى تعبير مغايرة وإمكانيات التعبير الوظيفي المنخفض، مثقف بلومكويست والزملاء يهدف إلى الحث النمط الظاهري الخلايا العصبية في الخلايا فروجيبيردا سبودوبتيرا (Sf21) كطريقة مبتكرة مبيد حشري اكتشاف5،6. هذه الأساليب توفر نهجاً سليما لتطوير الكيمياء الجديدة، إلا أنها تخلق في كثير من الأحيان اختناق لا يمكن التغلب عليها لوصف العوامل الدوائية، تحديد آليات لمقاومة المبيدات الحشرية، وتوصيف المبادئ الفسيولوجية الأساسية. هنا، يمكننا وصف السابقين فيفو أسلوب الذي يتيح تسجيل النشاط الكهربائي من الحشرات نموذج يحتوي على علم الوراثة طيع7،،من89 وأنماط التعبير المعروفة من العصبية المجمعات11،،من1012 لتمكين توصيف آليات المقاومة على مستوى العصب وطريقة عمل الأدوية المطورة حديثا وغيرها من الدراسات السمية.

ذبابة الفاكهة، ميلانوجاستير دال، هو كائن نموذج مشترك لتعريف النظم العصبية الحشرات أو مبيد حشري إليه العمل وقد أنشئت ككائن نموذج مناسبة تماما لدراسة سمية13، الدوائي14 ،15و العصبية16و الفيزيولوجية المرضية17،،من1819،20 العمليات من الفقاريات. D.melanogaster هو الحشرات هولوميتابولوس الذي يقوم بمسخ كاملة، بما في ذلك مرحلة اليرقات والخوادر قبل الوصول إلى مرحلة الكبار الإنجابية. طوال عملية إنمائية، العصبي يخضع لإعادة عرض كبير في مراحل مختلفة من الحياة، ولكن CNS اليرقات ستتركز على هذه المنهجية. CNS اليرقات المتقدمة تماما بسيطة تشريحيا مع أجزاء الصدر والبطن التي تنصهر فيها، وتشكيل العقدة البطني، الذي يمثل مجموعة من الوحدات نيوروميريك متكررة ومتطابقة تقريبا21،22. الأعصاب الحركية تنازلي تنبع من نهاية العقد سوبيسوفاجيل والذيلية والنزول إلى يعصب عضلات جدار الجسم وأجهزة اليرقات الحشوي. ويصف الشكل 1 تشريح الإجمالي لليرقات المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي.

يتطور في نهاية embryogenesis المورفولوجية حاجز الدم في الدماغ (BBB) ويتكون من سوببيرينيوريال الخلايا الدبقية (SPG)21. وتشكل الخلايا SPG العديد من عمليات مثل فيلوبوديا التي انتشرت بإنشاء ورقة عمل متجاورة، مسطحة للغاية، مثل بطانية يغطي المورفولوجية CNS كامل23. وقد المورفولوجية BBB أوجه التشابه مع BBB الفقارية، التي تشمل الحفاظ على التوازن المكروية العصبية بمراقبة دخول المواد الغذائية و xenobiotics إلى الجهاز العصبي المركزي21. هذا شرط مسبق للإرسال العصبية موثوقة ومهمة، حتى الآن حماية الجهاز العصبي المركزي واسطة BBB يقيد تخلل للعقاقير الاصطناعية ومعظم الببتيدات الأخرى xenobiotics24،25، الذي يقدم إمكانات مشاكل عند وصف مقايسات المغيرون جزيء صغير. يستخدم الأسلوب ترانسيكتيون بسيطة لتعطيل هذا الحاجز وتوفير وصول الدوائية جاهزة للاشتباكات العصبية المركزية.
هو أكبر قوة للمنهجية الموصوفة البساطة وإمكانية تكرار نتائج نسبيا الفائق القدرات الكامنة لهذا النظام. البروتوكول نسبيا سهلة الماجستير، يتطلب برنامج الإعداد مساحة صغيرة، وضروري فقط مدخلات مالية أولية التي ينخفض إلى الكواشف والمواد الاستهلاكية. علاوة على ذلك، طريقة وصف التعديل الكامل لتسجيل نشاط العصب المركزي تنازلي ذبابة المنزل، مستأنسة الذبابة26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-معدات ومواد

  1. إعداد المكونات المطلوبة (المذكورة في الجدول للمواد) من تلاعب الكهربية لإجراء تسجيلات القطب شفط المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي.
    ملاحظة: قبل التجريب، من الضروري لبناء دوائر لتشريح المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي والتي ستستخدم للاستحمام ganglia في المحلول الملحي خلال التسجيلات. يرد فيما يلي مخطط تفصيلي خطوة بخطوة لبناء الدائرة.
  2. إعداد قاعة اليرقات.
    1. تذوب الشمع الأسود باستخدام لوحة الساخن.
    2. صب 2 مل شمع الذائب في دائرة التي تحتوي الحد أقصى لحجم من 2-2.5 مل.
    3. السماح لتبرد الشمع وتتصلب لحوالي 2 ح.
    4. استخدام شفرة حلاقة لنحت حفرة في تصلب الشمع الذي سوف يعقد حجم 500 ميليلتر، الذي يحتوي مساحة حوالي 0.5 سم2 وعلى عمق حوالي 0.25 سم.

2-المعدات وتكوين البرامج

ملاحظة: يرد برنامج الإعداد تسجيل خارج الخلية بإيجاز أدناه.

  1. إعداد المعدات للتشريح والتسجيل.
    1. ضع إعداد الأنسجة، والمجهر، القطب الشفط، ميكرومانيبولاتورس، مصدر الضوء داخل قفص فاراداي الحد من الضوضاء، وإزالة حقول كهربائية غريبة (الشكل 2).
    2. الاتصال (يفضل أن يكون جندي) الأرض والأسلاك إيجابية على محمية مقاطع التمساح التي سوف تكون متصلاً صاحب حمام وميكروليكترودي، على التوالي.
      ملاحظة: يمكن تغطية الأسلاك ملحوم ومكشوفة مع رقائق الألومنيوم للحد من الضوضاء.
    3. الاتصال بالأرض والأسلاك إيجابية الإدخال 1 من مكبر للصوت التفاضلية كهربية.
    4. الاتصال نظام حيازة البيانات مكبر للصوت التفاضلية كهربية بتوصيل كابل حربه نيل-Concelman (BNC) من 1 إدخال نظام الاستحواذ على البيانات بإخراج القناة 1 مكبر للصوت.
      ملاحظة: من المستحسن إدراج 50/60 هرتز ضوضاء مزيل بين البيانات اقتناء البرمجيات ومكبر للصوت. مطلوب استخدام موصل BNC T.
    5. إذا رغبت في ذلك، تشمل جهاز صوت في برنامج الإعداد عن طريق توصيل الإدخال 1 لرصد الصوت لإدخال 1 للبرنامج الحصول على البيانات.
    6. ملء حقنه 10 مل مع المالحة وتوصيله إلى منفذ الضغط صاحب القطب.
      ملاحظة: تأكد من وجود لا فقاعات الهواء بين المحاقن وبيليه Ag/AgCl، وافتتاح قطب كهربائي.
  2. إعداد البرنامج للتشريح والتسجيل.
    ملاحظة: الخطوط العريضة لأساليب لإعداد البرامج على أساس اقتناء/تحليل البرامج المسرودة في الجدول للمواد التي سوف رقمنة الناتج الخام الكهربائية وتحويل البيانات إلى ارتفاع وتيرة. ومع ذلك، يمكن استخدام برامج أخرى ويمكن استخدام تسجيل التحويلات المتعددة.
    1. فتح برنامج اكتساب والتحليل.
    2. انقر على "برنامج الإعداد" من شريط الأدوات الرئيسي، وحدد "إعدادات القناة"، الذي سيتم فتح مربع حوار.
    3. تقليل عدد القنوات الإجمالي إلى ثلاثة.
    4. بالنسبة للقناة 1، حدد مجموعة من 100 mV.
    5. للقناة 2، انقر فوق علامة التبويب "حساب" التي سوف تفتح قائمة منسدلة. حدد "قياسات دوري،" الذي سيتم فتح مربع حوار ثاني.
    6. حدد القناة 1 كالمصدر. ثم القياس القائمة المنسدلة، حدد وحدة المصطلحات الخاصة في الأحداث. وأخيراً، في منطقة إعدادات الكشف، من القائمة المنسدلة حدد عتبة بسيطة.
    7. لتحويل النشاط الكهربائي في مؤامرة معدل المعرب عنها في هيرتز، يجب تعيين القناة 3rd في وضع الحساب: في الإطار الإدخال، اكتب في "1000*smoothsec(ch2,2)". ثم حدد الوحدات القائمة المنسدلة قائمة هيرتز.
      ملاحظة: يمكن إجراء التسجيلات الناجحة مع الأجهزة تسجيل مختلفة متعددة، ولكن "سبايك وحدة في الأحداث وعتبة بسيطة" يرجح أن أسهل، حيث أنه يسمح بتعديل عتبة أعلاه بنشاط الخلفية لكل فرد تسجيل. تسجيلات تحت الإعداد "مخصص-مصدر الإدخال" زيادة إمكانية تكرار نتائج البيانات افتراض النشاط الخلفية لا يختلف بين التسجيلات.
    8. قم بإغلاق مربعات الحوار للرجوع إلى الشاشة الرئيسية. ينبغي التعبير عن المحور الصادي في هرتز والمحور السيني في الوقت المناسب.

3-تشريح وإعداد اليرقات المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي

ملاحظة: أساليب لليرقات تشريح الجهاز العصبي المركزي تتجلى في وضوح في حفر و Schedl27، ولكن هذه الأساليب المنشورة سابقا تقليل طول الخلايا العصبية تنازلي الهامة لقياس التردد سبايك. ويرد هنا، وسيلة إضافية المكوس CNS اليرقات التي تحتفظ منذ وقت طويل، من الخلايا العصبية تنازلي سليمة.

  1. إعداد المالحة.
    1. إعداد التشريح والمالحة التسجيل التالية في مم28: 157 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل، 2 كاكل2، 4 حمض 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (حبيس)؛ تيتراتي الأس الهيدروجيني إلى 7.25.
  2. تشريح اليرقات المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي.
    1. تحديد واستخراج الطور الثالث تجول melanogaster المورفولوجية من قنينة الثقافة والمكان إلى 200 ميليلتر من المحلول الملحي (الشكل 3A).
    2. فهم هوكس الفم مع زوج من الملقط غرامة ويمسك البطن من يرقة مع زوج ثاني من الملقط (الشكل 3B).
      ملاحظة: لا تنطبق الكثير من الضغط على البطن كما يمكن أن ينتج تمزق طبقة رقيقة cuticular من يرقة.
    3. اجذب هوكس الفم والبطن في اتجاهات مختلفة لفصل نهاية والذيلية ليرقة من منطقة الرأس وفضح الأحشاء ليرقة (الشكل 3).
      ملاحظة: سوف تتشابك في الجهاز العصبي المركزي مع القصبة الهوائية والجهاز الهضمي. لا تقطع CNS بعيداً عن أي أنسجة لمنع قطع الأعصاب الطرفية تنازلي.
    4. ندف الجهاز العصبي المركزي خارج الجهاز الهضمي والقصبة الهوائية بالملقط (3D الشكل).
    5. إذا لزم الأمر، تعطيل حاجز الدم في الدماغ عن طريق يدوياً ترانسيكتينج الجهاز العصبي المركزي اللاحق الفصوص الدماغية مع مقص الربيع فانس.
      ملاحظة: هذا ينبغي أن يتم ذلك على أساس الخصائص الفيزيائية الكيميائية المستخدمة. الخط الأحمر في الشكل 4A هو نقطة ترانسيكشن المقترحة والجهاز العصبي المركزي بحف مع سليمة جذوع الأعصاب تنازلي الطرفية هو موضح في الشكل 4 باء. CNS بحف جاهز للتجريب بعد انتهاء خطوة 3.2.5.

4-خارج الخلية تسجيل المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي.

  1. إعداد الجهاز العصبي المركزي للتسجيل.
    1. سحب قطب ماصة زجاج من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية لمقاومة mΩ 5-15.
    2. إدراج CNS بحف في قاعة الشمع الذي يحتوي على 200 ميليلتر من المياه المالحة. المشبك دبوس الحشرات غير مصقول مع مقطع التمساح ملحوم السلك الأرض، وأدخل رقم pin في المياه المالحة لإكمال الدائرة.
    3. باستخدام ميكرومانيبولاتورس، توجيه مسرى إلى نهاية CNS بحف والذيلية. القضاء على تسجيل ضوضاء الخلفية عن طريق ضبط مستوى العتبة في برنامج اكتساب والتحليل قبل الاتصال جذوع الأعصاب المحيطية.
    4. رسم أي مريحة للأعصاب المحيطية في مسرى الشفط بتطبيق ضغط سلبي طفيف في المحاقن.
      ملاحظة: يرتبط الأساس إطلاق التردد إلى العدد من الخلايا العصبية التي رسمها في مسرى حيث ينتج المزيد من الخلايا العصبية في كثير من الأحيان زيادة مقاومة القطب.
  2. بدء التسجيل خارج الخلية للجهاز العصبي المركزي تنازلي نشاط العصب.
    1. بدء التسجيل في البرنامج الحصول على البيانات ورصد خط الأساس إطلاق التردد. السماح بأن معدل إطلاق النار حجته لمدة 5 دقائق قبل جمع إطلاق معدل بيانات خط الأساس.
    2. تجاهل إعداد وتسجيل إذا لم يكن نمط إطلاق النار لمراقبة معاملة نمط انفجار مماثل للذي هو موضح في الشكل 5 ألف.
      ملاحظة: تغيير نمط إطلاق النار يوحي بنشاط غير طبيعي أو غير مستقرة من مولد النمط المركزي، الذي يمكن أن يغير الوظيفة العصبية.
    3. وبعد 5 دقائق، إضافة 200 ميليلتر المالحة + مركبة لتحقيق إجمالي حجم الدائرة إلى 400 ميليلتر للبدء في تسجيل عنصر تحكم إطلاق معدلات.
    4. بعد خط الأساس المحددة (3-5 دقائق)، سحب 200 ميليلتر من المحلول الملحي وإضافة 200 ميليلتر عامل تجريبي solubilized في المياه المالحة.
      ملاحظة: هو المذيب الموصى بها لمركبات محبتين ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ولا ينبغي أن تتجاوز 0.1% v/v.
    5. تطبيق تركيزات المخدرات بشكل تسلسلي (منخفضة إلى تركيزات عالية)، وتسجيل كل تركيز لتحديد فترة زمنية (يحدده المحقق استناداً إلى الخصائص الكيميائية ل المخدرات29). قم بتسمية هذه النقطة الزمنية من تطبيق المخدرات في برنامج اكتساب والتحليل بها بما في ذلك تعليق الذي يشمل المخدرات وتركيز النهائي.
      ملاحظة: إطلاق النشاط الجهاز العصبي المركزي سوف تنخفض بحوالي 10-20% بعد 30-50 دقيقة بعد التشريح وعليه، يجب أن يتم تنفيذ ضوابط ملائمة لغير المعالجة، والعلاج بالعقاقير لا ينبغي أن تتجاوز هذه الفترة الزمنية.
  3. تحليل البيانات.
    ملاحظة: يمكن إجراء تحليلات متعددة على البيانات التي تم جمعها، مثل التغييرات في إمكانات العمل رشقات نارية29والسعة الموجي سبايك ودورة الوقت وتحديد الترددات سبايك يعني بعد المخدرات العلاج26،30 , 31 , 32-الأكثر شيوعاً هو تحديد تأثير مخدرات قد للترددات سبايك يعني على مدى فترة محددة من الزمن، ويرد أدناه.
    1. جدولة ترددات سبايك يعني بتحديد المنطقة بأسرها للفائدة (أي فترة العلاج من تعاطي المخدرات)، وتحديد الترددات سبايك يعني تلقائياً من خلال "Datapad" الموجود على شريط الأدوات الرئيسي من اقتناء والتحليل البرمجيات.
    2. تحديد تواتر سبايك يعني الجهاز العصبي المركزي بعد العلاج من تعاطي المخدرات إلى تواتر يعني ارتفاع عنصر التحكم المركبة (الأساس). حساب النسبة المئوية تغيير إطلاق معدل بعد العلاج من تعاطي المخدرات بالصيغة: (تعامل تردد التردد/الأساس) × 100.
    3. استخدام إطلاق ترددات أو المئة سبايك يعني التحكم لكل تركيز لإنشاء منحنى استجابة تركيز مع مستوى الرسوم البيانية البرمجيات.
    4. إجراء تحليل إحصائي (مثلاً، مزاوج تي-اختبار) لتحديد أهمية بين النقاط الزمنية أو تركيزات أو العلاج بالعقاقير.
      ملاحظة: هناك طريقتين الأساسية لتوليد وتحليل منحنيات الاستجابة للتركيز. الأسلوب الأول تركيز واحد كل الإعداد الفردية. هنا، بمعدل ارتفاع تركيز واحد هو تطبيع لمعدل ارتفاع خط الأساس لكل إعداد. يتم تقليل الفوائد التي تنهمر من إعداد نظراً لتقصير وقت التسجيل، في حين تزداد مطبات تشريح الوقت نظراً لأن هذا الأسلوب سوف تتكون من 5-7 التحضير CNS الفردية الواحدة والتركيز، وأشرطة الخطأ الأكبر على بيانات متوسط تعيين. الطريقة الثانية تركيزات متعددة لإعداد الفرد الواحد. هنا، يتم تطبيع معدل ارتفاع لكل من تركيزات 3-5 بنفس معدل ارتفاع خط الأساس. الفوائد تسلخ وقتاً أقل وأقل تباين بين يتطابق لتركيزات المخدرات، بينما العثرات هي شرط تأثير المخدرات ومعروف سريع المفعول للمخدرات تركز العلاجات السابقة على العلاجات الكيميائية اللاحقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن تسجيل النشاط العفوي للأعصاب المحيطية تنازلي الناشئة عن النظام العصبي المركزي المورفولوجية استخدام أقطاب شفط خارج الخلية مع إمكانية تكرار نتائج متسقة. النشاط العفوي لقصت وبحف المورفولوجية CNS ينتج نمط دورية من الانفجار مع 1-2 s لإطلاق النار مع حوالي 1 s من القرب من نشاط هادئة. على سبيل المثال، الجهاز العصبي المركزي بالقرب من هادئة (1-2 هرتز) 0.5-1 ق، يليه انفجار (100-400 هرتز) لحوالي 1 s، وثم يعود إلى دولة هادئة قريب (1-2 هرتز) 0.5-1 s (الشكل 5A). ويتكرر هذا النمط إطلاق كل 2-3 ثانية. تواتر ارتفاع متوسط التفريغ CNS المورفولوجية يتراوح من حوالي 20-50 هرتز على مدى فترة 3-5 دقائق، عندما يتم تعيين العتبة فقط فوق ضجيج خط الأساس. يرتبط الأساس إطلاق التردد إلى العدد من الخلايا العصبية الطرفية إلى مسرى وختم شكلت بين الفوهة القطب والعقد البطني. الأهم من ذلك، لا يغير تطبيق [دمس] المذيبات الكيميائية بتركيز 0.1% نهائي سبايك التفريغ تواتر المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي (الشكل 5A).

هذا إعداد الكهربية يوفر طريقة لوصف خصائص مختلف الجزيئات الصغيرة على التردد سبايك جيدا يتسم نظام العصبية الحشرات ضادات أو اكتئاب. بروبوكسور، مثبط معروفة للحشرات أستيلكولينستراز (وجع)، نيوروكسسيتانت وزادت وتيرة التصريف سبايك بحف المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي بطريقة تعتمد على تركيز (الشكل 5 (ب)). على العكس من ذلك، هو نيوروديبريسانت جاما – حمض أمينوبوتيريك (GABA)، عصبي مثبطة معروفة بناء القناة كلوريد غابا بوساطة الحشرات، وخفض تواتر التفريغ سبايك بطريقة تعتمد على تركيز (الرقم 5 ). يعني التصريف سبايك يمكن تحديد الترددات عبر الفترة الزمنية المسجلة لكل تركيز لتمكين بناء منحنى استجابة تركز تحديد التركيز الفعال 50% (50من الجماعة الأوروبية) للحصول على رد. ويرد هنا، بروبوكسور أن يكون المفوضية الأوروبية50 من 338 نانومتر (95% فاصل الثقة (CI): 241-474؛ هيلسلوبي: 1.8؛ آر2: 0.77) بتركيز من 1 ميكرومتر تنتج الإثارة القصوى من المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي في نشاط 300% من عنصر التحكم (الشكل د 5)26. غابا ويرد أن يكون IC50 مم 1.1 (CI 95%: 0.7-1.5؛ هيلسلوبي: 1.5؛ آر2: 0.95) مع تثبيط القصوى في 5 ملم (الشكل 5E).

في كثير من الأحيان، المسابر الجزيئية للنظم العصبية غير قادرة على استخدامها في فحوصات فسيولوجية أو السمية بسبب افتقارها إلى الخصائص الفيزيائية المناسبة التي تمكن من اختراق حاجز الدم في الدماغ. على سبيل المثال، tacrine أحادي قوية لا يغير (ca. 200 nM) المانع للحشرات وجع33، بعد ارتفاع وتيرة سليمة المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي (الشكل 6A). ومع ذلك، تعطيل لوحة العصبية وحاجز الدم في الدماغ من خلال ترانسيكشن الخلفي الفصوص الدماغية أدت إلى قريب زيادة فورية في تواتر سبايك المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي بعد التعرض إلى 100 ميكرومتر أحادي tacrine ( الشكل 6B). بيانات مماثلة تم وصفه سابقا30.

Figure 1
رقم 1: اقتطعت الجهاز العصبي المركزي من الطور الثالث melanogaster المورفولوجية. الأسهم تشير إلى مختلف الهياكل التشريحية للجهاز العصبي المركزي تتوافق مع التسميات. يمثل الشريط مقياس 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الإعداد الكهربية التي يتم استخدامها لإجراء التسجيلات خارج الخلية. (A) قفص فاراداي؛ (ب) الاهتزاز الجدول؛ (ج) تشريح مجهر؛ مضخم تفاضلي كهربية (د) ؛ (ﻫ) رصد الصوت؛ (و) مزيل الضوضاء؛ (ز) نظام حيازة البيانات؛ (ح) الكمبيوتر تشغيل مختبر للمخطط برو البرمجيات؛ (ط) اليافي كبل مع مصدر الإضاءة الخارجية؛ ميكرومانيبولاتور (ي) ؛ (ك) مع منفذ الضغط مع الزجاج الكهربائي وإعداد طبق شمع حامل ميكروليكترودي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: أسلوب لنسق الجهاز العصبي المركزي من يرقات الطور الثالث. (أ) يرقة سليمة غارقة في 200 ميليلتر من المياه المالحة. يشير السهم إلى هوكس الفم التي يتم استخدامها لفصل جدار الجسم. (ب) يتم وضع اثنين من أزواج من الملقط في منتصف الطريق يرقة وخطاطيف الفم يبدأ الفصل بين جدار الجسم. (ج) يتم فصل جدار الجسم عن طريق تطبيق ضغط طفيف ومستمرة لفضح الأحشاء. (د) الجهاز العصبي المركزي هو مرئية بوضوح (الأسهم البيضاء) ويرتبط أحياناً بالأحشاء. شريط مقياس يمثل 1000 ميكرومتر، 750 ميكرون، 500 ميكرومتر، و 200 ميكرون للوحات ألف، باء، جيم ودال، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تعطيل حاجز الدم في الدماغ التي ترانسيكتينج الجهاز العصبي المركزي. (أ) "الجهاز العصبي المركزي سليمة" مع تنازلي الأعصاب واضحة للعيان في نهاية العقد البطني والذيلية. الخط الأحمر يشير إلى موقع ترانسيكتينج الجهاز العصبي المركزي لعرقلة BBB. (ب) أ بحف الجهاز العصبي المركزي مع نهاية العقد البطني لا تزال تعريض الخلايا العصبية تنازلي طويل والذيلية. يمكن أن يتم تجاهل العقد البطني. يمثل الشريط مقياس 200 ميكرومتر لكلا الفريقين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تسجيلات العصبية من الجهاز العصبي المركزي ليرقات الطور الثالث من ميلانوجاستير د . آثار أداء العصب الممثل قبل وبعد التعرض إلى (أ) [دمس]، بروبوكسور (ب) ، وغابا (ج) . يتم إعطاء ترددات إطلاق النار الأولية في المسامير/s (هرتز) لكل تجربة إلى يسار كل التتبع. تركيز-استجابة المنحنيات بروبوكسور (د) وغابا (ه) إلى الجهاز العصبي المركزي العصب التفريغ يرقات melanogaster دال- من تسجيلات منسوخة (n = 3-5 تركيزات كل منحنى، مع تركيز كل تكرارها 5 مرات على الأقل). تمثل الأسهم نقطة تطبيق المخدرات. نقاط البيانات تمثل يعني زيادة النسبة المئوية من خط إطلاق النار معدل وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. عندما تغيب أشرطة الخطأ، أنها لأنها أصغر من حجم الرمز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: زيادة اختراق النظام العصبي بعد ترانسيكشن من الجهاز العصبي المركزي من تاكريني. تسجيلات تمثيلاً سليما (أ) و (ب) بحف CNS اليرقات يتعرض إلى تاكريني موحودي، الذي كان يطبق في السهم. يتم إعطاء ترددات إطلاق النار الأولية في المسامير/s (هرتز) لكل تجربة إلى يسار كل التتبع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التفاصيل المقدمة في الفيديو المرتبطة بها وقدمت نص أداء الخطوات الرئيسية من أجل تسجيل النشاط وارتفاع تواتر المورفولوجية CNS السابقين فيفو. نجاعة التشريح هو الجانب الأكثر أهمية من الأسلوب لأنه سيقلل قصيرة أو عدد قليل من الخلايا العصبية تنازلي خط الأساس إطلاق معدل سوف تؤدي إلى الفروق الكبيرة بين replicates. ومع ذلك، مرة واحدة وقد أتقن تقنية التشريح، البيانات المجمعة مع هذا التحليل استنساخه للغاية وتنظيمي لمجموعة متنوعة من التخصصات. وهو تعديل واحد بالطريقة الموصوفة إدراج نظام إسراف الآلي الذي سيحول دون الحاجة إلى يدوياً "الماصة؛" الحلول المالحة والكيميائية في قاعة المؤتمر الوطني السيادي. إدراج نظام إسراف سيقلل من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي خلال التسجيلات، التي تحدث أحياناً أثناء تطبيق المخدرات مع الممصات اليدوية.

يستغل هذا الأسلوب الكهربية الأداة المساعدة لإعداد لإدماج البحوث اكتشاف المخدرات/المبيدات الحشرية. وعلاوة على ذلك، يتم إعداد هذه قابلة للفصل الدراسي لمظاهرة مفاهيم الأساسية في الأعصاب. الأسلوب يتطلب استثمارات مالية متواضعة نسبيا ويطير وقت إعداد الحد الأدنى مع توفير تسجيل القوية والمستقرة التي يمكن استخدامها لتوضيح تأثير المخدرات على الوظيفة الجهاز العصبي المركزي. على سبيل المثال، العبء المالي لتسجيل تلاعب تكلفة أولية لحوالي 10000 دولار مع التكاليف اللاحقة البسيطة (مثل أملاح المالحة، صيانة مستعمرة يطير، إلخ). علاوة على ذلك، الوقت اللازم من إعداد الجهاز العصبي المركزي لأول تسجيل حوالي 10 دقيقة. على الرغم من أن المورفولوجية سهلة للحفاظ على الثقافة داخل المختبر أو الفصول الدراسية، ينبغي ملاحظة أن هذا التحليل الكهربائي الشفط يمكن أيضا إجراء باستخدام الجهاز العصبي المركزي الذبابة و الذبابة مستأنسةوربما غيرها يرقات ذبابة موسكويد ، كذلك. مركز الآفات مستأنسة الذبابة للماشية وتقترح هذا التحليل يمكن من فائدة كبيرة للبحوث برامج تهدف لتمييز الخلايا العصبية حساسية الذباب من مختلف قطاعات السكان أو لتحديد الفاعلية حديثا نيوروتوكسيكانتس للتحكم في نهاية المطاف من المناطق الموبوءة.

بالإضافة إلى وصف فاعلية العقاقير، يمكن استخدام هذا الإعداد لوصف تأثير الطفرات الوراثية والتلاعب في النشاط العصبي المورفولوجية . وقد أظهرت الأعمال السابقة تلك الخاصة بالجهاز العصبي المركزي ضربة قاضية لترميز الجينات قناة البوتاسيوم (كيريباتي) مقوم إلى الداخل زاد تواتر إطلاق خط الجهاز العصبي المركزي بحوالي 2-fold بالمقارنة مع التحكم في الذباب31. تم الجمع بين هذه البيانات مع البيانات الدوائية للمضاربة في نهاية المطاف تخدم القنوات قير الدور الفسيولوجي لوظيفة الجهاز العصبي المورفولوجية .

على الرغم من أن هذا الأسلوب يمثل مقايسة قوية لاختبار فرضيات السمية والفسيولوجية المتنوعة، القيود إلى الفحص موجودة ويجب النظر فيها. على سبيل المثال، البيانات التي تتولد من خلال تسجيلات الشفط الكهربائي نادراً ما توفر أدلة قاطعة لطريقة عمل المخدرات أو الدور الفسيولوجي الدقيق الدقيق لقناة أيون ويجب أن تدرس في جنبا إلى جنب مع قياسات أكثر يستند إلى الخلية، مثل تصحيح المشبك الكهربية. قيداً إضافيا لهذا الأسلوب أن مستقبلات وأيون قناة الأنواع الفرعية المختلفة لا تؤثر بمعدل ارتفاع الجهاز العصبي المركزي بطريقة متساوية. ولذلك، من الممكن أن تحوير لنوع فرعي مستقبلات أو أيون-قناة محددة قد لا يؤثر بشكل كبير معدل سبايك CNS قصت، ولكن قد يكون في الواقع أثر حاسم على الدالة المجموع العصبي و/أو تكامل الإشارات.

على الرغم من أن توجد قيود، البيانات التي يتم جمعها عن طريق الشفط الكهربائي تسجيلات تقديم بيانات الإثبات لمفهوم الجودة والسماح للباحثين توليد افتراضات بشأن آليات العمل التي يمكن التحقق من صحتها عن طريق الجهد-المشبك الكهربية، والتحليلات الكيميائية الحيوية، أو من خلال إجراء اختبارات إضافية الدوائي. على سبيل المثال، هذه الأخيرة أجريت لاختبار الفرضية القائلة بأن طارد الحشرات، ن، نثنائي إثيل--3--ميثيلبينزاميدي (DEET)، كان يحول دون نظام أوكتوبامينيرجيك في الحشرات الجهاز العصبي المركزي في محاولة لوصف إليه السمية للبعوض و يطير26. وثبت نيوروكسسيتانت نشاط الجهاز العصبي المركزي الذبابة DEET وغيرت أيضا إمكانات بوستسينابتيك ضادات مقولة في الوصلات العصبية العضلية، التي اتروبين ونظم جلوتاماتيرجيك، على التوالي26. واقترحت هذه البيانات أن DEET لم يكن يحتمل أن تحفز السمية عن طريق تثبيط اتروبين، كما كان اقترح سابقا34. تسجيل وتيرة التصريف للطيران والملاحة والمراقبة بعد التعرض إلى فينتولاميني، خصم octopamine معروفة، أظهرت تثبيط نيوروكسسيتيشن DEET بوساطة كاملة، ولكن ليس هذا من بروبوكسور، التي قدمت أدلة ملموسة على أن DEET كان أكثر يرجح أن تؤثر على النظام أوكتوبامينيرجيك من وجع26. هذه مجموعات البيانات المنشورة في تسليط الضوء على مجموعة متنوعة من الفرضيات والظروف التجريبية التي يمكن أن يحقق مع هذا الأسلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نود أن نشكر السيدة روي تشن للتشريح وصور المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي تظهر في الأرقام.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila melanogaster (strain OR) Bloomington Drosophila Stock Center 2376
Vibration isolation table Kinetic Systems 9200 series
Faraday Cage Kinetic Systems N/A
Dissecting Microscope on a Boom Nikon SMZ800N Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier ADInstruments AM3000H The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor ADInstruments AM3300
Hum Bug Noise Eliminator A-M Systems 726300
Data Acquisition System (PowerLab) ADInstruments PL3504 Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software ADInstruments N/A - Online Download
Fiber Optic Lights Edmund Optics 89-740 Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator World Precision Instruments M325
Microelectrode Holder World Precision Instruments MEH715 Different models are acceptable
BNC cables World Precision Instruments multiple based on size
Glass Capillaries World Precision Instruments PG52151-4
Microelectrode Puller Sutter Instruments P-1000 Also can use Narashige PC-100
Black Wax Carolina Biological Supply 974228
Non-coated insect pins, size #2 Bioquip 1208S2
Fince Forceps Fine Science Tools 11254-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
  2. Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
  3. Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
  4. Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
  5. Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
  6. Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
  7. Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
  8. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  9. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  10. Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
  11. Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
  12. Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
  13. Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
  14. Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
  15. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
  16. Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
  17. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
  18. Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
  19. Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
  20. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
  21. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  22. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
  23. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  24. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
  26. Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
  28. Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
  29. Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
  30. Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
  31. Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
  32. Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
  33. Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
  34. Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).

Tags

علم الأعصاب، 141 قضية، وعلم الأعصاب، والكهربية، الدوائر العصبية، المورفولوجية، نيوروثولوجي، الإشارات العصبية، والمبيدات الحشرية إليه للعمل، ومقاومة المبيدات الحشرية
تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث <em>Melanogaster المورفولوجية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Swale, D. R., Gross, A. D.,… More

Swale, D. R., Gross, A. D., Coquerel, Q. R. R., Bloomquist, J. R. Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster . J. Vis. Exp. (141), e58375, doi:10.3791/58375 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter