Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.
Abstract
רוב קוטלי חרקים זמין כעת המטרה על מערכת העצבים, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית הגעה תשואות לעיתים קרובות תוצאות מזיקות, אך השיטות להקלטת פעילות מערכת העצבים של הפרט חיה הוא יקר, מייגעת. שאיבה זו אלקטרודה הכנת השלישי-לחלל זחל מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה melanogaster, היא מערכת צייתן בוחן את ההשפעות הפיזיולוגיות של סוכנים neuroactive, הקובע את התפקיד פיזיולוגיות שונות עצבית מסלולים פעילות מערכת העצבים המרכזית, כמו גם את ההשפעה של מוטציות גנטיות לתפקוד העצבי. הכנת ex-vivo דורשת בינוני רק לנתח מיומנות ומומחיות אלקטרופיזיולוגיות ליצירת הקלטות לשחזור של חרקים פעילות. עצבית. מגוון רחב של מאפננים כימי, כולל פפטידים, ואז ניתן להחיל ישירות למערכת העצבים בתמיסה עם תמיסת מלח פיזיולוגית למדוד את ההשפעה על פעילות מערכת העצבים המרכזית. ניתן ליישם טכנולוגיות נוספות, גנטי, כגון מערכת GAL4/UAS, בנפרד או במשולב עם סוכנים תרופתי כדי לקבוע את התפקיד של תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים, שנאים או קולטני arthropod תפקוד מערכת העצבים המרכזית. בהקשר זה, מבחני המתוארים במסמך זה הם עניין משמעותי toxicologists בקוטלי חרקים, חרקים פיזיולוגים של ביולוגים התפתחותיים אשר melanogaster ד הינו אורגניזם מודל הוקמה. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת אלקטרופיזיולוגיות כדי לאפשר את המדידה של electrogenesis של מערכת העצבים המרכזית בדגם החרק, דרוזופילה melanogaster, אשר הוא שימושי לבדיקת מגוון של מדעי השערות.
Introduction
המטרה הכוללת של גישה זו היא לאפשר לחוקרים למדוד במהירות את electrogenesis של מערכת העצבים המרכזית (CNS) בדגם החרק, melanogaster דרוזופילה. בשיטה זו הוא אמין, מהיר ו וחסכוניים כדי לבצע ניסויים פיזיולוגיים, רעילות. מערכת העצבים היא חיוני עבור החיים ולכן, המסלולים פיזיולוגיים קריטי לתפקוד תקין עצבית נחקרו בהרחבה במאמץ להבין או לשנות פונקציות עצביות. אפיון איתות המסלולים בתוך מערכת העצבים arthropod אפשרה הגילוי בכמה דרגות כימיים קוטלי חרקים זה לשבש את תפקוד עצבי הגעה כדי לגרום לתמותה תוך הגבלת חופש-יעד השלכות. לכן, היכולת למדוד את הפעילות העצבית של חרקים הוא עניין משמעותי בתחום של הרעלים חרקים ופיזיולוגיה מאז מערכת העצבים הוא רקמת המטרה של רוב קוטלי חרקים פרוס1. ובכל זאת, המשיך צמיחת הידע בסיסי ויישומי בנושא מערכת העצבים חרקים דורשת טכניקות מתקדמות neurophysiological מוגבלות כדאיות, מאז הנוכחי הם עבודה אינטנסיבית וטכניקות דורשים עם הוצאות גבוהות, חרק שורות תאים עצביים מוגבלות, ו/או גישה מוגבלת הסינפסות המרכזי של רוב פרוקי רגליים. כיום, ואפיון של חלבונים עצבית חרקים ברוב דורש את המטרה להיות גילוי משובטים, heterologously ביטוי עבור תרופות עוקבות והקלטות אלקטרופיזיולוגיות, כפי שתואר עבור יישור פנימה חרקים אשלגן ערוצי2 , ryanodine חרקים קולטן3, יתוש מתח רגיש K+ ערוצים4ואחרים. כדי להמתיק את הדרישה לביטוי heterologous ואת הפוטנציאל ביטוי תפקודית נמוכה, Bloomquist ועמיתיו שמטרתה לגרום הפנוטיפ עצביים ב תרבותי זחל כנימה frugiperda (Sf21) תאים כשיטה חדשניים עבור קוטל חרקים גילוי5,6. שיטות אלה מספקים גישה חוקית של התפתחות הכימיה החדשה, ובכל זאת הם לעתים קרובות יוצרים של צוואר בקבוק בלתי עביר עבור אפיון סוכנים תרופתי, זיהוי מנגנוני עמידות חרקים, ואפיון עקרונות פיזיולוגיים בסיסיים. כאן, אנו מתארים שמחוץ שיטה המאפשרת ההקלטה של הפעילות החשמלית של חרק דגם בעל גנטיקה חמרן-7,-8,-9 ודפוסי הביטוי הידוע של עצבי מתחמי10,11,12 כדי לאפשר אפיון מנגנוני ההתנגדות ברמה של העצב, את מצב הפעולה של תרופות פיתח, מחקרים רעילות אחרים.
זבוב הפירות, ד melanogaster, היא אורגניזם מודל משותפת עבור הגדרת חרקים מערכות עצביות או חרקים מנגנון הפעולה, הקימה כאורגניזם מודל מותאם היטב עבור חקר רעילות13, פרמקולוגית14 ,15, neurophysiological16ותהליכים הקשורים pathophysiological17,18,19,20 של חולייתנים. D.melanogaster הוא חרק holometabolous שמבצע הגלגול השלם, לרבות שלב הזחל, הגולמי לפני שהגיע השלב למבוגרים הרבייה. לאורך כל התהליך ההתפתחותי, מערכת העצבים עובר שיפוץ משמעותי בשלבי חיים שונים, אבל מערכת העצבים זחל תהיה המוקד של מתודולוגיה זו. מערכת העצבים זחל מפותחת פשוטה מבחינה אנטומית עם חלקי בית החזה והבטן הם התמזגו ויוצרים גנגליון הגחון, אשר מייצג את מערך של neuromeric חוזרות ונשנות, כמעט זהה יחידות21,22. העצבים המוטוריים יורד שמקורם בסוף הגרעינים subesophageal סימטרית, לרדת innervate שרירי קיר הגוף ואיברים הקרביים של הזחלים. איור 1 מתאר את האנטומיה של הזחל דרוזופילה CNS.
דרוזופילה מחסום הדם - מוח (BBB) מפתחת בסוף מופרה, נוצר על ידי תאי גליה (SPG) subperineurial21. התאים SPG בצורת רבים כמו filopodia שתהליכים התפרסו להקים רציפים, שטוח מאוד אנדותל דמוי גיליון מכסה את כולו דרוזופילה CNS23. דרוזופילה BBB יש דמיון BBB חוליות, כולל שמירה על הומאוסטזיס של microenvironment עצבית על ידי שליטה על כניסת חומרים מזינים, ואינטראקציות לתוך ה CNS21. זהו תנאי הכרחי אמין התמסורת העצבית ותפקוד, ההגנה על מערכת העצבים על ידי BBB מגבילה את הסתננות של תרופות סינתטיות, פפטידים רוב אחרים ואינטראקציות24,25, אשר מציג את הפוטנציאל בעיות בעת אפיון הלוחמים של מולקולה קטנה מאפננים. השיטה משתמשת של חיתוך פשוט לשבש את מחסום זה ולספק גישה פרמקולוגית מוכן הסינפסות המרכזית.
הכוח הגדול ביותר של המתודולוגיה המתוארת היא פשטות, הפארמצבטית, וקיבולת תפוקה גבוהה יחסית הטמון במערכת זו. הפרוטוקול הוא יחסית קלה, ההגדרה דורש שטח קטן, רק קלט פיננסי ראשוני הוא הכרחי אשר תקטן ריאקטיבים וחומרים מתכלים. עוד יותר, השיטה המתוארת היא לחלוטין amendable להקליט את פעילות העצבים יורד המרכזי של הזבוב הבית, זבוב דומסטיקה26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ציוד וחומרים
- הכינו את הרכיבים הנדרשים (המופיעים בטבלה של חומרים) של המתקן אלקטרופיזיולוגיה לביצוע הקלטות אלקטרודה היניקה של דרוזופילה CNS.
הערה: לפני ניסויים, זה הכרחי כדי לבנות חדרי ניתוח דרוזופילה CNS וכדי לשמש לרחצה את הגרעינים בתוך תמיסת מלח במהלך הקלטות. קו מתאר שלב אחר שלב בניית החדר מוצג להלן. - הכינו את תא זחל.
- להמיס שעווה שחור באמצעות צלחת חמה.
- שופכים 2 מ של שעווה מומסת לתוך תא בעל נפח מרבי של 2-2.5 מ.
- ומצננים את השעווה, להקשיח כבר בערך שעתיים.
- השתמש סכין גילוח לחתוך חור בשעווה מוקשח שיחזיק את נפח של 500 µL, אשר יש בשטח של 0.5 ס מ2 לעומק של-0.25 ס מ.
2. תצורת תוכנה וציוד
הערה: ההגדרה של ההקלטה חוץ-תאית מתוארות בקצרה להלן.
- להכין ציוד הקלטה של ניתוח.
- מקם את רקמות הכנה, מיקרוסקופ, אלקטרודה suction, micromanipulators, מקור האור בתוך הכלוב פאראדיי כדי להפחית את הרעש ולהסיר שדות חשמליים שאינם שייכים (איור 2).
- התחבר (רצוי הלחמה) הקרקע וחוטי חיובית על גבי סוכך קליפים תנין זה תהיה מחוברת המחזיק טורקי, microelectrode, בהתאמה.
הערה: חוטים מולחם וחשוף יכולה להיות מכוסה ברדיד אלומיניום, כדי להפחית את הרעש. - לחבר את הקרקע ואת חוטים חיובי קלט 1 של המגבר הדיפרנציאלי ac/DC.
- חבר מערכת רכישת הנתונים המגבר הדיפרנציאלי ac/DC על-ידי חיבור כבל הכידון ניל-Concelman (BNC) 1 הקלט של מערכת רכישת נתוני הפלט ערוץ 1 של המגבר.
הערה: מומלץ לשלב אלימינייטור רעש של 50/60 הרץ בין התוכנה רכישת נתוני המגבר. השימוש של מחבר BNC T נדרשת. - אם רצונך בכך, כוללים צג השמע לתוך ההתקנה על-ידי חיבור 1 הקלט של צג אודיו קלט 1 של התוכנה רכישת נתונים.
- למלא את המזרק 10 מ ל תמיסת מלח וחבר אותו ליציאת הלחץ של המחזיק אלקטרודה.
הערה: ודא כי אין בועות אוויר קיימים בין המזרק, בגדר Ag/AgCl הפתח אלקטרודה.
- להכין את תוכנת הקלטה של ניתוח.
הערה: קווי המתאר של שיטות ההתקנה התוכנה מבוססת על התוכנה רכישת/ניתוח המופיעים בטבלה של חומרים אשר דיגיטייז את פלט חשמל raw, להמיר את הנתונים ספייק תדר. עם זאת, ניתן להשתמש בתוכנות אחרות, המרות הקלטות מרובות יכול לשמש.- פתח את התוכנה רכישת/ניתוח.
- לחץ על "הגדרת" בסרגל הכלים הראשי ולבחור "ערוץ" הגדרות, יפתח תיבת דו-שיח.
- להקטין את מספר ערוצי סה כ עד שלוש.
- לערוץ 1, בחר טווח 100 mV.
- עבור ערוץ 2, לחץ על הכרטיסיה "חישוב" אשר יפתח תפריט נפתח. בחר "מדידות מחזורית," אשר תפתח תיבת דו-שיח שניה.
- בחר ערוץ 1 כמקור. ואז מדידה בתפריט הנפתח, בחר יחידה ספייק באירועים. לבסוף, באזור ' הגדרות ' זיהוי ', מתוך התפריט הנפתח בחר הסף פשוטה.
- כדי להמיר את הפעילות החשמלית מגרש קצב הביע בהרץ, יש להגדיר את ערוץ 3rd במצב חשבון: על החלון קלט, הקלד "1000*smoothsec(ch2,2)". לאחר מכן בחר כפי היחידות ברשימה הנפתחת תפריט הרץ.
הערה: הקלטות מוצלח יכול להתבצע עם setups שונים הקלטה מרובות, אבל "ספייק יחידה על אירועים ועל סף פשוט" הוא סביר הקל ביותר, שכן הוא מאפשר עבור התאמה של הסף מעל רקע הפעילות עבור כל אדם הקלטה. הקלטות תחת ההגדרה של "מותאמת אישית-מקור קלט" להגדיל הפארמצבטית הנתונים בהנחה שהפעילות רקע אינה שונה בין הקלטות. - סגור את תיבות דו-שיח כדי לחזור למסך הראשי. ציר ה-y צריך להתבטא הרץ, ציר ה-x זמן.
3. לנתח ולהכין את הזחל דרוזופילה CNS
הערה: שיטות ניתוח CNS זחל מומחשים בבירור Hafer ו- Schedl27, אבל השיטות שפורסמו בעבר צמצם את אורך הנוירונים יורד החשובים למדידת התדר ספייק. . הנה, שיטה נוספת המותווה לסלק את מערכת העצבים הזחל שומר זמן רב, הנוירונים יורד ללא פגע.
- הכנה מלוחים.
- להכין את הקרע תמיסת מלח הקלטה הבאים מ מ28: 157 NaCl, 3 אשלגן כלורי, 2 CaCl2, 4 חומצה 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (HEPES); titrate ה-pH ל 7.25.
- לנתח את הזחל דרוזופילה CNS.
- לזהות ולחלץ שלישי-לחלל נודד דרוזופילה melanogaster מן התרבות המבחנה המקום לתוך µL 200 של תמיסת מלח (איור 3 א).
- תופס את הווים הפה עם זוג מלקחיים בסדר, תופסים את הבטן של תולעים עם זוג מלקחיים (איור 3B) השני.
הערה: אינן חלות מדי לחץ בבטן כמו התוצאה יכולה להיות קורע של השכבה cuticular דק טפיל. - משוך בעדינות את הפה ווים והבטן לכיוונים שונים נפרדים בסוף סימטרית תולעת מאזור הראש ולחשוף את הקרביים של תולעים (איור 3C).
הערה: מערכת העצבים להיות שלובים זה בזה עם קנה הנשימה, מערכת העיכול. Not גזור מערכת העצבים מן כל רקמות כדי למנוע חיתוך העצבים ההיקפיים יורד. - להקניט את מערכת העצבים, מערכת העיכול, הנשימה עם מלקחיים (דמות תלת-ממד).
- במידת הצורך, לשבש את מחסום הדם מוח על ידי באופן ידני transecting מערכת העצבים האחורי כדי האונות במוח במספריים האביב Vannas.
הערה: זה צריך להיעשות בהתבסס על המאפיינים physiochemical של החומר הכימי בשימוש. הקו האדום ב איור 4A היא נקודת חיתוך המוצע מערכת העצבים transected עם שלם יורד היקפיים עצב גזעי שמוצג באיור 4B. מערכת העצבים transected מוכן לניסויים לאחר סיום שלב 3.2.5.
4. חוץ-תאית הקלטה של דרוזופילה CNS.
- להכין מערכת העצבים הקלטה.
- משוך על אלקטרודה פיפטה מזכוכית של נימים זכוכית בורוסיליקט כדי התנגדות של 5-15 mΩ.
- הכנס מערכת העצבים transected תא שעווה שמכיל 200 µL של תמיסת מלח. תהדק את מספר הזיהוי האישי חרקים ללא ציפוי עם הסרטון תנין מולחמים החוט הקרקע והכנס את ה-pin לתוך תמיסת המלח כדי להשלים את המעגל.
- שימוש של micromanipulators, אוריינט האלקטרודה עד הסוף סימטרית של מערכת העצבים transected. לחסל את ההקלטה של רעש רקע על-ידי התאמת רמת הסף בתוכנה רכישה/ניתוח לפני הפנייה גזעי עצבים היקפיים.
- לצייר כל העצבים ההיקפיים נוח אל האלקטרודה יניקה על ידי הפעלת לחץ שלילי קלה על המזרק.
הערה: הבסיס ירי תדירות הוא מתואם על מספר הנוירונים נמשכים אל האלקטרודה שבו נוירונים יותר לעיתים קרובות לגרום עמידות מוגברת של האלקטרודה.
- התחל הקלטה חוץ-תאי של CNS יורד פעילות העצבים.
- להתחיל את ההקלטה על הנתונים רכישת תוכנת ולפקח הבסיס ירי תדר. לאפשר את קצב הירי equilibrate במשך 5 דקות לפני איסוף בסיסית ירי קצב נתונים.
- למחוק את הכנה והקלטה אם התבנית של ירי של טיפול בקרה אינה דומה לזה המוצג באיור 5Aדפוס המתפרצת.
הערה: דפוס שונה של ירי מציע פעילות חריגה או בלתי יציב של מחולל תבנית מרכזי, אשר יכול לשנות תפקוד עצבי. - לאחר 5 דקות, להוסיף 200 µL של תמיסת מלח + רכב להביא את הנפח הכולל של התא µL 400 להתחיל בקרת הקלטה ירי המחירים.
- לאחר התוכנית הבסיסית כבר הוקמה (3-5 דקות), לסגת µL 200 של תמיסת מלח ולהוסיף 200 µL של הסוכן ניסיוני solubilized בתוך תמיסת מלח.
הערה: דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) הוא הממס המומלצת עבור תרכובות lipophilic, לא יעלה על 0.1% v/v. - החל ריכוז סמים באופן סדרתי (נמוך כדי ריכוזים גבוהים), להקליט את כל הריכוז עבור תקופה בחר (שנקבע על ידי החוקר בהתבסס על התכונות הכימיות של סמים29). תווית זו נקודת זמן של סמים יישום בתוכנה רכישה/ניתוח על-ידי הכללת תגובה הכוללת את התרופה ואת הריכוז הסופי.
הערה: ירי פעילות של מערכת העצבים ייפגעו בכ-10-20% לאחר 30-50 דקות לאחר הקרע לכן, פקדים ללא טיפול מתאים, יש לבצעו ו טיפולים תרופות לא יעלה על תקופה זו.
- לנתח את הנתונים.
הערה: מספר ניתוחים שניתן לבצע על הנתונים שנאספו, כגון שינויים פוטנציאל הפעולה התפרצויות29, ספייק waveform משרעת ואת משך הזמן, וכן קביעת ספייק רשע תדרים אחרי סמים-טיפול-26,-30 , 31 , 32. הנפוצה ביותר היא בודקת את השפעת תרופה יש לתדרי ספייק רשע לאורך תקופת זמן, אשר מתוארת להלן שצוין.- משיבים ספייק רשע תדרים על-ידי בחירת האזור כולו עניין (קרי, הטיפול בסמים בתקופה) ולקבוע ספייק רשע תדרים באופן אוטומטי באמצעות "Datapad" הממוקם בסרגל הכלים הראשי של הרכישה/ניתוח תוכנה.
- לקבוע את תדירות ספייק רשע של מערכת העצבים לאחר הטיפול בתרופה על תדירות ספייק רשע של הפקד הרכב (בסיסית). לחשב שיעור שינוי של ירי קצב לאחר הטיפול באמצעות הנוסחה: (התייחסו תדירות תדר/בסיסית) × 100.
- השתמש ספייק רשע תדרים או אחוזים בירי של פקד עבור כל ריכוז כדי לבנות את עקומת התגובה ריכוז עם תקן ותוכנה גראפית.
- לבצע ניתוח סטטיסטי (למשל, אינטראקצית t-מבחן) כדי לקבוע את חשיבות בין נקודות זמן, ריכוז או טיפולים תרופות.
הערה: קיימות שתי שיטות ראשיות הפקת וניתוח עקומות הריכוז-תגובה. השיטה הראשונה היא ריכוז אחד לכל בהכנה. כאן הקצב ספייק של ריכוז יחיד הוא מנורמל לקצב ספייק בסיסית להכנה בכל. היתרונות מופחתים להפעיל את התכשיר בשל קוצר זמן ההקלטה, בעוד למלכודות הוגדלה לנתיחה זמן כי שיטה זו יכלול 5-7 ההכנות CNS בודדים לכל ריכוז, וברים שגיאה גדולה יותר על הנתונים בממוצע הגדר. השיטה השנייה היא ריכוז מרובים לכל בהכנה. כאן, הקצב ספייק עבור כל אחד הריכוזים 3-5 הם מנורמל ל ספייק בסיסית באותו הקצב. היתרונות הם פחות זמן לנתיחה ומשוכפלת פחות השתנות בין עבור ריכוז סמים, ואילו למלכודות הדרישה של משחק מהיר סמים ולא ידוע השפעה הטיפולים ריכוז התרופה הקודמת על טיפולים כימיים עוקבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פעילות ספונטנית של העצבים ההיקפיים יורד הנובעים ממערכת העצבים המרכזית דרוזופילה ניתן לצרוב בעזרת אלקטרודות היניקה חוץ-תאית הפארמצבטית עקבית. פעילות ספונטנית נכרת, transected דרוזופילה CNS מייצר תבנית מחזורית השפרצה עם s 1-2 של ירי עם 1 s של יד פעילות השבתה הדרגתית. לדוגמה, מערכת העצבים הוא ליד השבתה הדרגתית (1-2 Hz) של 0.5-1 s, ואחריו פרץ (100-400 Hz) של 1 s ולאחר מכן מחזירה למצב השבתה הדרגתית ליד (1-2 Hz) עבור 0.5-1 s (איור 5A). דפוס ירי זה חוזר על עצמו כל s 2-3. התדירות פריקה ספייק הממוצע של CNS דרוזופילה נע בין כ- 20-50 Hz במשך 3-5 דקות, כאשר הסף מוגדר מעל הרעש בסיסית. הבסיס ירי תדירות הוא מתואם על מספר הנוירונים היקפיים נמשכים אל האלקטרודה והלוטרה הנוצרת בין אלקטרודה כגדולים את הגרעינים הגחון. חשוב, יישום של דימתיל סולפוקסיד ממיס כימי-ריכוז סופי של 0.1% אינו משנה את ספייק פריקה תדירות דרוזופילה CNS (איור 5A).
הכנת אלקטרופיזיולוגיות מספק שיטה לאפיון המאפיינים סינאפסות או דיכאון של מולקולות קטנות שונות בתדר ספייק של מערכת העצבית חרקים מאופיין היטב. Propoxur, מעכב הידוע של חרקים אצטילכולין אסטראז (AChE), neuroexcitant, גדלה תדירות פריקה ספייק transected דרוזופילה CNS באופן תלוי-ריכוז (איור 5B). להפך, גאמא אמינו בוטירית (GABA), מוליך עצבי מעכבות ידוע הפועלים על תעלת כלוריד בתיווך גאבא חרקים, זה neurodepressant האופטימיזציות התדר פריקה ספייק באופן תלוי-ריכוז (איור 5C ). כלומר הפרשות ספייק תדרים יכול להיקבע על-פני התקופה מוקלטות עבור כל ריכוז לאפשר הבנייה של עקומת התגובה ריכוז כדי לקבוע ריכוז אפקטיבי של 50% (EC50) כדי מביאות לתגובה. כאן, propoxur מוצג שיש של EC50 של 338 nM (95% מרווח הביטחון (CI): 241-474; hillslope: 1.8; r2: 0.77) עם ריכוז של 1 מיקרומטר בהפקת עירור מקסימלי של דרוזופילה CNS ב 300% פעילות של שליטה (איור 5 D)26. גאבא מוצג שיש של IC50 מ מ 1.1 (95% CI: 0.7-1.5; hillslope: 1.5; r2: 0.95) עם עיכוב מקסימלי-5 מ מ (איור 5E).
לעיתים קרובות, הגששים המולקולרי של מערכות עצביות אינם מסוגלים לשמש מבחני פיזיולוגיים או רעילות עקב היעדרם של מאפיינים physiochemical ראוי לאפשר חדירת מחסום הדם מוח. למשל, monomeric tacrine הוא חזק (ca. 200 ננומטר) המדכא של כאב חרקים33, עדיין אינו משנה את תדירות ספייק שלם דרוזופילה CNS (איור 6A). עם זאת, שיבוש של lamella עצבית, את מחסום הדם מוח באמצעות חיתוך האחורי כדי האונות במוח הביא לעלייה מיידית ליד בתדירות ספייק דרוזופילה CNS לאחר חשיפה מיקרומטר 100 monomeric tacrine ( איור 6B). נתונים דומים כבר שתואר לעיל30.
איור 1: טוחנות CNS מן השלישית-לחלל melanogaster דרוזופילה. חצים הצבע מבנים אנטומיים שונים של מערכת העצבים התואמים התוויות. סרגל קנה מידה מייצג 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הגדרת אלקטרופיזיולוגיה המשמש לביצוע הקלטות חוץ-תאית. (A) כלוב פאראדיי; הטבלה רטט (B) ; (ג) לנתח מיקרוסקופ; מגבר הפרש ac/DC (ד) ; צג השמע (E) ; אלימינייטור רעש (נ) ; מערכת רכישה של הנתונים (G) ; במעבדה פועל המחשב (H) תרשים תוכנת pro; (א) כבל סיב אופטי עם מקור תאורה חיצוניים; Micromanipulator (J) ; (K) microelectrode מחזיק עם לחץ היציאה עם זכוכית אלקטרודה והכנת המנה שעווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שיטת excising מערכת העצבים מן השלישית-הימצאותן. (א) תולעים שלמות שקועים µL 200 של תמיסת מלח. החץ מצביע על ווים הפה המשמשים עבור הפרדה של קיר הגוף. (B) שני זוגות של מלקחיים ממוקמים באמצע את התולעת, על ווים הפה כדי להתחיל ההפרדה של קיר הגוף. (ג) לגוף החומה מופרד על ידי הפעלת לחץ קל ומתמשך כדי לחשוף את הקרביים. (ד) CNS בבירור (החצים הלבנים), לעיתים שזורה את הקרביים. סרגל קנה מידה מייצג 1000 מיקרומטר, 750 מיקרומטר, מיקרומטר 500 ומיקרומטר 200 עבור לוחות A, B, C ו- D, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שיבוש מחסום הדם מוח על ידי מערכת העצבים transecting. (א) CNS שלם עם יורד העצבים נראה בבירור, בסוף הגרעינים הגחון סימטרית. הקו האדום מציין המיקום של transecting מערכת העצבים לשבש BBB. (B) A transected CNS בסיום הגרעינים הגחון עדיין לחשוף את הנוירונים יורד זמן סימטרית. יכול להיות מושלך את הגרעינים הגחון. סרגל קנה מידה מייצג מיקרומטר 200 עבור שני לוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: הקלטות Neurophysiological של מערכת העצבים של הזחל השלישית-לחלל של melanogaster ד. עקבות פריקה עצב נציג לפני ואחרי חשיפה (א) דימתיל סולפוקסיד propoxur (B) , גאבא (C) . הירי הראשוני תדרים בדוקרנים/s (Hz) עבור ניסוי ניתנת משמאל כל עקבות. ריכוז-תגובה ' עקומות ' עבור propoxur גאבא (ה) ו- (ד) כדי CNS פריקה העצב של הזחלים melanogaster ד מן הקלטות משוכפל (n = 3-5 ריכוזי לפי העקומה, לריכוז כל עותק משוכפל לפחות 5 פעמים). החצים מייצגים נקודה של יישום סמים. נקודות נתונים מייצגים רשע אחוז גידול של בסיסית ירי קצב, קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. כאשר קווי שגיאה נעדרים, זה כי הם קטנים יותר מהגודל של הסמל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: גדל חדירה של tacrine לתוך מערכת העצבים לאחר חיתוך של מערכת העצבים. הקלטות נציג של (א) שלם ו- (B) transected הזחל CNS נחשפים tacrine monomeric, אשר היה מוחל על החץ. הירי הראשוני תדרים בדוקרנים/s (Hz) עבור ניסוי ניתנת משמאל כל עקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרטים באתר וידאו משויך, טקסט סיפקו השלבים החשובים על מנת להקליט את פעילותן ואת ספייק פריקה תדר של דרוזופילה CNS ex-vivo. יעילות ניתוח הוא ההיבט הקריטי ביותר של השיטה כי קצר או מספר הנוירונים יורד תפחית את הבסיס ירי שתמורתו יביא סטיות גדולות בין משכפל. אולם, ברגע הטכניקה לנתיחה שולט, הנתונים שנאספו עם assay הזה הם מאוד amendable עבור מגוון רחב של דיסציפלינות הדירים. שינוי אחד בשיטה המתוארת הוא ההכללה של מערכת ממוכנת שמלבלב שימנעו את הצורך באופן ידני pipette הפתרונות מלוחים והכימיות לתוך החדר CNS. הכללה של מערכת שמלבלב תפחית הפרעות של מערכת העצבים במהלך ההקלטות, אשר מתרחשות מדי פעם במהלך היישום של סמים עם פיפטות ידנית.
שיטה זו אלקטרופיזיולוגיות מנצלת את. התועלת לקראת השתלבות מחקר גילוי סמים/חרקים. יתר על כן, ההכנה הזאת היא נוטה? הכיתה להדגמה של מושגי יסוד בנוירופיזיולוגיה. השיטה דורשת צנוע יחסית להשקעה פיננסית וטיסה זמן הכנה מינימלי תוך מתן הקלטה יציב ועמיד, זה יכול להיות מועסק כדי להדגים את השפעת תרופות לתפקוד של מערכת העצבים המרכזית. למשל, הנטל הכספי של המתקן ההקלטה הוא תמורת עלות התחלתית של $10,000 דולר עם קטין עלויות עוקבות (למשל, מלוחים מלחי, תחזוקה המושבה לעוף, וכו '). עוד יותר, הזמן הדרוש של CNS הכנה כדי ההקלטה הראשונה הוא כ 10 דקות. דרוזופילה אמנם קל לשמור על תרבות בתוך מעבדה או בכיתה, יצוין כי assay היניקה אלקטרודה זו גם ניתן לבצע באמצעות מערכת העצבים של זבוב, זבוב דומסטיקהרימות זבוב כנראה אחרים muscoid , גם כן. המצב את המזיק של זבוב דומסטיקה משק מרמז assay הזה יכול להיות של השירות משמעותית למחקר תוכניות מכוון כדי לאפיין את הרגישות עצביים של הזבובים של אוכלוסיות שונות או כדי לקבוע את העוצמה של לאחרונה שפותחו neurotoxicants על השליטה מכת בסופו של דבר.
בנוסף אפיון את העוצמה של סמים, ההכנה הזאת ניתן לאפיין את ההשפעה של מוטציות גנטיות ומניפולציה על הפעילות של מערכת העצבים דרוזופילה . עבודה קודמים הראו את נוקאאוט CNS ספציפיים של קידוד גנטי שתעלת אשלגן (קיר) יישור פנימה גדלה התדירות הבסיסית CNS ירי על ידי כ קיפול כפול בהשוואה לשלוט זבובים31. נתונים אלה היו בשילוב תרופתי נתונים לשער בסופו של דבר שהערוצים וקיר תפקיד פיזיולוגי לשרת לתפקוד מערכת העצבים דרוזופילה .
למרות טכניקה זו מייצג של assay חזק כדי לבדוק השערות רעילות, פיזיולוגיים מגוונים, המגבלות וזמינותו קיימות, יש לקחת בחשבון. למשל, את הנתונים שנוצרו באמצעות אלקטרודה היניקה הקלטות נדירות לספק ראיות חותכות על המצב המדויק של פעולה של סמים או תפקיד פיזיולוגי המדויק עבור ערוץ יון ואת חייבת להילמד במשולב עם מדידות מבוססת תא נוסף, כגון אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון. מגבלה נוספת שיטה זו הוא כי הקולטנים השונים, סוגי המשנה של ערוץ יון לא להשפיע על קצב ספייק CNS בצורה שווה. לכן, זה אפשרי כי אפנון של תת סוג ספציפי של קולטן או תעלת יונים עשויים לא להשפיע משמעותית את קצב ספייק של מערכת העצבים נכרת, אבל אולי אכן יש השפעה קריטית על תפקוד מערכת העצבים כוללת ו/או שילוב של אותות.
למרות המגבלות קיימות, הנתונים שנאספים באמצעות אלקטרודה היניקה הקלטות לספק איכות הוכחה הרעיון הנתונים ולאפשר חוקרים ליצירת היפותזות לגבי מנגנון פעולה הניתנים לאימות באמצעות מתח-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, ניתוחים הביוכימי, או באמצעות בדיקות תרופתי נוסף. לדוגמה, האחרון בוצע כדי לבדוק את ההשערה כי תכשיר דוחה חרקים, N, N- Diethyl-3-methylbenzamide (DEET), היה מעכב את מערכת octopaminergic חרק CNS בניסיון לתאר את המנגנון של רעילות על יתושים, זבובים26. DEET הוצגה להיות neuroexcitant של פעילות מערכת העצבים המרכזית זבוב הבית, גם שינו את הפוטנציאל postsynaptic סינאפסות עורר צומת עצב-שריר, אשר שימוש, glutamatergic מערכות, בהתאמה26. נתונים אלה הציע כי DEET איננה עלול לגרום רעילות באמצעות שימוש עיכוב, כפי שהיה קודם לכן הציע34. מקליט את תדירות פריקה של הזבוב CNS לאחר חשיפה phentolamine, אנטגוניסט octopamine הידוע, הראה של עיכוב מוחלט של neuroexcitation בתיווך DEET, אבל לא כל כך של propoxur, שסיפקה עדויות משמעותיות DEET היה יותר ככל הנראה להשפיע על המערכת octopaminergic מאשר כאב26. ערכות נתונים שפורסמו אלה להדגיש את מגוון השערות ועל תנאים ניסיוני יכול ייחקרו באמצעות שיטה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות גב' Rui חן דיסקציה של תמונות של דרוזופילה CNS שמוצג הדמויות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
