Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å registrere den synkende elektriske aktiviteten i Drosophila melanogaster sentralnervesystemet aktivere kostnadseffektive og praktisk tester av farmakologiske agenter, genetiske mutasjoner av nevrale proteiner, og/eller rollen uutforsket fysiologiske trasé.
Abstract
Fleste av de tilgjengelige insektmidler målrette nervesystemet og genetiske mutasjoner av virvelløse nevrale proteiner gi ofte skadelige konsekvenser, men dagens metoder for innspilling nervesystemet aktivitet av en individuell dyret er dyrt og arbeidskrevende. Dette inntaks elektrode utarbeidelse av tredje-skikkelsen larver sentralnervesystemet i Drosophila melanogaster, er et tett system for tester fysiologiske effekter av neuroactive agenter, fastsette fysiologiske rollen til forskjellige nevrale veier til CNS aktivitet, samt påvirkning av genetiske mutasjoner nevrale funksjonen. Dette ex vivo preparatet krever bare moderat dissekere dyktighet og elektrofysiologiske kompetanse til å generere reproduserbar opptak av insekt neuronal aktivitet. En rekke kjemiske modulatorer, inkludert peptider kan deretter brukes direkte til det nervøse systemet i løsning med fysiologiske saltkildene å måle påvirkning på CNS aktiviteten. Videre, genetisk teknologi, for eksempel GAL4/UAS systemet, kan brukes uavhengig eller i tandem med farmakologiske agenter for å fastslå rollen bestemt ionekanaler, transportører eller reseptorer leddyr CNS-funksjonen. I denne sammenheng er analyser beskrevet her av betydelig interesse insektmiddel toxicologists, insekt fysiologer og utviklingsmessige biologer som D. melanogaster er en etablert modell organisme. Målet med denne protokollen er å beskrive en elektrofysiologiske metode for å aktivere måling av electrogenesis av det sentrale nervesystemet i modellen insekt, Drosophila melanogaster, som er nyttig for testing av et mangfold av vitenskapelige hypoteser.
Introduction
Det overordnede målet med denne tilnærmingen er å aktivere forskere til å raskt måle electrogenesis av sentralnervesystemet (CNS) i modell insekt, Drosophila melanogaster. Denne metoden er pålitelige, raske og kostnadseffektivt å utføre fysiologiske og toksikologiske eksperimentering. CNS er avgjørende for liv og derfor fysiologiske veier avgjørende for riktig nevrale funksjon har blitt undersøkt grundig i et forsøk på å forstå eller endre nevrale. Karakteristikk av signalveier i leddyr CNS har aktivert oppdagelsen av flere kjemiske klasser av insektmidler som forstyrrer virvelløse nevrale funksjonen å indusere dødelighet samtidig off-målet konsekvenser. Dermed er muligheten til å måle nevrale aktiviteten av insekter av betydelig interesse insekt toksikologi og fysiologi siden nervesystemet er vevet flertallet av distribuert insektmidler1. Likevel fortsatte vekst av grunnleggende og anvendt kunnskap om insekt nervesystemet krever avanserte nevrofysiologiske teknikker som er begrenset i gjennomførbarhet, siden dagens teknikker er arbeidskrevende og krever en høy regning, insekt nevrale cellelinjer er begrenset og/eller begrenset tilgang til de sentrale synapser av de fleste leddyr. Foreløpig krever karakterisering av de fleste insekt nevrale proteiner målet å være klonet og heterologously uttrykk for påfølgende stoffet funnet og elektrofysiologiske innspillinger, som ble beskrevet for insekt innover likeretter kalium kanaler2 , insekt ryanodine reseptor3, mygg spenning-sensitive K+ kanaler4og andre. For å redusere behovet for heterologous uttrykk og potensialet for lav funksjonelle uttrykk, Bloomquist og kolleger å indusere en neuronal fenotypen i kulturperler Spodoptera frugiperda (Sf21) celler som en ny metode for insektmiddel oppdagelsen5,6. Disse metodene gi en gyldig tilnærming for utvikling av ny kjemi, men de opprette ofte en uoverstigelig flaskehalsen for karakterisering av farmakologiske agenter, identifisere virkningsmekanismer insektmiddel motstand, og karakterisering grunnleggende fysiologiske prinsipper. Her beskriver vi en ex vivo metode som gjør innspillingen av elektrisk aktivitet fra en modell insekt som har formbare genetikk7,8,9 og kjent uttrykk mønster av nevrale komplekser10,11,12 aktivere karakterisering av resistens på nivået av nerve, virkemåte av nyutviklet narkotika og andre toksikologiske studier.
D. melanogaster, er en felles modell organisme for å definere insekt nevrale systemer eller insektmiddel virkningsmekanismen og har blitt etablert som en tilpasset modell organisme for studier av toksikologiske13farmakologiske14 ,15, nevrofysiologiske16og patofysiologiske17,18,19,20 prosesser av virveldyr. D.melanogaster er en holometabolous insekt som utfører fullstendig forvandling, inkludert en larver og pupal stadium før reproduktiv voksen scenen. Hele utviklingsprosessen, nervesystemet gjennomgår betydelige remodeling på ulike livsstadier, men larver CNS vil være fokus for denne metoden. Fullt utviklet larver CNS er anatomisk enkel med thoracic og abdominal segmenter som er smeltet og danner det ventrale ganglion, som representerer en rekke gjentatt og nesten identisk neuromeric enheter21,22. Synkende motor nerver kommer fra caudal slutten av subesophageal Ganglion og ned for å innervate kroppen veggen muskler og visceral organer næringsplante. Figur 1 beskriver grov anatomi av larver Drosophila CNS.
Drosophila blod - hjernebarrieren (BBB) utvikler på slutten av embryogenesis og er dannet av subperineurial gliacellene (SPG)21. SPG cellene danner mange filopodia-lignende prosesser som sprer seg for å etablere et sammenhengende, veldig flatt, endothelial-lignende ark som dekker hele Drosophila CNS23. Drosophila BBB har likhetstrekk til vertebrate BBB, som inkluderer bevare homeostase av nevrale microenvironment ved å kontrollere oppføring av næringsstoffer og xenobiotics i CNS21. Dette er en forutsetning for pålitelig nevrale overføring og funksjon, men beskyttelse av CNS av BBB begrenser gjennomtrengning av syntetiske stoffer, de fleste peptider og andre xenobiotics24,25, som introduserer potensialet problemer når karakteriserer potencies av små-molekylet modulatorer. Metoden bruker en enkel transection å avbryte denne barrieren og gi klar farmakologiske tilgang til de sentrale synapser.
Den største styrken til metodene som beskrives er enkelhet reproduserbarhet, og relativt høy gjennomstrømming kapasitet iboende til dette systemet. Protokollen er relativt lett å mestre, oppsettet krever liten plass, og bare en innledende finansielle inngang er nødvendig som er redusert til reagenser og forbruksvarer. Videre er metoden beskrevet helt amendable å registrere sentrale synkende nerve aktiviteten av huset fly, Musca domestica26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utstyr og materialer
- Klargjør de nødvendige komponentene (oppført i Tabell for materiale) av elektrofysiologi riggen til å utføre sugekraft elektrode opptak av Drosophila CNS.
Merk: Før eksperimentering er det nødvendig å konstruere kamre for Disseksjon av Drosophila CNS og brukes til bading Ganglion i saltvann under opptak. Nedenfor ser du en trinnvis oversikt over kammer konstruksjon. - Forberede larver kammeret.
- Smelt svart voksen med en kokeplate.
- Hell 2 mL smeltet voks i et kammer med største volum 2-2.5 mL.
- La voksen kjøle, og forherde for ca 2 timer.
- Bruke et barberblad for å skjære et hull i herdet voksen som vil holde et volum på 500 µL, som har et areal på ca 0,5 cm2 og en dybde på ca. 0,25 cm.
2. utstyr og programvarekonfigurasjon
Merk: Oppsettet av ekstracellulære innspillingen er kort beskrevet nedenfor.
- Forberede utstyr disseksjon og opptak.
- Plasser vev forberedelse, mikroskop, suge elektrode, micromanipulators, lyskilden i buret for å redusere støy og eliminere overflødig elektrisk felt (figur 2).
- Koble (fortrinnsvis loddetinn) bakken og positiv ledninger på skjermet alligator klipp som skal kobles til bad og microelectrode innehaveren, henholdsvis.
Merk: Loddet og utsatte ledninger kan dekkes med aluminiumsfolie å redusere støy. - Koble til bakken og positive ledningene til inngangen 1 av AC/DC differensial forsterker.
- Koble data oppkjøpet systemet AC/DC differensial forsterkeren ved koble bajonett Neill-Concelman (BNC) kabelen fra inngang 1 av oppkjøpet datasystemet til kanal 1 utgangen forsterkeren.
Merk: Det anbefales å innlemme en 50/60 Hz støy eliminator mellom den oppkjøp programvaren og forsterkeren. Bruk av en BNC T-kobling er nødvendig. - Eventuelt ta en lyd skjerm i oppsettet ved å koble inn 1 for lyd å inngang 1 av den oppkjøp programvaren.
- Fyll 10 mL sprøyte med saltvann og koble den til press-porten på elektrodeholderen.
Merk: Kontroller at ingen luftbobler eksisterer mellom sprøyten, Ag/AgCl pellets og elektroden åpningen.
- Forberede programvaren disseksjon og opptak.
Merk: Omrisset av metoder for programvare setup er basert på kjøp/analyse-programvaren som er oppført i Tabellen for materiale som vil digitalisere rå elektrisk produksjon og konvertere data pigge frekvens. Men andre kan brukes og flere opptak konverteringer kan brukes.- Åpne oppkjøpet/analyse programvare.
- Klikk på "setup" på hovedverktøylinjen og velg "channel innstillinger", som åpner en dialogboks.
- Redusere antall totale kanaler til tre.
- Velg en rekke 100 for kanal 1, mV.
- For kanal 2, klikk på kategorien "beregning", som vil åpne en miste-ned meny. Velg "syklisk målinger," som åpner en dialogboks.
- Velg kanal 1 som kilde. På miste ned meny måling, velger du enheten pigg på arrangementer. Til slutt i området oppdagelsen innstillinger fra rullegardinmenyen Velg enkel terskel.
- For å konvertere den elektriske aktiviteten til en sats tegneområdet i hertz, 3rd kanalen angis i aritmetiske modus: input vinduet inn "1000*smoothsec(ch2,2)". Velg som enheter slipp ned menyen hertz.
Merk: Vellykket opptak kan utføres med flere forskjellige opptak oppsett, men "Enhet spike hendelser og enkel terskelen" er trolig den enkleste, fordi det gir mulighet for justering av terskelen ovenfor bakgrunn aktiviteten for hver enkelt innspilling. Under en innstillingen for "Egendefinert kildekode Input" øke reproduserbarhet data forutsatt bakgrunn aktiviteten ikke er forskjellig mellom opptak. - Lukk dialogbokser for å gå tilbake til hovedskjermbildet. Y-aksen skal uttrykkes i Hz og x-aksen i tid.
3. dissekere og forberede larver Drosophila CNS
Merk: Metoder for larver CNS disseksjon er tydelig illustrert i Hafer og Schedl27, men metodene tidligere publiserte reduser lengden på synkende neurons som er viktige for måling av spike frekvens. Her er en ekstra metode skissert for å avgiftsdirektoratet larver CNS som opprettholder, intakt synkende neurons.
- Saltvann forberedelse.
- Forberede disseksjon og opptak saltvann på følgende i mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre (HEPES); sjarmere pH til 7.25.
- Dissekere den larver Drosophila CNS.
- Identifisere og trekke ut en vandrende tredje-skikkelsen Drosophila melanogaster fra kultur medisinglass og plass til 200 µL saltoppløsning (figur 3A).
- Forstå munnen kroker med et par fine tang og forstå magen av larve med et par pinsett (figur 3B).
Merk: Gjelde ikke for mye press for magen som dette kan medføre rive av tynne cuticular laget av larve. - Trekk forsiktig munnen kroker og magen i forskjellige retninger for å skille caudal slutten av larve fra hodet regionen og utsette innvollene av larve (Figur 3 c).
Merk: CNS vil være sammen med trachea og fordøyelseskanalen. Ikke klippe CNS fra alle typer vev for å hindre kutte synkende perifere nerver. - Erte CNS av fordøyelseskanalen og luftrøret med tang (figur 3D).
- Om nødvendig kan du avbryte blod-hjernebarrieren av manuelt transecting CNS bakenfor cerebral lobes med Vannas våren saks.
Merk: Dette bør gjøres basert på egenskapene physiochemical av kjemiske brukes. Den røde linjen i figur 4A er foreslått transection punktet og transected CNS med intakt synkende perifere nerve badebukser vist i figur 4B. Transected CNS er klar for eksperimentering etter trinn 3.2.5.
4. ekstracellulære opptak av Drosophila CNS.
- Forberede CNS opptak.
- Dra en glass pipette elektrode fra Borosilikatglass kapillærer å en motstand av 5-15 mΩ.
- Sett inn transected CNS i voks kammeret som inneholder 200 µL saltoppløsning. Klemme en ubestrøket insekt pin med alligator klipp loddet til bakken ledningen og sett pinnen inn saltkildene å fullføre krets.
- Bruker micromanipulators, plasser elektroden til caudal slutten av transected CNS. Fjerne opptak av bakgrunnsstøy ved å justere terskelverdien nivået i oppkjøpet/analyse programvare før du kontakter perifere nerve stammene.
- Trekke noen praktisk perifere nerver i sugekraft elektroden ved å bruke liten negative trykket på sprøyten.
Merk: Den opprinnelige avfyring frekvens er korrelert til antall nevroner trukket inn elektroden der flere neurons ofte resultere i økt motstand av elektroden.
- Begynn ekstracellulære innspillingen av CNS synkende nerve aktivitet.
- Starte innspillingen i den oppkjøp programvaren og overvåke grunnlinjen avfyring frekvens. Tillate brenning hastighet til equilibrate i 5 minutter før du samler inn planlagte skyte rate-abonnement.
- Kast forberedelse og opptak Hvis mønsteret for avfyring av kontroll behandling ikke er en sprengning mønster lik som vist i figur 5A.
Merk: Endrede mønster av antyder unormal eller ustabil aktivitet av sentrale mønster generator, som kan endre nevrale funksjon. - Etter 5 min, Legg 200 µL av saline + kjøretøy å bringe det totale volumet av kammeret til 400 µL begynne innspilling avfyring priser.
- Når planlagte er etablert (3-5 min), trekke 200 µL saltoppløsning og legge 200 µL av eksperimentelle agent solubilized i saltvann.
Merk: Dimethyl sulfoxide (DMSO) er den anbefalte løsningsmiddel for lipofile forbindelser og bør ikke overstige 0,1% v/v. - Bruke narkotika konsentrasjoner på en føljetong måte (lav til høy konsentrasjoner) og registrere hver konsentrasjon i en utvalgt periode (bestemmes av etterforskeren basert på egenskapene kjemiske stoffet29). Merk dette tidspunkt stoffet programmet i oppkjøpet/analyse programvare ved å inkludere en kommentar som inneholder stoffet og endelige konsentrasjonen.
Merk: Skyting aktivitet av CNS vil avta med ca 10-20% etter 30-50 min etter dissection og derfor aktuelle ubehandlet kontroller skal utføres, og medikamentelle behandlinger bør ikke overstige denne tidsperioden.
- Analysere dataene.
Merk: Flere analyser kan utføres på de innsamlede dataene, for eksempel endringer i handlingen potensial serieopptak29, spike bølgeform amplitude og gang løpet og bestemme mener spike frekvenser etter narkotika behandling26,30 , 31 , 32. de vanligste bestemmer påvirkning et stoff må bety spike frekvenser over en angitt periode, som er beskrevet nedenfor.- Tabulere mener spike frekvensene ved å velge hele regionen rundt (dvs. behandlingen periode) og bestemme mener spike frekvenser automatisk gjennom "Datapad" på hovedverktøylinjen oppkjøpet/analyse programvare.
- Bestemme mener spike frekvensen av CNS etter behandling å bety spike hyppigheten av kontrollen kjøretøy (grunnlinje). Beregner prosentvis endring for avfyring rate etter behandling av formelen: (behandlet frekvens/Baseline frekvens) × 100.
- Bruk mener spike frekvenser eller prosent avfyring av kontroll for hver konsentrasjon for å konstruere en konsentrasjon respons kurve med standard grafisk programvare.
- Utføre statistisk analyse (f.eks unpaired t-test) til å fastslå betydningen mellom tidspunkt, konsentrasjoner eller medikamentelle behandlinger.
Merk: Det finnes to primære metoder for å generere og analysere konsentrasjon svar kurver. Den første metoden er en konsentrasjon per individuell tilrettelegging. Her er topp hastighet på enkelt konsentrasjonen normalisert til grunnlinjen spike rate for hver forberedelse. Fordelene er redusert kjøre ned av preparatet grunn forkortet opptakstid, mens fallgruvene er økt disseksjon tid fordi denne metoden vil bestå av 5-7 personlige CNS forberedelser per konsentrasjon, og større feilfelt på gjennomsnitt data sett. Den andre metoden er flere konsentrasjoner per individuell tilrettelegging. Her topp satsen for hver av de 3-5 konsentrasjonene normalisert til samme opprinnelige topp hastighet. Fordelene er mindre disseksjon tid mindre variasjon mellom replikerer for narkotika konsentrasjoner, mens fallgruvene er kravet om en fort-fungerende narkotika og ukjent effekt av tidligere narkotika konsentrasjon behandlinger på etterfølgende kjemiske behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan aktivitet av synkende perifere nerver som oppstår fra Drosophila sentralnervesystemet kan registreres med konsekvent reproduserbarhet ekstracellulære sugekraft elektroder. Spontan aktivitet av den forbrukeravgift og transected Drosophila CNS produserer en syklisk mønster for sprengning med 1-2 s å skyte med ca 1 s i nærheten quiescent aktivitet. For eksempel CNS er nær quiescent (1-2 Hz) for 0,5-1 s, etterfulgt av en burst (100-400 Hz) for ca 1 s og returnerer til en nær passivisert tilstand (1-2 Hz) for 0,5-1 s (figur 5A). Dette skyte mønsteret gjentas hver 2-3-s. Gjennomsnittlig spike utslipp frekvensen av Drosophila CNS varierer fra ca 20-50 Hz over en 3-5 min periode, når terskelen er satt rett ovenfor planlagte støy. Den opprinnelige avfyring frekvens er korrelert til antall eksterne neurons til elektroden og segl dannet mellom elektrode munnstykket og de ventrale Ganglion. Viktigere, endrer anvendelse av den kjemiske løsemiddel DMSO på en siste konsentrasjon på 0,1% ikke spike utslipp frekvensen av Drosophila CNS (figur 5A).
Denne elektrofysiologiske forberedelse gir en metode for å beskrive egenskapene eksitatoriske eller depressant av ulike små molekyler på spike hyppigheten av et godt karakterisert insekt nevrale system. Propoxur, en kjent inhibitor av insekt acetylcholinesterase (verke), er en neuroexcitant og økt spike utslipp hyppigheten av den transected Drosophila CNS i en konsentrasjon-avhengige måte (figur 5B). Tvert imot, gamma - aminobutyric acid (GABA), en kjent inhibitory neurotransmitter opptre på insekt GABA-mediert klorid kanalen, er en neurodepressant og redusert spike utslipp frekvensen i en konsentrasjon-avhengige måte (figur 5C ). Mener spike utslipp frekvenser kan bestemmes over innspilte tidsperioden for hver konsentrasjon å aktivere byggingen av en konsentrasjon respons kurve elicit svar til 50% effektiv konsentrasjonen (EF50). Her propoxur er vist å ha en EF50 av 338 nM (95% konfidensintervall (CI): 241-474; hillslope: 1,8; r2: 0,77) med en konsentrasjon på 1 µM produsere maksimal magnetisering av den Drosophila CNS på 300% aktivitet kontroll (figur 5 D)26. GABA er vist å ha en IC50 1.1 mm (95% CI: 0,7-1,5; hillslope: 1,5; r2: 0,95) med maksimal hemming på 5 mM (figur 5E).
Ofte, kan molekylær sonder nevrale systemer ikke brukes i fysiologiske eller toksikologiske analyser på grunn av deres mangel på skikkelig physiochemical egenskaper at penetrasjonen av blod-hjernebarrieren. For eksempel, monomerisk Takrin er en potent (ca. 200 nM) hemmer insekt verke33, ennå ikke endrer spike frekvensen av intakt Drosophila CNS (figur 6A). Men resulterte avbrudd av nevrale lameller og blod-hjernebarrieren gjennom transection bakenfor cerebral lobes i en nesten umiddelbar økning i spike frekvensen av Drosophila CNS etter eksponering for 100 µM monomerisk Takrin ( Finne 6B). Lignende data har vært beskrevet tidligere30.
Figur 1: forbrukeravgift CNS fra tredje-skikkelsen Drosophila melanogaster. Piler peker til ulike anatomiske strukturer i CNS som svarer til etikettene. Baren skala representerer 250 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: elektrofysiologi oppsettet som brukes til å utføre ekstracellulære innspillinger. (A) buret; (B) vibrasjon tabellen. (C) dissekere mikroskop; (D) AC/DC differensial forsterker; (E) lyd skjermen; (F) støy eliminator; (G) data oppkjøpet systemet. (H) kjører datalab diagram pro programvare; (I) fiberoptiske kabelen med ekstern belysning kilde; (J) micromanipulator; (K) microelectrode holder med press-port med glass elektroden og forberedelse voks rett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: metode for excising CNS fra tredje-skikkelsen kryp. (A) intakt larve neddykket i 200 µL saltoppløsning. Pilen viser munnen kroker som brukes for å skille kroppen veggen. (B) to par tang er plassert i midten av larve og på munnen krokene begynne separasjon av kroppen veggen. (C) kroppen veggen er separert søker liten og kontinuerlig press for å utsette viscera. (D) CNS er synlig (hvite piler) og noen ganger er sammenvevd med viscera. Baren skala representerer 1000 µm, 750 µm, 500 µm og 200 µm for paneler A, B, C og D, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: avbrudd av blod-hjernebarrieren av transecting CNS. (A) intakt CNS med synkende nerver synlig på caudal slutten av de ventrale Ganglion. Den røde linjen angir plasseringen av transecting CNS å forstyrre BBB. (B) A transected CNS med caudal slutten av de ventrale Ganglion utsette lenge synkende neurons. De ventrale ganglia kan kastes. Baren skala representerer 200 µm for både paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: nevrofysiologiske opptak fra CNS av tredje-skikkelsen larver av D. melanogaster. Representant nerve utslipp spor før og etter eksponering (A) DMSO, (B) propoxur og (C) GABA. Første skyte frekvenser i toppene/s (Hz) for hvert eksperiment gis til venstre for hvert spor. Konsentrasjon-svar kurver for propoxur (D) og GABA (E) til CNS nerve utslipp av D. melanogaster larver replikerte opptak (n = 3-5 konsentrasjoner per kurve, med hver konsentrasjon replikert minst 5 ganger). Piler Representer tidspunkt stoffet programmet. Datapunkt representerer mener prosent økning av planlagte skyte rate og feilfelt representerer standardavvik. Når feilfelt er fraværende, er det fordi de er mindre enn størrelsen på symbolet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: økt penetrasjon av Takrin i nervesystemet etter transection av CNS. Representant opptak av (A) intakt og (B) transected larver CNS utsatt for monomerisk Takrin, som ble brukt ved pilen. Første skyte frekvenser i toppene/s (Hz) for hvert eksperiment gis til venstre for hvert spor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kontaktdetaljene i tilhørende video og tekst har gitt viktige trinn for å registrere aktiviteten og spike utslipp frekvensen av Drosophila CNS ex vivo. Disseksjon effekten er det viktigste aspektet ved metoden fordi kort eller få synkende neurons reduserer grunnlinjen skyte rate som fører til store avvik mellom gjentak. Men når disseksjon teknikken har blitt mestret, er data samlet med denne analysen svært reproduserbare og amendable for et bredt spekter av disipliner. En modifisering metoden beskrevet er inkluderingen av en automatisert overflod system som vil hindre måtte manuelt Pipetter saltvann og kjemiske løsningene i CNS kammeret. Inkludering av overflod vil redusere forstyrrelser i CNS under innspillingene, som av og til oppstår under bruk av legemidler med manuell pipetter.
Denne elektrofysiologiske metoden utnytter verktøyet forberedelse til innlemmelse i stoffet/insektmiddel oppdagelsen forskning. Videre er dette preparatet mottakelig for klasserommet for demonstrasjon av grunnleggende begreper innen nevrofysiologi. Metoden krever relativt beskjeden finansielle investeringer og minimal forberedelse samtidig gir en robust og stabil innspilling som kan brukes til å illustrere påvirkning av narkotika til funksjonen av fly CNS. For eksempel er den økonomiske byrden av opptak riggen en første kostnad på ca $10.000 USD med mindre påfølgende kostnader (f.eks saltvann salter, fly kolonien vedlikehold, osv.). Videre er tiden det tar fra CNS forberedelse til første ca 10 min. Selv om Drosophila er lett å vedlikeholde i kulturen i et laboratorium eller klasserom, bør det bemerkes at denne sugekraft elektrode analysen også utføres med CNS flue, Musca domesticaog sannsynligvis andre muscoid fly larver , også. Pest status Musca domestica til husdyr antyder denne analysen kan av betydelig forskning programmer satsing å karakterisere neuronal følsomheten av fluer fra ulike befolkningsgrupper eller å bestemme styrken på nylig utvikles neurotoxicants for eventuell kontroll av infestations.
I tillegg til karakterisere styrken på narkotika, kan dette preparatet brukes til å karakterisere innflytelsen av genetiske mutasjoner og manipulasjon på aktiviteten i nervesystemet Drosophila . Tidligere arbeid har vist at CNS-spesifikke knockdown genet koding innover likeretter kalium (Kir) kanalen økt planlagte CNS avfyring frekvensen ca 2-fold sammenlignet med kontrollere fluer31. Disse dataene ble kombinert med farmakologiske data til slutt spekulere fysiologiske rolle Kir kanalene tjene Drosophila nervesystemet funksjon.
Selv om denne teknikken representerer en kraftig analysen å teste ulike toksikologiske og fysiologiske hypoteser, begrensninger analysen eksisterer og må vurderes. For eksempel data generert gjennom sugekraft elektrode opptak sjelden gi bevis for nøyaktig modus av et stoff eller nøyaktig fysiologiske rolle for en ion kanal og må vi i tandem med mer cellen-basert mål, som patch klemme elektrofysiologi. En ekstra begrensningen til denne metoden er at de ulike reseptorer og ion kanal undertyper ikke påvirker CNS spike hastigheten på en tilsvarende måte. Derfor er det mulig at en modulering av en bestemt reseptor eller ion-kanalen undertype ikke kan betydelig påvirke spike frekvensen av forbrukeravgift CNS, men kan faktisk ha en kritisk virkning på totalt nervesystemet funksjon og/eller integrering av signaler.
Selv om begrensninger finnes, data samlet gjennom sugekraft elektrode opptak gir kvalitet proof-of-concept data og tillate forskere å generere hypoteser om mekanismer som kan valideres gjennom spenning-klemme elektrofysiologi, biokjemiske analyser, eller gjennom flere farmakologisk testing. For eksempel sistnevnte ble utført for å teste hypotesen at insektmiddel, N, N- Diethyl-3-methylbenzamide (DEET), var hemme octopaminergic systemet i insekt CNS å beskrive mekanisme toksisitet til mygg og flyr26. DEET viste seg å være en neuroexcitant flue CNS aktivitet og også forandret det vakte potensialet på eksitatoriske postsynaptic nevromuskulær junction, som er cholinergic og glutamatergic systemer, henholdsvis26. Disse dataene foreslo at DEET ikke var sannsynlig å indusere toksisitet gjennom cholinergic hemming, som var tidligere foreslått34. Opptak utslipp frekvensen av fly CNS etter eksponering for phentolamine, en kjent octopamine antagonist, viste en komplett hemming av DEET-mediert neuroexcitation, men ikke at propoxur, som gitt betydelige bevis at DEET var mer sannsynlig påvirker octopaminergic systemet verke26. Disse publisert datasett markere ulike hypoteser og eksperimentelle forhold som kan undersøkes med denne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Ms. Rui Chen for disseksjon og bilder av Drosophila CNS vist i figurene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A - Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
