Summary
Mate-bevogtning adfærd spiller en vigtig rolle i reproduktion af intertidale vandlopper af slægten Tigriopus. Metoder til at studere denne opførsel har dog ikke været godt beskrevet. Her beskriver vi metoder til: 1) individuel kultur af Jomfru Tigriopus dyr, og 2) kvantitativ analyse af deres mate-bevogtning adfærd.
Abstract
Vandlopper af slægten Tigriopus, som er fælles zooplankton i rocky tidevand puljer, vise precopulatory mate-bevogtning adfærd hvor en mandlig spænder en potentiel mate til at danne et par. Mens dette fænomen har tiltrukket interesse af forskere, har metoder til sin analyse ikke været godt beskrevet. Her vi beskrive procedurer for: 1) individuel dyrkning og iscenesættelse af Tigriopus ungfisk og voksne og 2) video-baseret analyse af deres mate-bevogtning adfærd. Metoden dyrkningsbaserede muliggør eksperimentelle kontrol af Afklip oplevelse af dyr samt mulighed for at spore deres udvikling før adfærdsmæssige test. Den analysemetode, der tillader kvantitative evaluering af flere aspekter af mate-bevogtning adfærd, herunder indfange forsøg af hanner og svømning bane af mate-bevogtning par. Selv om disse metoder blev oprindeligt oprettet for etologiske undersøgelser på Tigriopus, med passende ændringer de kan også anvendes til undersøgelser af andre zooplankton i forskellige forskningsområder, såsom fysiologi, toksikologi, og økologisk genetik.
Introduction
Intertidale copepoder af slægten Tigriopus er vidt udbredt i rocky høj intertidale pools på tværs af flere kontinenter1. Disse vandlopper udviser mate-bevogtning adfærd som en del af deres reproduktion, hvor en voksen mand fanger en potentiel mate (unge eller voksne) udnytte sine krogede første antenner før samleje (figur 1 og figur 2)2 ,3,4,5. Selv om dette fænomen har været et emne af etologiske og biokemiske undersøgelser for årtier2,3,6,7, detaljerede procedurer for undersøgelser af denne adfærd, herunder enkelte kultur af Jomfru dyr og kriterier for adfærdsmæssige begivenheder set i en mate-bevogtning forsøg på har ikke været godt beskrevet. Således, her vi indføre metoder for at aktivere undersøgelser af adfærd under en kontrolleret eksperimentel miljø.
Enkelte dyrkning og iscenesættelse af dyr
Tidligere undersøgelser af reproduktion af Tigriopus ansat konventionelt et par afmontering metode for at forberede adfærdsmæssige test yngel (copepodids) og voksne hunner og avl forsøg3,8,9 ,10. Men denne metode tillader dyr form par og potentielt parre før test (drøftet i Ito 198811), som kan ændre adfærdsmæssige egenskaber af dyr5. Derudover er der også et potentiale for at fejlbedømme udviklingsstadier af vandlopper med de konventionelle protokoller, som de er afhængige af tilsyneladende kropsstørrelse for iscenesættelse. I dette papir beskriver vi en individuel dyrkningsbaserede metoden i vores seneste undersøgelse med Tigriopus californicus5, som var designet til at løse disse begrænsninger ved at kontrollere parring oplevelse af dyr og spore deres udvikling fra copepodid til voksen faser.
Kvantitativ analyse af mate-bevogtning adfærd
Mate-bevogtede opførslen af Tigriopus arter er blevet undersøgt, ikke kun inden for etologi2,6 , men også på andre områder som økotoksikologi og evolutionær genetik3,4, 7 , 8 , 9 , 10. men de tidligere undersøgelser har forklaret løbet af problemet primært i skrevet form uden tilstrækkelig visuel illustrationer at skitsere både adfærd og metoder til at studere det, der skaber tekniske hindringer for den replikering og avancement undersøgelser. Her, leverer vi detaljerede beskrivelser af nogle af de vigtigste begivenheder i de mate-bevogtning opførsel af Tigriopus copepoder understøttet af visuelle materialer. Vi viser også udstyr og metoder til kvantitativ analyse af adfærd. Disse metoder giver mulighed for vurdering af adfærdsmæssige egenskaber af dyr under bevogtning af mate forsøg i netop replikerede eksperimenter.
Med disse metoder tilstræber vi at give en metodologisk grundlag af kontrollerede og reproducerbare studies på mate-bevogtede opførslen af slægten Tigriopus.
Protocol
1. forberedelse af Jomfru dyr for adfærdsmæssige Observation
- Få befrugtede æg og tillade dem at klække.
- Indsamle fælderne kvinder bærer klare orange (dvs. befrugtede og i fremskredne stadier af udvikling) æg (figur 3 c) fra en stamkultur med Pasteur pipette. Skyl hunnerne af forsigtigt pipettering dem i ren næringssubstratet at undgå overførsel af andre dyr, herunder nauplial larver, der muligvis er klækket i kulturen.
Bemærk: I denne protokol, kunstigt havvand med en salinitet på 35% anvendes som næringssubstrat. Bruge andet medium (f.eks. kunstigt havvand med en højere saltholdighed eller en ekstra opløst stof) afhængigt af formålet med et eksperiment.
Bemærk: Se Barreto et al. 201512 for en metode til oprettelse af laboratoriet kultur bestande og Pereira et al. 201613 for eksempler på samling websteder af naturlige populationer af T. californicus. Peterson et al. rapporterede også deres samling websteder af T. californicus, T. fulvusog T. japonicus med bredde- og længdegrader information9. Bruge plast pipetter med en kapacitet på ca. 30-50 mL til at indsamle Tigriopus copepoder fra rock pools. - Placer hver kvinde individuelt i et godt af en 6-godt celle kultur plade med ren næringssubstratet (figur 4, venstre). Sørg for, at ingen andre dyr (herunder nauplial larve) forurener godt.
- Vedligeholde plader i en inkubator, indstillet på 20 ° C med en 12-timers lys-mørke cyklus til kultur hunnerne, indtil de frigive æg sække. Dette trin tager normalt én til ti dage afhængigt af arter og udviklingsstadier af embryoner. I mellemtiden, foder hver fælderne kvinde to gange om ugen med to kerner af fint jorden (ca < 0.5 mm i diameter) fisk mad (Se Tabel af materialer for detaljer).
Bemærk: Brug forskellige temperaturer og lys cyklusser afhængigt af formålet med et eksperiment. Højere temperaturer kan lette hurtigere udvikling af embryoner.
Bemærk: Undgå at efterlade overskydende mad rådnende i brønde. Hvis madrester begynder at forfalde, afpipetteres det ud af brøndene med Pasteur pipette. - Efter æg sække er udgivet, skal du fjerne hunnerne fra kultur brønde med Pasteur pipette.
Bemærk: Insemineret hunnerne er i stand til at gyde flere kløerne på afkom2,3. Hvis det er nødvendigt, skal du overføre hunnerne til andre brønde til at indsamle yderligere koblinger.
- Indsamle fælderne kvinder bærer klare orange (dvs. befrugtede og i fremskredne stadier af udvikling) æg (figur 3 c) fra en stamkultur med Pasteur pipette. Skyl hunnerne af forsigtigt pipettering dem i ren næringssubstratet at undgå overførsel af andre dyr, herunder nauplial larver, der muligvis er klækket i kulturen.
- Indsamle copepodids for individuelle kultur.
- Holde pladerne med skraveret nauplii i rugemaskine og kultur i nauplii, før de udvikler sig til den første copepodid (CI) fase (figur 4, midten). Dette trin tager normalt fra en til to uger. Feed hver godt med flere kerner af den fint formalet fisk mad mens du søger CI dyr en gang hver to dage. Refill fordampet opdræt vand med destilleret vand.
Bemærk: Hvis flydende vragrester hindrer visningen, skimme det med et lille stykke køkkenrulle. - Så snart CI dyr begynder at dukke op, samle dem fra brønde med en mikropipette P-10 med sin pipettering volumen på ca 8 µL, under et stereomikroskop på 10 X-40 X forstørrelse (figur 4, højre). Vask hver CI dyr af forsigtigt pipettering det i ren kunstigt havvand og placere det i et godt af 24-godt celle kultur plade der indeholder 2-3 mm dybde (ca 400-600 µL) i kunstigt havvand.
Bemærk: Undgå at bære over nauplial exuviae eller andre dyr i brøndene for individuelle kultur.
- Holde pladerne med skraveret nauplii i rugemaskine og kultur i nauplii, før de udvikler sig til den første copepodid (CI) fase (figur 4, midten). Dette trin tager normalt fra en til to uger. Feed hver godt med flere kerner af den fint formalet fisk mad mens du søger CI dyr en gang hver to dage. Refill fordampet opdræt vand med destilleret vand.
- Track udviklingen af enkeltpersoner ved at tælle molted exuviae.
- Undersøge inde i hver brønd for molted exuviae hver to til tre dage (justere frekvensen, hvis det er nødvendigt), af stereomicroscopic observation under en mørk-felt belysning på 10 X-40 X forstørrelse. Exuviae af copepodids er gennemsigtige og genkendelige med strittede ben, et par af caudale rami (dvs., tynde fremspringende strukturer for caudale enden), og/eller segmentering af prosome og urosome (figur 5). Ændre fokus og belysning til at opdage exuviae på forskellige dybder i en brønd (figur 6A).
Bemærk: Molted exuviae er mindre end de dyr, der har molted dem. Start eksamen fra lavere forstørrelse til et dyr og dets relativt nylige exuviae og Skift til højere forstørrelse for ældre (dvs. mindre) exuviae.
Bemærk: Hvis exuviae i en brønd er beskadiget, fjerne godt fra yderligere udviklingsmæssige sporing at undgå fejlvurdering af udviklingsstadier.
Bemærk: Hvis flydende vragrester hindrer visningen (fig. 6B), skimme det med et lille stykke køkkenrulle. - Optage et samlet antal på copepodid exuviae i hver brønd med en tally mark på plade låg (figur 7). Tilføje en linje til mærket, som en ny exuviae er fundet i brønden.
Bemærk: Hvis der er nauplial exuviae forurenet i brønden, fjerne dem fra optællingen. - Feed hver enkelt med to kerner af den fint formalet fiskefoder. Refill fordampet opdræt vand med destilleret vand til at opretholde saltholdigheden.
Bemærk: Feed copepodids hver to til tre dage for at forhindre dem fra forbrugende og skadelige molted exuviae, som potentielt ville kunne påvirke forkalkulationen af udviklingsstadiet (trin 1.3.4). - Anslå udviklingsstadiet dyrets baseret på antallet af exuviae. Hvis der er ingen exuviae, er enkelt anslået til at være på CI Stadium. Hvis der er en til fire exuviae, er enkelt anslået til at være på CII CV faser. Hvis der er fem exuviae, er enkelt anslået til at være en voksen.
- Undersøge inde i hver brønd for molted exuviae hver to til tre dage (justere frekvensen, hvis det er nødvendigt), af stereomicroscopic observation under en mørk-felt belysning på 10 X-40 X forstørrelse. Exuviae af copepodids er gennemsigtige og genkendelige med strittede ben, et par af caudale rami (dvs., tynde fremspringende strukturer for caudale enden), og/eller segmentering af prosome og urosome (figur 5). Ændre fokus og belysning til at opdage exuviae på forskellige dybder i en brønd (figur 6A).
- Identificere sex af voksne baseret på morfologi.
- Sex dyr ved at undersøge deres morfologi. Voksne Tigriopus hanner besidder geniculate første antenner med krogede og kugleformede strukturer i den distale ende (figur 3A). Voksne hunner besidder glattere og relativt tyndere første antenner (figur 3B) end mænd. Nogle hunner også udviser mørkegrøn farve fra gonadale lipid i deres organer (figur 3B, 3D).
- Mærke sex på låget af brønden (figur 7B).
2. adfærdsmæssige Test og Video optagelse af Mate-bevogtning adfærd
- En test dag, Vælg dyr af ønskede fase og sex for en adfærdsmæssige test.
- Foder de udvalgte personer i kultur brønde med fint jorden fiskefoder og tillade dem at spise det i 30 minutter. I mellemtiden, Fortsæt til trin 2.1.2 for at forberede test kamre.
- Forbered to 48-godt flad bund celle kultur plader som test kamre; en plade (herefter kaldet "plade A") er for mænd og andre ("pladen B") for mål (f.eks. copepodids, voksne hunner, voksne hanner). Tilføj 400 µL af ren kunstigt havvand med en salinitet på 35% i wells af pladerne. Læg pladerne på en LED lys pad dækket med en gennemsigtig akryl bestyrelsen som en lysspreder (figur 8).
Bemærk: Brug forskellige medium afhængigt af et formål i et eksperiment.
Bemærk: For at undgå overskydende varme, brug ikke glødelampe eller fluorescerende lamper som en baggrundsbelysning. - Efter 30-min opfodring gang beskrevet i punkt 2.1.1, skyl hvert dyr når det forsigtigt der afpipetteres i en række af fire brønde af en 24-godt tallerken fyldt med ren kunstigt havvand (figur 9) for at forhindre fremførsel af snavs og exuviae fra kultur brønde.
- Placer skylles enkeltpersoner i wells af plader A og B på LED lys pad. Tillad 30 minutter for justering af dyr brønde.
- Sæt en video kamera over pladen A berigtigelsesperioden (figur 8). Brug et stativ eller en stander til at holde kameraet.
- Fokusere kameraet på mænd i plade A for at tillade en observation af antenner.
Bemærk: For at reducere flimmer for baggrundslys i film, angive en billedhastighed, der er lig med eller halvdelen af en elektrisk frekvens og bruge en længere eksponeringstid. Også, holde den LED lys pad dækket med en gennemsigtig akryl bestyrelsen, som beskrevet i trin 2.1.2.
- Efter reguleringsperioden beskrevet taktfast 2.1.4, starte videooptagelse og den adfærdsmæssige test.
- Overføre målene fra plade B til plade A med Pasteur pipette. Hvis eksperimentet er følsomme over for kemiske komponenter i medium, ændre pipetter for hver test par.
Bemærk: Når pipettering et dyr fra plade B, ikke jage den i vandet med Pasteur pipette som vand forstyrrelse kan stimulere dyret og fremkalde dens overskydende bevægelse. Hold en spidsen af pipetten lidt over vandoverfladen og vente på enkelt til at komme under spidsen. Forsigtigt afpipetteres det op med en lille mængde af kunstigt havvand og derefter skubbe det ind i en brønd på plade A. - Efter en eksperimentel planen, Tillad en mand og et mål at interagere i hver brønd i en ønskede observation tid (fx 10 minutter) efter overdragelsen.
- Stop video optagelse efter observationsperiodens. Hvis det er nødvendigt, dataoverføre de optagede film fra kameraet til en computer.
- Overføre målene fra plade B til plade A med Pasteur pipette. Hvis eksperimentet er følsomme over for kemiske komponenter i medium, ændre pipetter for hver test par.
3. manuel analyse af adfærdsmæssige egenskaber
- Undersøge film for timing, når hvert mål blev overført i brønden på plade A.
- Undersøge indledning og afslutning timingen af begivenheder af interesse og beregne varighed, ventetid og hyppigheden af begivenhederne.
- Definere indledning af bevogtning forsøg fra en mand som en kontakt i den mandlige antenne med ethvert organ del af målet (figur 10, øverst til venstre). Den antennal kontakt er ofte indledes med en swift (< 0,5 s) jage eller kaste.
- Definere opsigelse af bevogtning forsøg på som et punkt, når begge antenner af mandlige løsne sig fra liget af et mål (figur 10, øverst til højre). Beregne hyppigheden af bevogtning forsøg som:
- Definere indledning af samleje ved en dorsal kroppen bøje af en mand, der er efterfulgt af en gentagne Tryk på en urosome mod at kvindelige (figur 10nederst til højre). Hyppigheden af tryk og er flere gange i sekundet.
Bemærk: En bevogtning mandlig kravler ned til caudale slutningen af en kvindelig krop før samleje (figur 10, nederst til venstre). - Definere opsigelse af samleje ved detachment af urosomes efter begivenhederne beskrevet i 3.2.4.
Bemærk: Samleje generelt finder sted i flere minutter i tilfælde af T. californicus og T. japonicus.
4. to-dimensionelle sporing af enkeltpersoner og par
- Generere en video klippe ud ligner en episode af interesse (f.eks. de første 3 s en bevogtning forsøg) ved at trimme film optaget i trin 2 med film redigeringssoftware.
- Installere ImageJ14 fra: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Derefter downloade MTrackJ, en bevægelse-tracking plugin for ImageJ15, ved efter vejledningen på: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- Åbne ImageJ og importere en film af interesse (f.eks. fil > Importer > ved hjælp af QuickTime; vælge "Konverter 8-bit gråtoneskala" at reducere hukommelse, som kræves til billedbehandling).
- Udføre rumlige og tid kalibrering.
- Vælg værktøjet lige linje udvalg i vinduet ImageJ for rumlig kalibrering.
- Trække en markering linje langs et objekt med en kendt længde (f.eks. diameteren af en brønd) i vinduet film.
- Åbn menuen "Sat skala" (analyser > angive skala). Angiv den kendte længde i feltet "Kendt afstand" og dets enhed (fx mm) i boksen "Enhed af længde". Klik på "Global" afkrydsningsfeltet for at bruge skalaen for andre videoklip.
- Åbn menuen "Egenskaber" (billede > egenskaber) for tiden kalibrering. Angiv frame interval (reciprokke framerate) i boksen "Frame interval".
- Konfigurere sporing med MTrackJ.
- Åbne MTrackJ plugin fra Plugins > MtrackJ på ImageJ. Klik på knappen "Tracking" i vinduet MTrackJ dialogboks til at åbne en tracking konfigurationsmenuen.
- Angive en tracking interval ved at kontrollere "Flyt til næste gang indekset efter at tilføje punkt" og indtaste et tal i "Tid trin nummer" boks i konfiguration dialog rude. For at udføre frame-by-frame tracking, indtaste "1" i størrelsesboksen "Tid trin".
- Kontrollere "Anvend lokale cursoren snapper under tracking" og vælge "Mørke barycentrum" som en snap funktion. Denne indstilling giver mulighed for en automatisk detektion af barycentrum for en mørk objekt (dvs. en person eller en par) inden for en registrering af firkantede ("snap range") omkring en markør. Vælg en størrelse på pladsen til at dække en hel par eller dyr i filmen (fx 31 x 31 pixels).
- Klik på "OK" for at anvende de valgte indstillinger.
- Udføre to-dimensionelle tracking.
- Klik på knappen "Tilføj" i MTrackJ dialog rude at starte sporing.
- Placer markøren (påvisning square) for at dække et par eller et individ kan spores. Klik for at opdage den mørke barycentrum for objektet inden for pladsen.
- Gentag trin 4.6.2 for en ønsket antal rammer.
- For at generere datatabeller, skal du klikke på "Foranstaltning" knap i MTrackJ dialog rude. Dataene vises i to vinduer: "MTrackJ: Tracks" vinduet viser en oversigt over registrerede todimensionale bane og "MTrackJ: point" viser detaljerede data for hvert tidspunkt. For at gemme hver enkelt tabel, skal du vælge fil > Gem som... menu på ImageJ.
Bemærk: Se i brugervejledningen til den online af udvikleren (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) for beskrivelser af hver enkelt datakolonne. - Klik på "Film" for at generere en film med en sporet bane tegnet som en farvet linje, i MTrackJ dialog rude. For at gemme den genererede film, skal du vælge fil > Gem som... menu på ImageJ.
- Gemme hele resultatet. Klik på knappen "Gem" i MTrackJ dialog rude at gemme resultater herunder data (trin 4.6.4) og den registrerede to-dimensionelle bane (trin 4.6.2 og 4.6.3).
Representative Results
Den enkelte dyrkningsbaserede metode beskrevet i trin 1 tillader forberedelse og iscenesættelse af Jomfru dyr med ingen forudgående erfaring med parring.
Den adfærdsmæssige test beskrevet i trin 2 giver mulighed for videooptagelse og observation af mate-bevogtede opførslen af Tigriopus copepoder. Den følgende gennemgang af videooptagelser med metoderne beskrevet i trin 3 og 4 giver mulighed for kvantitativ analyse af flere aspekter af den adfærd, der er vist i figur 1.
Figur 11 viser en forskel i gennemsnitlig varighed af bevogtning forsøg mellem mandlige-kvindelige par og mandlige-mandlige par af T. californicus. En manual analyse viste, at mandlige-mandlige par viste relativt kortere varighed i parring end mandlige-kvindelige par.
Eksempler på baner sporet med den analysemetode, der er præsenteret i figur 12 og et repræsentativt resultat af velocity analyse er vist i Figur 13. To-dimensionelle rumlige sporing af nydannede bevogtning par af T. californicus afslørede, at mandlige-mandlige par tendens til at vise højere hastighed end mandlige-kvindelige par i de første 3 s af bevogtning forsøg.
Figur 1: Mate-bevogtning adfærd i Tigriopus. (A) en voksen mand knugede en juvenil (copepodid) med de første antenner (angivet med blå pile). Bar = 1 mm. (B) en skitse af mate-bevogtning adfærd. En mand forsøger at fange mål individ (venstre) og danner et par med det (midten). Mandlige-mandlige par og nogle mandlige-kvindelige par afslutter en bevogtning forsøg uden samleje. Dette tal er blevet ændret fra Tsuboko-Ishii og Burton 20175. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udviklingsstadier af Tigriopus. Tigriopus arter gennemgår generelt seks nauplius faser (fra NI til NVI), fem copepodid faser (fra CI til CV), og en voksen fase (CVI)16. Mænd gør bevogtning forsøg til yngel fra et tidligt stadium af copepodids (CI i T. japonicus og T. fulvus6,17 ) og CII i T. californicus3samt til voksne af begge køn5 . Dette tal er blevet ændret fra Tsuboko-Ishii og Burton 20175. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Morfologi af voksne (T. californicus). (A) voksen mand. (B) voksen kvinde. (C) fælderne voksen kvinde med en ægget sac med befrugtede og udviklede (klare orange) æg. (D) fælderne voksen kvinde med en ægget sac med ubefrugtede eller ubebyggede (mørk grøn) æg. Pilene angiver æg sække. Bar = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skitse af forberedelse til individuelle kultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Molted exuviae. (A) Exuviae fra CI CV faser af et enkelt dyr af T. californicus. Bar = 1 mm. (B) Exuviae fra CI til CV faser i en individuel kultur godt. Hvid vragrester er ekskrementer dyrets kulturperler i brønden (ikke vist på billedet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Søg efter exuviae under et stereomikroskop. Barer = 1 mm. (A) Focal ændring af et stereomikroskop til påvisning af exuviae på forskellige dybder. Magenta pilene angiver fokuseret exuviae og grå pile angiver ufokuserede exuviae. Top billede fokuserer på den venstre exuviae, som er sunket i bunden af brønden. Nederste billede fokuserer på den rigtige exuviae, der flydende under det medium overflade. (B) øverste billede viser et eksempel på obstruktion af undersøgelse af vragdele flydende på det medium overflade. En grøn pil angiver en exuviae skjult under efterladenskaberne. Nederste billede viser et resultat af overfladen rengøring med et lille stykke køkkenrulle. En exuviae (angivet med en grøn pil) er synlig efter rengøring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: iscenesættelse og kønsbestemmelse dyr. Eksempler på, hvordan at markere antallet af exuviae og sex med dyr på et låg af en kultur plade. (A) et eksempel for en brønd, der indeholder fem exuviae og et voksent dyr. Antallet af linjer i tally mark på låget repræsenterer antallet af exuviae fundet i brønden. Når antallet af exuviae når fem, sex af dyret kan bestemmes baseret på antenner morfologi (Se også figur 3). (B) et eksempel på en markant låget af en kultur plade. Øverste rækker indeholder ældre (CIV til voksen) dyr og nederste rækker indeholder yngre (dvs., nyligt indsamlede) dyr (CI til CIII). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: adfærdsmæssige testprogram. Opsætning af videooptagelse af mate-bevogtning adfærd (til venstre) og en skitse af adfærdsmæssige test (til højre). Dette tal er blevet ændret fra Tsuboko-Ishii og Burton 20175. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Skyl af dyr forud for en adfærdsmæssige test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Definition af begivenheder undersøgt i den manual analyse. Illustrationer af begivenheder observeret i forbindelse med bevogtning af mate forsøg. Navnene på hændelserne defineret og analyseret i trin 3 er fremhævet. Hændelser, som omsluttes af en stiplet linje kan ikke observeres i nogle mate-bevogtning forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Forskel i bevogtning varighed mellem mandlige-kvindelige par og mandlige-mandlige par af T. californicus. Hver trekant symbol repræsenterer data fra én testet par. Barer og whiskers repræsenterer henholdsvis medianerne og interkvartil udvalg. Gennemsnitlig varighed af capture var større for mandlige-kvindelige par (mand-kvinde (n = 22), mand-mand (n = 29); **p < 0,01 af Mann-Whitney U test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: baner af par i de første tre sekunder af bevogtning forsøg. Eksempler på sporet to-dimensionelle baner af mandlige-kvindelige par (venstre) og mandlige-mandlige par (til højre) af T. californicus. Prikker på baner repræsenterer tidspunkter (30 billeder pr. sekund). Barer = 10 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: Forskel i gennemsnitlig hastighed efter indledningen af bevogtning mellem mandlige-kvindelige par og mandlige-mandlige par af T. californicus. Hver trekant symbol repræsenterer data fra én testet par. Barer og whiskers repræsenterer henholdsvis medianerne og interkvartil udvalg. Gennemsnitlig hastighed af par i de første 3 s af bevogtning forsøg var større for mandlige-mandlige par (mand-kvinde (n = 13), mand-mand (n = 35). ***p < 0,001 af Mann-Whitney U test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Effekt af skylning behandling på opførsel af Tigriopus. Hver cirkel eller en trekant symbol repræsenterer data fra en afprøvet enkelte eller parret. Barer og whiskers repræsenterer henholdsvis medianerne og interkvartil udvalg. Personer i "skylles" og "ikke skylles" grupper blev håndteret på samme måde, bortset fra at de "ikke skylles" gruppen ikke oplevede føres behandling (trin 2.1.3) før den 30-minut justering (trin 2.1.4). (A) gennemsnitlige hastighed skylles hanner tendens til at være større end den, der ikke skylles hanner (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6), n.s.: ingen signifikant forskel blev opdaget af Mann-Whitney U test). Hastigheden blev målt til 30 s baseret på videoer optaget efter justering tid. (B) gennemsnitlige hastighed af skylles hunner tendens til at være større end ikke skylles hunnens (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6), n.s.: ingen signifikant forskel blev opdaget af Mann-Whitney U test). Hastigheden blev målt til 30 s baseret på videoer optaget efter justering tid, følgende trin 4 (sporing interval = 0,5 s). (C) hyppigheden af bevogtning forsøg var større for par af skylles enkeltpersoner (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6). ** p < 0,01 af Mann-Whitney U test). (D) varigheden af bevogtning forsøg på en tendens til at være større for par af skylles enkeltpersoner (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6), n.s.: ingen signifikant forskel blev opdaget af Mann-Whitney U test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Enkelte dyrkning og bestemmelse af scenen og sex
Her beskrev vi den metode, der anvendes i vores tidligere undersøgelse5 for at forberede jomfru Tigriopus dyr med deres parring erfaring kontrolleret mens tracking deres udvikling (figur 4 og figur 7). Som Tigriopus arter udnyttes som model dyr i forskellige biologiske områder som toksikologi16,18, økologiske fysiologi19,20,21, og evolutionære Genetik13,22,23,24, denne metode har et potentiale til at give et værdifuldt middel til at vurdere indflydelse af miljømæssige og genetiske faktorer på disse vandlopper livscyklus.
For at opnå succesfulde iscenesættelse, almindelig søgning og indsamling af CI er copepodids fra en masse kultur (trin 1.2) kritisk, da samlingen på senere stadier kan resultere i mis iscenesættelse af dyrene. Derudover er en grundig søgning efter exuviae (trin 1.3) også afgørende for præcise iscenesættelse. Øge hyppigheden af indsamling og iscenesættelse hvis nødvendigt, så intervallet mellem molts varierer fra én til flere dage afhængigt af arter og opdræt betingelse2,25,26. Forskelle i antenner morfologi mellem copepodids og voksne hunner er ikke synligt betydelig i nogle arter og bestande af Tigriopus16,25. Iscenesættelse før kønsbestemmelse er derfor nyttigt at skelne mellem voksne hunner fra avancerede copepodids af begge køn.
Adfærdsmæssige test og manuel analyse af adfærdsmæssige egenskaber
Generelt er en af de mest kritiske dele af etologiske undersøgelser definition og beskrivelse af begivenheder af interesse. De metoder, der er indført i dette papir blev først udviklet til vores seneste undersøgelse5 og suppleres med beskrivelsen af samleje og visuelle hjælpemidler (figur 10). Desuden, at spiller konsekvensen animalsk håndtering også en vigtig rolle i adfærdsmæssige eksperimenter. For eksempel, skylning af vandlopper kan potentielt lette nogle aspekter af deres adfærd (supplerende figur 1) og er derfor ønskeligt at udføres konsekvent blandt prøver, såsom standardiseret taktfast 2.1.3. Vi forventer af materialer leveres i dette papir vil hjælpe kontrolleret og reproducerbare studies på funktionen mate-bevogtning af Tigriopus, fremme af reproduktiv og økologiske studier af denne rigelige indbygger højvande pools.
En mulig begrænsning med denne metode er lav forstørrelse af opnåede billeder. Selvom film optaget med vores system tillader identifikation af fremtrædende organ strukturer, herunder urosomes og mandlige første antenner, kan man ikke kunne observere mere subtile strukturer såsom ben og kønsorganer med vores metode, da det ikke anvender mikroskopiske forstørrelse til videooptagelse. Mens Kelly et al. rapporterede, at de var i stand til at overholde spermatophore overførsel fra hanner til hunner af T. japonicus under en mikroskopisk observation på 100 X forstørrelse (ingen video registreret)7, har vi ikke været i stand til at overholde en spermatophore i vores film, måske på grund af begrænsningen af billedopløsningen.
To-dimensionelle sporing af par
Selvom denne metode ikke tillader tre-dimensionelle sporing af dyr, det giver mulighed for to-dimensionelle bane analyse af zooplankton uden kemisk mærkning dyr (cf. Svinefedt et al. 201027) ved at udnytte programmer distribueres gratis. Hvis størrelsen af en film-fil er for stor til at blive behandlet i ImageJ, kan reducere opløsningen af fil og konvertere den til en grå skala film. Mens metoden beskrevet blev oprindeligt udviklet for voksne par af T. californicus (figur 12 og Figur 13), er det også tilgængelig for voksen-unge par og enkelte individer (supplerende figur 1) som samt andre Tigriopus arter i princippet. Vi forventer yderligere metode skal anvendes til at kortsigtede (fra millisekund til de anden tidsskalaer) bane analyse af zooplankton af andre taxa med passende justeringer.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af tilskud fra Sumitomo Foundation, Japan (Grant for grundlæggende videnskab forskningsprojekter, giver nummer: 150932) og Research Institute af Marine invertebrater, Japan (2018 individuelle forskning tilskud) til STI og RSB samt et tilskud fra USA National Science Foundation (DEB-1556466) til RSB. Vi takker Ms. Kiana Michelle Woodward for feedback på metoden dyrkningsbaserede og iscenesættelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
