Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Enskilda odling av Tigriopus hoppkräftor och kvantitativ analys av deras Mate-bevakning beteende

doi: 10.3791/58378 Published: September 26, 2018

Summary

Mate-bevakning beteende spelar en viktig roll i reproduktionen av tidvattenzonen hoppkräftor av släktet Tigriopus. Metoder för att studera detta beteende har dock inte varit väl beskrivna. Här beskriver vi metoder för: 1) enskilda kultur oskuld Tigriopus djur, och 2) kvantitativ analys av deras mate-bevakning beteende.

Abstract

Hoppkräftor av släktet Tigriopus, som är gemensamma djurplankton i steniga tide pooler, visar precopulatory mate-bevakning beteende där en manlig knäppen en potentiell kompis att bilda ett par. Medan detta fenomen har rönt intresse av forskare, har metoder för sin analys inte väl beskrivna. Här beskriver vi förfaranden för: 1) enskilda odling och iscensättning av Tigriopus ungdomar och vuxna, och 2) video-baserad analys av deras mate-bevakning beteende. Metoden culturing gör experimentell kontroll av fanersvarvning erfarenhet av djur samt möjlighet att spåra deras utveckling innan beteendemässiga tester. Analysmetoden som tillåter kvantitativ utvärdering av flera aspekter av mate-bevakning beteende, inklusive fånga försök av hanar och simning banan för mate-bevakning par. Även om dessa metoder var ursprungligen etablerade för etologiska studier på Tigriopus, med lämpliga ändringar de kan också tillämpas på studier av andra djurplankton i olika forskningsområden, såsom fysiologi, toxikologi, och ekologiska genetik.

Introduction

Tidvattenzonen hoppkräftor av släktet Tigriopus är spridda i steniga hög tidvattenzonen pooler över flera kontinenter1. Dessa hoppkräftor uppvisar mate-bevakning beteende som en del av deras reproduktion, där en vuxen man fångar en potentiell kompis (juvenil eller vuxen) utnyttja dess hakas första antenner innan parning (figur 1 och figur 2)2 ,3,4,5. Även om detta fenomen har varit föremål för etologiska och biokemiska studier för årtionden2,3,6,7, detaljerade förfaranden för studier av detta beteende, inklusive enskilda kultur av virgin djur och kriterierna i behavioral händelserna i ett mate-bevakning försök, har inte väl beskrivna. Alltså fastställa här vi metoder för att aktivera studier av beteende under en kontrollerad experimentell miljö.

Enskilda odling och iscensättning av djur

Tidigare studier av reproduktion av Tigriopus sysselsatt konventionellt ett par avtagning metod för att förbereda ungdomar (copepodids) och vuxna honor för beteendemässiga tester och avel experiment3,8,9 ,10. Denna metod tillåter dock djur bildar par och potentiellt att kopulera före tester (diskuteras i Ito 198811), som kan förändra beteendemässiga egenskaper hos djur5. Dessutom finns det också en potential att missbedöma utvecklingsstadier av Hoppkräftor med de konventionella protokoll som de är beroende av uppenbara kroppsstorlek för mellanlagring. I detta papper beskriver vi en individuell culturing metod som används i vår senaste studie med Tigriopus californicus5, som var utformad för att hantera dessa begränsningar genom att styra hopkoppling erfarenhet av djur och spåra deras utveckling från copepodid till vuxna stadier.

Kvantitativ analys av mate-bevakning beteende

Mate-bevakning beteendet hos Tigriopus arter har undersökts inte bara inom etologi2,6 , men också inom andra områden såsom ekotoxikologi och Evolutionär genetik3,4, 7 , 8 , 9 , 10. men de tidigare studierna har förklarat loppet av problemet främst i skrivna former utan tillräcklig visuella illustrationer att beskriva både beteende och metoder för att studera det, vilket skapar tekniska hinder för den replikering och befordran av studierna. Här, tillhandahåller vi detaljerade beskrivningar av några av de viktigaste händelserna i mate-bevakning beteendet hos Tigriopus hoppkräftor stöds av visuellt material. Vi visar även utrustning och metoder för kvantitativ analys av beteendet. Dessa metoder kan utvärdering av beteendemässiga egenskaper av djur under mate-bevakning försök i just replikerade experiment.

Med dessa metoder vill vi ge en metodologisk grund av kontrollerade och reproducerbara undersökningar på beteendet mate-bevakning av släktet Tigriopus.

Protocol

1. beredning av Virgin djur för beteendemässiga Observation

  1. Få befruktade ägg och tillåta dem att kläckas.
    1. Samla in dräktiga honor bär tydlig orange (dvs befruktade och i avancerade stadier av utveckling) ägg (figur 3 c) från ett lager kultur med en Pasteur-pipett. Skölj honorna genom försiktigt pipettering dem i ren kultur medium att undvika överföring av andra djur, inklusive nauplial larver som kan ha kläckts i kulturen.
      Obs: I detta protokoll, konstgjorda havsvatten med en salthalt av 35% används som odlingssubstrat. Använda olika medium (t.ex. konstgjorda havsvatten med en högre salthalt eller en ytterligare solute) beroende på syftet med ett experiment.
      Obs: Se Barreto et al. 201512 för en metod för att upprätta laboratorium kultur lager och Pereira et al. 201613 exempel på återvinningsstationer i naturliga populationer av T. californicus. Peterson et al. rapporterade också deras samling platser T. californicus, T. fulvusoch T. japonicus med latitud och longitud information9. Använda plast pipetter med en kapacitet på ca 30-50 mL för att samla Tigriopus hoppkräftor från hällkar.
    2. Placera varje kvinna individuellt i en väl 6-väl cell kultur platta med ren odlingsmedium (figur 4, vänster). Kontrollera att inga andra djur (inklusive nauplial larv) kontaminerande brunnen.
    3. Upprätthålla plattorna i en inkubator inställd på 20 ° C med en 12-timmars ljus-mörker cykel till kultur honorna tills de släpper ägg säckar. Detta steg tar vanligtvis ett till tio dagar beroende på art och utvecklingsstadier av embryon. Under tiden mata varje gravid kvinna två gånger i veckan med två korn av fint marken (cirka < 0.5 mm i diameter) fiskmat (se Tabell av material för detaljer).
      Obs: Använd olika temperaturer och ljust cyklar beroende på syftet med ett experiment. Högre temperaturer kan underlätta snabbare utveckling av embryon.
      Obs: Undvik att lämna överskott mat förfalla i brunnar. Om matrester börjar förfalla, pipett det ur brunnar med en Pasteur-pipett.
    4. När ägg säckar släpps, ta bort honorna från kultur brunnarna med en Pasteur-pipett.
      Obs: Insemineras kvinnor klarar lekande flera kopplingar av avkomma2,3. Om det behövs, överföra honorna i andra brunnar att samla in ytterligare kopplingar.
  2. Samla copepodids för enskilda kultur.
    1. Hålla plattorna med skrafferad följande i inkubatorn och kultur följande tills de utvecklas till ett första copepodid (CI) Stadium (figur 4, mitten). Detta steg tar vanligtvis en till två veckor. Foder varje väl med flera korn av den finmalen fisk mat samtidigt söka efter CI djur en gång varannan dag. Fyll på avdunstat uppfödning vatten med destillerat vatten.
      Obs: Om flytande skräp hindrar vyn, skumma den med en liten bit hushållspapper.
    2. Så snart CI djur börjar växa fram, samla in dem från brunnarna med en P-10 mikropipett med dess pipettering volymuppsättning på ca 8 µL, under ett stereomikroskop på 10 X till 40 X förstoring (figur 4, höger). Tvätta varje CI djur genom att försiktigt pipettering det i ren konstgjorda havsvatten och placera den i en brunn av 24-väl cell kultur plattan som innehåller 2-3 mm djup (ca 400-600 µL) av konstgjorda havsvatten.
      Obs: Undvik att bära över nauplial avsked eller andra djur i brunnar för enskilda kultur.
  3. Spåra utvecklingen av individer genom att räkna molted avsked.
    1. Undersök insidan varje brunn för molted avsked var två till tre dagar (justera frekvens om det behövs) genom stereomicroscopic observation under en mörk-fältet belysning på 10 X till 40 X förstoring. Avsked av copepodids är transparenta och igenkännliga med pensel ben, ett par av stjärtfenan rami (dvs. tunn utskjutande strukturer i kaudala slutet), och/eller segmentering av prosome och urosome (figur 5). Ändra fokus och belysning att upptäcka avsked på olika djup i en brunn (figur 6A).
      Obs: Molted avsked är mindre än djuret som har molted dem. Börja undersökningen från lägre förstoring för ett djur och dess relativt nyligen avsked och Skift högre förstoring för äldre (dvs mindre) avsked.
      Obs: Om avsked i en brunn är skadade, eliminera brunnen från ytterligare utvecklingsmässiga spårning att undvika felbedömning av utvecklingsstadier.
      Obs: Om flytande skräp hindrar vyn (figur 6B), skumma den med en liten bit hushållspapper.
    2. Spela in ett totalt antal copepodid avsked i varje brunn med ett tally märke på plattan locket (figur 7). Lägga till en rad till märket då en ny avsked återfinns i brunnen.
      Obs: Om det finns nauplial avsked förorenade i brunnen, eliminera dem från greven.
    3. Foder varje individ med två korn av den finmalen fisk mat. Fyll på avdunstat uppfödning vatten med destillerat vatten för att upprätthålla salthalten.
      Obs: Mata copepodids var två till tre dagar för att hindra dem från att konsumera och skada molted avsked, vilket skulle kunna påverka uppskattning av utvecklingsstadier (steg 1.3.4).
    4. Uppskatta utvecklingsstadier av djur baserat på antalet avsked. Om det finns inget avsked, beräknas enskilt vara CI skede. Om det finns en till fyra avsked, beräknas enskilt vara på CII till CV stadier. Om det finns fem avsked, uppskattas individen vara vuxen.
  4. Identifiera sex vuxna baserat på Morfologi.
    1. Sex djur genom att undersöka deras morfologi. Vuxna Tigriopus män besitter geniculate första antenner med hooked och globulära strukturer på den distala änden (figur 3A). Vuxna kvinnor besitter smidigare och relativt tunnare första antenner (figur 3B) än hos män. Vissa honor uppvisar också mörkgrön färg från gonadala lipid i sina kroppar (figur 3B, 3D).
    2. Markera könet på locket till brunnen (figur 7B).

2. beteendemässiga Test och videoinspelning av Mate-bevakning beteende

  1. En test dag, Välj djur av önskad scen och sex för en beteendevetenskaplig test.
    1. Mata de valda individerna i kultur brunnar med fint marken fiskmat och tillåter dem att äta den i 30 minuter. Under tiden, gå vidare till steg 2.1.2 för att förbereda testning chambers.
    2. Förbered två 48-väl platt botten cell kultur plattor som testning kammare; en tallrik (nedan kallad ”plattan A”) är för män och andra (”plattan B”) för mål (t.ex. copepodids, vuxna kvinnor, vuxna män). Tillsätt 400 µL ren konstgjorda havsvatten med en salthalt på 35% i brunnar i plattorna. Lägg plattorna på en LED ljus pad täckt med en genomskinlig akryl ombord som en ljus diffusor (figur 8).
      Obs: Använd olika medium beroende på syftet ett experiment.
      Obs: Undvik överskottsvärme, Använd inte glödlampor eller lysrör lampor som en bakgrundsbelysning.
    3. Efter 30 minuters utfodring tid beskrivs i 2.1.1, skölj varje djur genom pipettering det försiktigt in i en följd av fyra brunnar i en 24-väl tallrik fylld med ren konstgjorda havsvatten (figur 9) för att förhindra överföring av skräp och avsked från kultur brunnar.
    4. Placera de sköljda individerna i brunnarna av plåtar A och B i LED ljus pad. Vänta 30 minuter justering av djuren till brunnarna.
    5. Ställa in en kamera ovanför plattan A under jämkningsperioden (figur 8). Använd ett stativ eller ett stativ för att hålla kameran.
    6. Fokusera kameran på hanarna inuti plattan A att tillåta en observation av antenner.
      Obs: För att minska flimmer av bakgrundsbelysningen i filmer, ställa en bildfrekvens som är lika med eller hälften av en elektrisk frekvens och använda en längre exponeringstid. Också, hålla den LED ljus pad täckt med en genomskinlig akryl ombord som beskrivs i steg 2.1.2.
  2. Efter den anpassningsperiod som beskrivs i steg 2.1.4, starta videoinspelning och beteendemässiga testet.
    1. Överföra målen från plattan B till plattan A med en Pasteur-pipett. Om experimentet är känslig för kemiska komponenter i medium, ändra pipetter för varje test par.
      Obs: När pipettering ett djur från plattan B, inte jaga det i vattnet med en Pasteur-pipett vatten störning kan stimulera djuret och framkalla dess överskott rörelse. Håll en toppen av pipetten något ovanför vattenytan och vänta för den enskilde att komma under spetsen. Försiktigt Pipettera det upp med en liten mängd konstgjorda havsvatten och sedan mata ut det i en brunn på tallrik A.
    2. Enligt en experimentell plan, tillåta en hane och ett mål att interagera i varje brunn för en önskad tidsperiod observation (t.ex. 10 minuter) efter överföringen.
    3. Stoppa videoinspelning efter observation. Om det behövs, Ladda ner inspelade filmer från kameran till en dator.

3. manuell analys av beteendemässiga egenskaper

  1. Granska filmen för tidpunkten när varje mål överfördes i brunnen på tallrik A.
  2. Undersöka inledande och avslutande tidpunkten för evenemang av intresse och beräkna varaktighet, latens och frekvensen av händelser.
    1. Definiera inledandet av bevakning försök av en hane som en kontakt av hanens antenn med någon kroppsdel av målet (figur 10, överst till vänster). Antennal kontakten föregås ofta av en swift (< 0,5 s) jaga eller pounce.
    2. Definiera uppsägning av bevakning försök som en punkt när båda antennerna manliga loss från kroppen av ett mål (figur 10, överst till höger). Beräkna frekvensen av vaktar försök som:
      Equation
    3. Definiera inledandet av parning av en dorsala organ krökning av en hane som följs av en upprepad tryckning på en urosome mot det av kvinnligt (figur 10, längst ned till höger). Frekvensen av push är flera gånger per sekund.
      Obs: En bevakning man kryper ner till stjärtfenan slutet av en honans kropp före parning (figur 10, nederst till vänster).
    4. Definiera uppsägning av parning av avlossning av urosomes efter de händelser som beskrivs i 3.2.4.
      Obs: Parning allmänt äger rum i flera minuter i fall av T. californicus och T. japonicus.

4. tvådimensionella spårning av individer och par

  1. Generera ett videoklipp med en episod av intresse (t.ex. de första 3 s av en bevakning försök) genom att beskära den film som spelats in i steg 2 med filmen redigeringsprogram.
  2. Installera ImageJ14 från: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Sedan hämta MTrackJ, en rörelsespårning plugin för ImageJ15, genom följande instruktioner på: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
  3. Öppna ImageJ och importera en film av intresse (t.ex. fil > Importera > använda QuickTime; välja ”konvertera 8-bitars gråskala” att minska minne som krävs för bildbehandling).
  4. Rumsliga och tiden kalibrering.
    1. Välj verktyget raka linjeval i fönstret ImageJ för rumsliga kalibrering.
    2. Dra ett urval linje längs ett objekt med en känd längd (e.g. diameter på en brunn) i fönstret film.
    3. Öppna menyn ”ange skala” (Analyze > Ange skala). Ange den känd längden i rutan ”känt avstånd” och dess enhet (t.ex. mm) i rutan ”enhet av längden”. Klicka på ”Global” kryssrutan för att använda skalan för andra videoklipp.
    4. Öppna menyn ”egenskaper” (bild > Egenskaper) för tiden kalibrering. Ange ram intervall (motsvarigheten av bildrutehastigheten) i rutan ”ram intervall”.
  5. Konfigurera spårning med MTrackJ.
    1. Öppna MTrackJ plugin från Plugins > MtrackJ på ImageJ. Klicka på knappen ”Spåra” i dialogfönstret MTrackJ att öppna en spårning konfigurationsmenyn.
    2. Ange en spårning intervall genom att kontrollera ”flytta till nästa tid index efter att lägga till punkt” och ange ett antal i rutan ”tid stegstorlek” i dialogrutan konfiguration. För att utföra bildruta-för-bildruta spårning, ange ”1” i rutan ”tid stegstorlek”.
    3. Kontrollera ”tillämpa lokala markören knäppa under spårning” och välja ”mörka centroiden” som en snapin-funktion. Detta alternativ tillåter en automatisk identifiering av centroiden för ett mörkt objekt (dvs. en person eller ett par) inom en upptäckt kvadrat (”fästområdet”) runt en markör. Välj en storlek på torget för att täcka en hela par eller djur i filmen (t.ex. 31 x 31 pixlar).
    4. Klicka på ”OK” för att tillämpa de valda alternativen.
  6. Utföra tvådimensionell spårning.
    1. Klicka på knappen ”Lägg till” i dialogfönstret MTrackJ spårning.
    2. Placera en markör (upptäckt square) för att täcka ett par eller en individ att spåras. Klicka för att upptäcka den mörka centroiden för objektet inom torget.
    3. Upprepa steg 4.6.2 för ett önskat antal bildrutor.
    4. För att generera datatabeller, klicka ”åtgärd” i dialogrutan MTrackJ. Data visas i två fönster: ”MTrackJ: Tracks” fönster visar en sammanfattning av spårade tvådimensionell banan och ”MTrackJ: punkter” visar detaljerade data för varje tidpunkt. Om du vill spara varje tabell, Välj Arkiv > Spara som... meny på ImageJ.
      Obs: Se Onlinehandbok som tillhandahålls av utvecklaren (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) för beskrivningar av varje kolumn i data.
    5. Generera en film med en spårad bana ritad som en färgad linje, klickar du på knappen ”filmen” i dialogrutan MTrackJ. Spara den genererade filmen, välja Arkiv > Spara som... meny på ImageJ.
  7. Spara hela resultatet. Klicka på knappen ”Spara” i fönstret MTrackJ dialogrutan Spara resultaten, inklusive data (steg 4.6.4) och spårade tvådimensionell banan (steg 4.6.2 och 4.6.3).

Representative Results

Den enskilda culturing metod som beskrivs i steg 1 kan förberedelser och iscensättning av virgin djur med ingen tidigare erfarenhet av ihopkoppling.

Den beteendemässiga provning som beskrivs i steg 2 tillåter videoinspelning och observation av beteendet mate-bevakning av Tigriopus hoppkräftor. Den följande undersökningen på den inspelade videon med metoderna som beskrivs i steg 3 och 4 kan kvantitativ analys av flera aspekter av det beteende som visas i figur 1.

Figur 11 visar en skillnad i genomsnittlig varaktighet av vaktar försök mellan manligt-kvinnligt par och hane-hane par T. californicus. En manuell analys visat att hane-hane par visade relativt kortare para ihop än manliga-kvinnliga par.

Exempel på banor som spåras med analysmetoden som presenteras i figur 12 och representativa resultat av velocity analysen visas i figur 13. Tvådimensionell rumsliga spårning av nybildade bevakning parar av T. californicus avslöjade att hane-hane par tenderade att visa högre hastighet än manliga-kvinnliga par i den första 3 s av vaktar försök.

Figure 1
Figur 1: Mate-bevakning beteende i Tigriopus. (A) en vuxen man knäpper fast en juvenil (copepodid) med de första antenner (indikeras med blå pilar). Bar = 1 mm. (B) en disposition av mate-bevakning beteende. En man försöker fånga en mål-individ (vänster) och bildar ett par med det (i mitten). I hane-hane par och vissa manliga-kvinnliga par avslutar en bevakning försök utan parning. Denna siffra har ändrats från Tsuboko-Ishii och Burton 20175. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Utvecklingsstadierna i Tigriopus. Tigriopus arter genomgå vanligtvis sex nauplius stadier (från NI att NVI), fem copepodid stadier (från CI till CV) och en vuxen skede (CVI)16. Män gör bevakning försök till ungdomar från ett tidigt skede av copepodids (CI i T. japonicus och T. fulvus6,17 ) och CII i T. californicus3, samt till vuxna av båda könen5 . Denna siffra har ändrats från Tsuboko-Ishii och Burton 20175. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Morfologi av vuxna (T. californicus). (A) vuxen hane. (B) vuxen hona. (C) dräktig vuxen kvinna med en ägg sac med befruktade och utvecklade (klart orange) ägg. (D) dräktig vuxen kvinna med en ägg sac med obefruktat eller outvecklade (Mörkgrön) ägg. Pilarna anger ägg säckar. Bar = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Skissera av förberedelse för enskilda kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Molted avsked. (A) avsked från CI till CV stadier av ett enskilt djur i T. californicus. Bar = 1 mm. (B) avsked från CI till CV arrangerar i en individuell kultur väl. Vitt skräp är avföring av ett djur i brunnen (visas ej i bilden). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Sök efter avsked under ett stereomikroskop. Barer = 1 mm. (A) Focal förändring av ett stereomikroskop för detektion av avsked på olika djup. Magenta pilar indikerar fokuserad avsked och grå pilar indikerar ofokuserat avsked. Övre bilden fokuserar på den vänstra avsked, vilket är nedsänkt på botten av brunnen. Nedre bilden fokuserar på den högra avsked, som är flytande under medellång ytan. (B) övre bilden visar ett exempel på obstruktion av undersökning av skräp som flyter på medellång ytan. En grön pil anger ett avsked som döljer sig under skräp. Nedre bilden visar ett resultat av ytrengöring med en liten bit hushållspapper. Ett avsked (indikeras med en grön pil) är synlig efter rengöring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: mellanlagrings- och könsbestämning av djur. Exempel på hur man Markera antal avsked och sex av djur på ett lock av en kultur plattan. (A) ett exempel för en brunn som innehåller fem avsked och ett vuxet djur. Antalet rader i tally märket på locket representerar antalet det avsked som finns i brunnen. När antalet avsked når fem, kön på djuret kan fastställas baserat på antenner morfologi (se även figur 3). (B) ett exempel på en markant locket kultur platta. Översta rader innehåller äldre (CIV till vuxen) djur och botten rader innehåller yngre (dvs nyligen insamlade) djur (CI till CIII). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Behavioral testprogram. Installationsprogrammet för videoinspelning av mate-bevakning beteende (vänster) och en disposition av beteendemässiga test (höger). Denna siffra har ändrats från Tsuboko-Ishii och Burton 20175. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Skölj av djur före en beteendevetenskaplig test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: Definition av händelser granskas i manuell analys. Illustrationer av händelser observerades i förhållande till mate-bevakning försök. Namnen på de händelser definieras och analyseras i steg 3 är markerade. Händelser som omges av en prickad linje kan inte observeras i några mate-bevakning försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: Skillnad i vaktar varaktigheten mellan manligt-kvinnligt par och hane-hane par T. californicus. Varje triangel symbol representerar data från testade par. Barer och morrhår representerar medianer respektive interkvartilintervall. Genomsnittlig varaktighet av capture var större för manligt-kvinnligt par (hane-hona (n = 22), hane-hane (n = 29); **p < 0,01 av Mann-Whitney U test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12: banor av par i tre sekunder vaktar försök. Exempel på spårade tvådimensionella banor av manligt-kvinnligt par (vänster) och hane-hane par (höger) av T. californicus. Prickar på trajectoriesen företräda tidpunkter (30 bilder per sekund). Barer = 10 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 13
Figur 13: Skillnaden i genomsnittlig hastighet efter påbörjande av bevakning mellan manligt-kvinnligt par och hane-hane par T. californicus. Varje triangel symbol representerar data från testade par. Barer och morrhår representerar medianer respektive interkvartilintervall. Genomsnittlig hastighet av paret i de första 3 s av vaktar försök var större för hane-hane par (hane-hona (n = 13), hane-hane (n = 35). ***p < 0,001 av Mann-Whitney U test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Suppl Figure 1
Kompletterande bild 1: Effekten av sköljning behandling på uppförandet av Tigriopus. Varje cirkel eller triangel symbol representerar data från en testade individen eller paret. Barer och morrhår representerar medianer respektive interkvartilintervall. Individer i ”sköljas” och ”inte sköljas” grupper hanterades på samma sätt, förutom att gruppen ”inte sköljas” inte fick skölja behandling (steg 2.1.3) före 30 minuters justering (steg 2.1.4). (A) genomsnittliga hastighet sköljda män tenderade att vara större än inte sköljas hanar (sköljda (n = 6), inte sköljas (n = 6), n.s.: ingen signifikant skillnad upptäcktes av Mann-Whitney U test). Hastigheten mättes för 30 s baserat på videor inspelade efter justering. (B) genomsnittliga hastighet av sköljda kvinnor tenderade att vara större än inte sköljas honor (sköljda (n = 6), inte sköljas (n = 6), n.s.: ingen signifikant skillnad upptäcktes av Mann-Whitney U test). Hastigheten mättes för 30 s baserat på videor inspelade efter justering tiden, efter steg 4 (spårning intervall = 0,5 s). (C) frekvensen av vaktar försök var större för par sköljda individer (sköljda (n = 6), inte sköljas (n = 6). ** p < 0,01 av Mann-Whitney U test). (D) varaktighet vaktar försök tenderade att vara större för par sköljda individer (sköljda (n = 6), inte sköljas (n = 6), n.s.: ingen signifikant skillnad upptäcktes av Mann-Whitney U test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Enskilda odling och bestämning av scenen och kön

Här beskrev vi den metod som används i vår tidigare studie5 för att förbereda oskuld Tigriopus djur med deras hopkoppling erfarenhet som kontrolleras vid spårning av deras utveckling (figur 4 och figur 7). Som Tigriopus arter utnyttjas som modell djur i olika biologiska områden såsom toxikologi16,18, ekologiska fysiologi19,20,21, och evolutionära genetik13,22,23,24, denna metod har en potential att ge ett värdefullt sätt att bedöma påverkan av miljö och genetiska faktorer på livscykeln för dessa hoppkräftor.

För att uppnå framgångsrik förproduktion, vanlig sökning och samling av CI är copepodids från en massa kultur (steg 1.2) kritisk, eftersom samling i senare skeden kan leda till felaktig iscensättning av djuren. Dessutom är en grundlig söka avsked (steg 1.3) också viktigt för korrekt stadieindelning. Öka frekvensen för insamling och mellanlagring vid behov eftersom intervallet mellan molts varierar från en till flera dagar beroende på art och uppfödning skick2,25,26. Skillnader i antenner morfologi mellan copepodids och vuxna honor är inte synbart signifikanta i vissa arter och populationer av Tigriopus16,25. Mellanlagring före könsbestämning är därför bra att skilja vuxna honor från avancerade copepodids av båda könen.

Beteendemässiga tester och manuell analys av beteendemässiga egenskaper

I allmänhet är en av de mest kritiska delarna av etologiska studier definition och beskrivning av händelser av intresse. Metoder som införs i detta papper först utvecklades för vår senaste studie5 och kompletteras med en beskrivning av parning och de visuella hjälpmedlen (figur 10). I tillägg till detta, spelar konsekvens i djurhantering också en viktig roll i beteende experiment. Till exempel sköljning av Hoppkräftor potentiellt kan underlätta vissa aspekter av deras beteende (kompletterande Figur1) och är därför önskvärt att utföras på ett konsekvent sätt bland prover, såsom standardiserade i steg 2.1.3. Vi förväntar oss de material som tillhandahålls i denna uppsats kommer att hjälpa kontrollerade och reproducerbara studier på Tigriopus, att främja reproduktiv och ekologiska studier av denna rikliga invånaren av högvatten pool mate-bevakning beteende.

En möjlig begränsning med denna metod är låg förstoring av erhållna bilder. Även filmer som är inspelade med vårt system tillåter identifiering av framstående kroppens strukturer inklusive urosomes och manliga första antenner, kan man inte kunna observera mer subtila strukturer såsom ben och genitalier med vår metod eftersom det inte anställer mikroskopiska förstoring för videoinspelning. Medan Kelly et al. rapporterade att de kunde iaktta spermatofor överföra från män till kvinnor av T. japonicus under en mikroskopisk observation på 100 X förstoring (ingen video inspelad)7, har vi inte kunnat iaktta en spermatofor i våra filmer, kanske på grund av begränsningen av bildens upplösning.

Tvådimensionell spårning av par

Även om denna metod inte tillåter tredimensionell spårning av djur, möjliggör det tvådimensionell bana analys av djurplankton utan kemiskt märkning djur (cf. Ister et al. 201027) genom att utnyttja program som distribueras gratis. Om storleken på en filmfil är för stor för att behandlas i ImageJ, kan minska upplösningen av filen och omvandla det till en film i gråskala. Medan den beskrivna metoden utvecklades ursprungligen för vuxna parar av T. californicus (figur 12 och figur 13), finns det även för vuxen-ung par och enskilda individer (kompletterande Figur1) som liksom andra Tigriopus arter i princip. Vi förväntar oss ytterligare metoden är tillämplig på kort sikt (från vilken millisekund till de andra tidsskalor) bana analys av djurplankton av andra taxa med lämpliga justeringar.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från den Sumitomo Foundation, Japan (Grant för grundläggande forskningsprojekt, bevilja nummer: 150932) och forskning institutet av havslevande ryggradslösa djur, Japan (2018 enskilda forskningsbidrag) till STI och RSB samt ett bidrag från USA National Science Foundation (DEB-1556466) till RSB. Vi tackar Ms. Kiana Michelle Woodward för feedback på metoden odling och mellanlagring.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Sea Salt Spectrum Brands. Inc. SS1-160P For preparation of culture medium
PRO PlecoWafers Tetra 16447 Food for copepods (used after being ground in a mortar)
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid Corning Co., Ltd. 353224 Container for culture of gravid females and hatched nauplii
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid Corning Co., Ltd. 353226 Container for individual culturing
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid Nest Biotechnology Co., Ltd. 748001 Behavioral observation chambers
LED light pad Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. Litup LP4 Backlight for behavioral observation
Camera Canon 0591C003 (model: Rebel T6i) For recording of behavior
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A For transfer of copepods
P10 micropipette tips VWR 613-0735 For transfer of C1 stage copepodids
ImageJ NIH Version 1.49t For semi-automatic analysis of movies
MTrackJ Version 1.5.1 ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47, (5-12), 427-447 (2013).
  2. Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20, (3), 523-536 (1936).
  3. Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86, (3), 247-252 (1985).
  4. Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59, (2), 171-179 (1990).
  5. Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12, (8), e0183758 (2017).
  6. Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17, (3), 474-500 (1970).
  7. Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353, (1369), 737-744 (1998).
  8. Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130, (4), 605-612 (1998).
  9. Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40, (9), 1664-1675 (2013).
  10. Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136, (4), 693-698 (2000).
  11. Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
  12. Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15, (4), 868-879 (2015).
  13. Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25, (7), 1478-1493 (2016).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  15. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  16. Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83, (3), 161-173 (2007).
  17. Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
  18. Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59, (12), 1061-1066 (1933).
  19. McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69, (2), 273-277 (1981).
  20. Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61, (4), 618-622 (1995).
  21. Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284, (1853), 20170236 (2017).
  22. Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32, (3), 613-622 (2015).
  23. Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28, (12), 2196-2207 (2015).
  24. Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111, (5), 391-401 (2013).
  25. Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26, (1), 11-21 (1970).
  26. Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78, (2), 467-481 (1998).
  27. Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5, (10), e13516 (2010).
Enskilda odling av <em>Tigriopus</em> hoppkräftor och kvantitativ analys av deras Mate-bevakning beteende
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior. J. Vis. Exp. (139), e58378, doi:10.3791/58378 (2018).More

Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior. J. Vis. Exp. (139), e58378, doi:10.3791/58378 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter