Summary
Kompis vokter atferd spiller en viktig rolle i reproduksjon av fjæra Raudåta av slekten Tigriopus. Metoder for å studere dette har imidlertid ikke blitt beskrevet. Her beskriver vi metoder for: 1) individuell kultur jomfru Tigriopus dyr og 2) kvantitativ analyse av sin kompis vokter atferd.
Abstract
Raudåta av slekten Tigriopus, som er vanlig dyreplankton i steinete tidevann bassenger, viser precopulatory kompis vokter oppførsel der en mannlig hekter en potensiell kompis å danne et par. Mens dette fenomenet vakte interessen av, har metoder for analysen ikke blitt beskrevet. Her beskriver vi prosedyrer for: 1) individuell dyrking og regi av Tigriopus barn og voksne, og 2) video-basert analyse av sin kompis vokter atferd. Metoden culturing aktiverer eksperimentelle kontroll over paring opplevelsen av dyr samt muligheten til å spore deres utvikling før atferdsmessige tester. Metoden analyse kan kvantitativ vurdering av flere deler av mate-vokte atferd, inkludert fange forsøk av menn og svømming bane av kompis vokter. Selv om disse metodene ble opprinnelig etablert for etologiske studier på Tigriopusmed riktige modifikasjoner de kan også brukes til studier av andre dyreplankton i forskjellige forskningsfelt, som fysiologi, toksikologi, og økologiske genetikk.
Introduction
Fjæra Raudåta av slekten Tigriopus er vidt distribuert i steinete høy fjæra bassenger over flere kontinenter1. Disse Raudåta oppfører kompis vokter som en del av deres reproduksjon, der en voksen mann fanger en potensiell kompis (juvenile eller voksen) utnytte sin første hekta antenner før copulation (figur 1 og figur 2)2 ,3,4,5. Selv om dette fenomenet har vært gjenstand for etologiske og biokjemiske studier for tiår2,3,6,7, detaljerte prosedyrer for studier av dette problemet, inkludert Personlige kultur, jomfru dyr og kriterier atferdsmessige hendelsesforløpet i en kompis vokter forsøk, har ikke blitt beskrevet. Dermed etablere her vi metoder for å aktivere studier av under et kontrollert eksperimentelle miljø.
Individuelle dyrking og iscenesettelse av dyr
Tidligere studier av reproduksjon av Tigriopus ansatt konvensjonelt et par frakobling metoden for å forberede yngel (copepodids) og voksne kvinner atferdsmessige tester og avl eksperimenter3,8,9 ,10. Men tillater denne metoden dyr å danne par og potensielt pare før tester (omtalt i Ito 198811), som kan endre atferdsmessige egenskaper dyr5. I tillegg er det også mulighet til å bedømme galt utviklingsstadier av Raudåta med vanlige protokoller som de er avhengige av tilsynelatende kroppsstørrelse for regi. I dette papir beskriver vi en individuell culturing metoden som brukes i vår siste undersøkelse med Tigriopus californicus5, som ble utviklet for å håndtere disse begrensningene ved å kontrollere paring opplevelsen av dyr og spore deres utvikling fra copepodid til voksne stadier.
Kvantitativ analyse av kompis vokter atferd
Kompis vokter atferden til Tigriopus arter har blitt undersøkt ikke bare innen etologi2,6 , men også i andre områder som økotoksikologi og evolusjonær genetikk3,4, 7 , 8 , 9 , 10. imidlertid de tidligere studiene har forklart i løpet av dette hovedsakelig i skrevet skjemaer uten tilstrekkelig visuelle illustrasjoner skissere både virkemåten og metodene for å studere, som skaper tekniske hindringer for den replikering og fremme av studiene. Her gir vi detaljerte beskrivelser av noen av de viktigste hendelsene i kompis vokter atferden til Tigriopus Raudåta støttes av visuelle materialer. Vi viser også utstyr og metoder for kvantitativ analyse av atferd. Disse metodene tillater evaluering av atferdsmessige egenskaper av dyr under kompis vokter forsøk nettopp replikerte eksperimenter.
Med disse metodene mål å tilby en metodisk basis av kontrollert og reproduserbar studier på kompis vokter virkemåten av slekten Tigriopus.
Protocol
1. forberedelse av jomfru dyr for atferdsdata observasjon
- Få befruktede egg og tillate dem å klekkes.
- Samle gravid kvinner bærer klart oransje (dvs. befruktet og i avanserte stadier av utvikling) egg (Figur 3 c) fra en lager kultur med en Pasteur pipette. Skyll kvinner ved forsiktig pipettering dem i ren kultur medium å unngå overføring av andre dyr, inkludert nauplial larvae det kanskje er klekket i kulturen.
Merk: I denne protokollen, kunstige sjøvann med et saltinnhold på 35% er brukt som kultur medium. Bruk annet medium (f.eks kunstig sjøvann med en høyere saltholdighet eller en ekstra stoff) avhengig av formålet med et eksperiment.
Merk: Se Barreto et al. 201512 for en metode for etablering av laboratoriet kultur aksjer og Pereira et al. 201613 eksempler samling nettsteder av naturlige populasjoner av T. californicus. Peterson et al. rapporterte også deres samling nettsteder T. californicus, T. fulvusog T. japonicus med breddegrad og lengdegrad informasjon9. Bruke plast Pipetter med en kapasitet på omtrent 30-50 mL for å samle Tigriopus Raudåta fra rock bassenger. - Sett hver kvinnelige individuelt i et godt av en 6-vel celle kultur plate med ren kultur medium (Figur 4, venstre). Kontroller at ingen andre dyr (inkludert nauplial Larven) er forurensende brønnen.
- Opprettholde plater i en inkubator satt ved 20 ° C med en 12-timers lys og mørke syklus til kultur kvinner før de slipper egg sacs. Dette trinnet tar vanligvis en til ti dager avhengig av arter og utviklingsstadier av embryo. I mellomtiden feed hver gravid kvinne to ganger i uken med to korn av fint bakken (ca < 0,5 mm i diameter) fiskefôr (se Tabell for materiale for detaljer).
Merk: Bruk forskjellige temperaturer og lyset sykluser avhengig av formålet med et eksperiment. Høyere temperaturer kan lette rask utvikling av embryoene.
Merk: Unngå forlate overmål næringen råtnende i brønner. Hvis matrester begynner å decay, Pipetter det av brønner med en Pasteur pipette. - Når egg sacs utgis, fjerne kvinner fra kultur brønnene med en Pasteur pipette.
Merk: Inseminated kvinner er i stand til gyting flere clutcher avkom2,3. Eventuelt kan du overføre kvinner i andre brønner samle ytterligere klørne.
- Samle gravid kvinner bærer klart oransje (dvs. befruktet og i avanserte stadier av utvikling) egg (Figur 3 c) fra en lager kultur med en Pasteur pipette. Skyll kvinner ved forsiktig pipettering dem i ren kultur medium å unngå overføring av andre dyr, inkludert nauplial larvae det kanskje er klekket i kulturen.
- Samle copepodids for personlige kultur.
- Holde platene med skravert nauplii i kuvøse og kultur av nauplii før de utvikler til første copepodid (CI) trinn (Figur 4, midten). Dette trinnet tar vanligvis fra en til to uker. Feed hver med flere korn av det fint bakken fisk mat mens du søker for CI dyr en gang annenhver dag. Fylle fordampet oppdrett vann med destillert vann.
Merk: Hvis flytende avfall hindrer visningen, skumlese den med et lite stykke papirhåndkle. - CI dyr starter å dukke opp, samle dem fra brønnene P-10 brønnene med med pipettering volumet satt på ca 8 µL, under en stereomicroscope på 10 X 40 X forstørrelse (Figur 4, høyre). Vask hvert CI dyr av forsiktig pipettering det i ren kunstig sjøvann og plassere den i et godt av 24-vel celle kultur plate inneholder 2-3 mm dybde (ca 400-600 µL) kunstig sjøvann.
Merk: Unngå bærer over nauplial exuviae eller andre dyr i brønnene for personlige kultur.
- Holde platene med skravert nauplii i kuvøse og kultur av nauplii før de utvikler til første copepodid (CI) trinn (Figur 4, midten). Dette trinnet tar vanligvis fra en til to uker. Feed hver med flere korn av det fint bakken fisk mat mens du søker for CI dyr en gang annenhver dag. Fylle fordampet oppdrett vann med destillert vann.
- Utvikling av enkeltpersoner ved å telle molted exuviae.
- Undersøke i hver brønn for molted exuviae hver to til tre dager (Juster frekvensen hvis nødvendig) ved stereomicroscopic observasjon under en mørk-feltet belysning på 10 X 40 X forstørrelse. Exuviae av copepodids er gjennomsiktig og gjenkjennelig med Bristol Ben, et par caudal rami (dvs. tynne stikker strukturer på caudal slutten) og/eller segmentering av prosome og urosome (figur 5). Endre fokus og belysning å oppdage exuviae på ulike dybder i en brønn (figur 6A).
Merk: Molted exuviae er mindre enn det dyr som har molted seg. Starte eksamen fra lavere forstørrelse til et dyr og relativt ny exuviae og Skift til høyere visningsstørrelsen for eldre (dvs. mindre) exuviae.
Merk: Hvis exuviae i en brønn er skadet, eliminere the godt av ytterligere utviklingsmessige sporing å unngå feilvurdering av utviklingsstadier.
Merk: Hvis flytende avfall hindrer visningen (figur 6B), skumlese den med et lite stykke papirhåndkle. - Registrere totalt copepodid exuviae i hver brønn med et tally merke på plate lokket (figur 7). Legge til en linje merket som en ny exuviae finnes i brønnen.
Merk: Hvis det er nauplial exuviae forurenset i brønnen, eliminere dem fra teller. - Feed hver enkelt med to korn av det fint bakken fisk mat. Fylle fordampet oppdrett vann med destillert vann å opprettholde saltholdighet.
Merk: Feed copepodids hver to til tre dager for å hindre dem fra å konsumere og skade molted exuviae, som potensielt kan påvirke estimering av utviklingen scene (trinn 1.3.4). - Anslå utviklingen scene av dyret basert på antall i exuviae. Hvis det er ingen exuviae, er enkelt anslått for å være på CI stadium. Hvis det er én til fire exuviae, er enkelt anslått for å være CII til CV stadier. Hvis det finnes fem exuviae, er enkelt anslått for å være en voksen.
- Undersøke i hver brønn for molted exuviae hver to til tre dager (Juster frekvensen hvis nødvendig) ved stereomicroscopic observasjon under en mørk-feltet belysning på 10 X 40 X forstørrelse. Exuviae av copepodids er gjennomsiktig og gjenkjennelig med Bristol Ben, et par caudal rami (dvs. tynne stikker strukturer på caudal slutten) og/eller segmentering av prosome og urosome (figur 5). Endre fokus og belysning å oppdage exuviae på ulike dybder i en brønn (figur 6A).
- Identifisere sex voksne basert på morfologi.
- Sex dyr ved å undersøke deres morfologi. Voksne Tigriopus menn har geniculate første antenner med hekta og globular strukturer på den klubbeformede enden (figur 3A). Voksne hunner har jevnere og relativt tynnere første antenner (figur 3B) enn menn. Noen kvinner også utstillingen mørkegrønne fargen fra gonadal lipid i kroppen (figur 3B, 3D).
- Merk sex på lokket av brønnen (figur 7B).
2. atferdsmessige Test og videoopptak av kompis vokter atferd
- Velg dyr av ønsket scene og sex for en opptreden test døgnet testing.
- Feed valgte personer i kultur brønner med fint malt fisk mat og tillate dem å spise det i 30 minutter. I mellomtiden Fortsett å gå 2.1.2 å forberede testing kamre.
- Forberede to 48-vel flat bunn celle kultur plater som tester kamrene; en plate (heretter kalt "friksjonsskiven A") er for menn og andre ("plate B") for mål (f.eks copepodids, voksne hunner, voksne hanner). Legge til 400 µL av ren kunstig sjøvann med et saltinnhold på 35% i brønnene av platene. Plass platene på en LED lys pad dekket med en gjennomsiktig akryl bord som en lys diffuser (Figur 8).
Merk: Bruk annet medium avhengig av et formål av et eksperiment.
Merk: For å unngå overskuddsvarme, ikke bruk glødelamper og lysstoffrør lamper som bakgrunnsbelysning. - Etter 30 minutters fôring tiden beskrevet i 2.1.1, skyll hvert dyr av forsiktig pipettering det i en rekke av fire brønner av en 24-vel plate fylt med ren kunstig sjøvann (figur 9) å hindre bære-over av avfall og exuviae fra kultur brønner.
- Plass skylles enkeltpersoner i brønnene plater A og B på LED lys puten. Tillat 30 minutter for justering av dyr til brønnene.
- Angi et videokamera over en under justering periode (Figur 8). Bruk et stativ eller en stand til å holde kameraet.
- Fokus kameraet på menn i en å tillate en observasjon av antenner.
Merk: For å redusere av bakgrunnsbelysningen i filmer, sette en bildefrekvens som er lik eller halvparten av en elektrisk frekvens og bruke en lenger eksponeringstid. Likeledes, holde LED lys pad dekket med en gjennomsiktig akryl bord som beskrevet i trinn 2.1.2.
- Etter justering periode beskrives i trinn 2.1.4, start videoopptak og atferdsmessige testen.
- Overføre målene fra plate B til friksjonsskiven A med en Pasteur pipette. Hvis forsøket er følsomme overfor kjemiske komponenter i medium, endre Pipetter for hvert testing par.
Merk: Når pipettering et dyr fra plate B, ikke jage den i vannet med en Pasteur pipette vann forstyrrelser kan stimulere dyret og lokke fram sin overflødig bevegelse. Hold et tips av pipette over vannflaten og vente for enkelt å komme under spissen. Pipetter forsiktig det opp med en liten mengde kunstig sjøvann og deretter løser den inn i en brønn på plate A. - Etter en eksperimentell planen, kan en mannlig og en mål å samhandle i hver brønn for en ønsket tidsrom observasjon (f.eks 10 minutter) etter overføringen.
- Stoppe videoinnspilling etter observasjon. Hvis nødvendig, laste ned de innspilte filmene fra kameraet til en datamaskin.
- Overføre målene fra plate B til friksjonsskiven A med en Pasteur pipette. Hvis forsøket er følsomme overfor kjemiske komponenter i medium, endre Pipetter for hvert testing par.
3. manuell analyse av atferdsmessige egenskaper
- Undersøk filmen for tidspunktet når hvert mål ble overført i brønnen på plate A.
- Undersøk initiering og oppsigelse tidsberegningen av hendelser rundt og beregne varighet, ventetid og hyppigheten av hendelsene.
- Definere initiering av vokter forsøk fra en mann som kontakt hannens antenne med kroppen deler av målet (Figur 10, øverst til venstre). Antennal kontakten blir ofte etterfulgt av en rask (< 0,5 s) jage eller pounce.
- Definere oppsigelse av vokter forsøk som et punkt når begge antenner av mannlige løsne fra kroppen av et mål (Figur 10, øverst til høyre). Beregn antallet vokter forsøk som:
- Definere initiering av copulation ved en dorsal kroppen sving av en mann som etterfølges av et gjentatte trykk på en urosome mot kvinnelige (Figur 10, nederst til høyre). Trykk er flere ganger per sekund.
Merk: En vokter mannlig gjennomsøker ned til caudal slutten av kvinnens kropp før copulation (Figur 10, nederst til venstre). - Definere oppsigelse copulation ved avdeling av urosomes etter hendelsene beskrevet i 3.2.4.
Merk: Copulation vanligvis foregår i flere minutter i tilfeller av T. californicus og T. japonicus.
4. todimensjonal sporing av enkeltpersoner og par
- Generere et videoklipp med en episode av interesse (f.eks den første 3 er en vokter forsøk) ved trimming filmen registrert i trinn 2 med programvare for filmredigering.
- Installere ImageJ14 fra: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Så dataoverføre MTrackJ, en bevegelse-sporing plugin for ImageJ15, av fulgte instruksjonene på: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- Åpne ImageJ og importere en film av interesse (f.eks fil > Import > bruke QuickTime; velge "Konverter 8-biters gråtonebilder" å redusere kreves for bildebehandling).
- Utføre romlige og tid kalibrering.
- Velg rett linje-verktøyet i vinduet ImageJ for romlig kalibrering.
- Trekke et utvalg linje langs et objekt med en kjent lengde (f.eks diameter på en godt) i vinduet film.
- Åpne "Angi skala"-menyen (analyser > Angi skala). Angi kjente lengden i boksen "Kjent avstand" og sin enhet (f.eks mm) i boksen "Enhet av lengde". Merk av "Global" for å bruke skalaen for andre videoklipp.
- Åpne "Egenskaper"-menyen (Image > egenskaper) for tiden kalibrering. Angi ramme intervall (gjensidige av bildefrekvens) i boksen «Ramme intervall».
- Konfigurere sporing med MTrackJ.
- Åpne MTrackJ plugin fra Plugins > MtrackJ på ImageJ. Velg knappen "Tracking" i vinduet MTrackJ dialogboksen Åpne en konfigurasjonsmenyen.
- Angi en sporing ved å sjekke "Flytter til neste gang indeks etter punkt" og skrive inn et tall i "Tid trinn størrelse"-boksen i dialogboksen konfigurasjonsvinduet. For å utføre frame-by-frame sporing, angi "1" i boksen "Tid trinn størrelse".
- Sjekk "Bruk lokal markør knipser under sporing" og velg "Mørk centroid" som en snap-funksjonen. Dette alternativet kan en automatisk registrering av centroid av et mørkt objekt (dvs. en person eller et par) i en oppdagelsen kvadrat ("snap range") rundt en markør. Velg en størrelse på å dekke hele par eller dyr i filmen (f.eks 31 x 31 piksler).
- Klikk "OK" for å bruke de valgte alternativene.
- Utføre todimensjonal sporing.
- Klikk på "Legg til" knappen i dialogvindauget for MTrackJ til å finne.
- Plass en markør (deteksjon firkanten) for å dekke et par eller en individuell spores. Klikk for å oppdage den mørke centroid av objektet i plassen.
- Gjenta trinn 4.6.2 for et ønsket antall rammer.
- Vil generere datatabeller, klikker du "Tiltak"-knappen i dialogvindauget for MTrackJ. Dataene vises i to Vinduer: "MTrackJ: spor"-vinduet viser et sammendrag av sporede todimensjonal banen og "MTrackJ: poeng" viser detaljerte data for hvert punkt. Hvis du vil lagre hver tabell, velger du Fil > Lagre som...-menyen på ImageJ.
Merk: Se den elektroniske manuelt leveres av en utvikler (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) beskrivelse av hver datakolonne. - Vil generere en film med en merkede banen tegnet som en farget linje, klikker du på "Film"-knappen i dialogvindauget for MTrackJ. Hvis du vil lagre den genererte filmen, velger du Fil > Lagre som...-menyen på ImageJ.
- Lagre hele resultatet. Klikk på "Lagre"-knappen i MTrackJ dialogvinduet lagre resultatene inkludert data (trinn 4.6.4) og merkede todimensjonal banen (trinn 4.6.2 og 4.6.3).
Representative Results
Personlige culturing metoden beskrevet i trinn 1 kan forberedelse og iscenesettelse av jomfru dyr med noen tidligere erfaring av sammenkoblingen.
Atferdsmessige testen beskrevet i trinn 2 lar video-opptak og observasjon av atferden kompis vokter av Tigriopus Raudåta. Følgende undersøkelse av innspilt video med metodene som er beskrevet i trinn 3 og 4 kan kvantitativ analyse av flere aspekter av vist i figur 1.
Figur 11 viser en aldersforskjell Gjennomsnittsvarighet av vokter forsøk mellom Hann-hunn par og Hann-hann par T. californicus. En manuell analysen viste at Hann-hann par viste relativt kortere varighet av sammenkobling enn mann-kvinne par.
Eksempler på baner sporet med metoden analyse blir presentert i Figur 12 og et representativt resultat av hastighet analyse er vist i figur 13. Todimensjonal romlige sporing av nydannede vokter T. californicus avslørt at Hann-hann par tendens til å vise høyere hastighet enn mann-kvinne par i de første 3 s vokter forsøk.
Figur 1: Mate vokter atferd i Tigriopus. (A) en voksen mann slår en juvenil (copepodid) med første antennene (angitt med blå piler). = 1 mm. (B) en disposisjon av kompis vokter bar. En mann prøver å fange en mål person (venstre) og danner et par med det (midten). I Hann-hann par og noen mann-kvinne-par avslutter en vokter forsøk uten copulation. Dette tallet er endret fra Tsuboko-Ishii og Burton 20175. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Utviklingsstadier for Tigriopus. Tigriopus arter gjennomgå generelt seks nauplius etapper (fra NI til Veterinærinstituttet), fem copepodid trinn (fra CI å CV) og en voksne stadiet (CVI)16. Menn gjøre vokter forsøk til yngel fra et tidlig tidspunkt i copepodids (CI i T. japonicus og T. fulvus6,17 ) og CII i T. californicus3og voksne av begge kjønn5 . Dette tallet er endret fra Tsuboko-Ishii og Burton 20175. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Morfologi av voksne (T. californicus). (A) voksen mann. (B) voksen kvinne. (C) Gravid voksen kvinne med et egg sac med befruktet og utviklet (klart oransje) egg. (D) Gravid voksen kvinne med et egg sac 5mas eller uutviklet (mørk grønn) egg. Pilene angir egg sacs. Bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: omrisset av forberedelse for personlige kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Molted exuviae. (A) Exuviae fra CI til CV stadier av en enkelt dyr av T. californicus. Bar = 1 mm. (B) Exuviae fra CI å CV stadier i en personlige kultur godt. Hvit rusk er ekskrementer av et dyr kultivert brønnen (ikke vist i bildet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: etter exuviae under en stereomicroscope. Barer = 1 mm. (A) Focal endring av en stereomicroscope for påvisning av exuviae på ulike dyp. Magenta piler angir fokusert exuviae og grå piler angir ufokusert exuviae. Topp bilde fokuserer på den venstre exuviae, som er senket på bunnen av brønnen. Nederste bilde fokuserer på den høyre exuviae, som flyter under middels overflaten. (B) øverste bildet viser et eksempel på obstruksjon av undersøkelse av løsmasser flytende på middels overflaten. En grønn pil viser en exuviae som er skjult under rusk. Bunnen av bildet viser et resultat av surface rengjøring med en liten håndkle. En exuviae (angitt med en grønn pil) er synlige etter rengjøring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Staging og sexing dyr. Eksempler på hvordan du kan markere antall exuviae og sex av dyr på et lokk av en kultur plate. (A) et eksempel for et godt som inneholder fem exuviae og en voksen dyr. Antall linjer i tally merket på lokket representerer antall exuviae i brønnen. Når antall exuviae når fem, sex av dyret kan avgjøres basert på antenner morfologi (se også Figur 3). (B) et eksempel på en merket lokket av en kultur plate. Øverste radene inneholder eldre (CIV til voksen) dyr og nederste radene inneholder yngre (dvs. ny samlet) dyr (CI til CIII). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: atferdsmessige test ordningen. Oppsett for videoopptak av kompis vokter atferd (venstre) og en disposisjon av atferdsmessige test (høyre). Dette tallet er endret fra Tsuboko-Ishii og Burton 20175. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Skyll dyr før en opptreden test Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: definisjon av hendelser undersøkt i den manuelle analysen. Illustrasjoner Hendelsesforløpet observert i forhold til kompis vokter forsøk. Navn på hendelser definert og analysert i trinn 3 utheves. Hendelser i en prikket linje kan ikke sees i noen kompis vokter forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: Aldersforskjell vokter mellom Hann-hunn par og Hann-hann par T. californicus. Hver trekantsymbolet representerer data fra ett testet par. Barer og værhår representerer medians og interquartile rekkevidde henholdsvis. Gjennomsnittsvarighet av fangst var større for Hann-hunn par (mann-kvinne (n = 22), Hann-hann (n = 29); **p < 0,01 av Mann-Whitney U test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: baner par i de første tre sekundene vokter forsøk. Eksempler på merkede todimensjonal baner av mann-kvinne par (venstre) og Hann-hann par (til høyre) av T. californicus. Prikker på baner representerer tidspunkt (30 bilder per sekund). Barer = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13: Differansen mellom Gjennomsnittlig hastighet etter initiering av vokter mellom Hann-hunn par og Hann-hann par T. californicus. Hver trekantsymbolet representerer data fra ett testet par. Barer og værhår representerer medians og interquartile rekkevidde henholdsvis. Gjennomsnittlig hastighet av paret i de første 3 s vokter forsøk var større for Hann-hann par (mann-kvinne (n = 13), Hann-hann (n = 35). ***p < 0,001 av Mann-Whitney U test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Effekten av skylling behandling på oppførselen til Tigriopus. Hver sirkel eller trekant symbolet representerer data fra testet person eller par. Barer og værhår representerer medians og interquartile rekkevidde henholdsvis. Enkeltpersoner i "skylles" og "ikke rense" grupper ble behandlet på samme måte, bortsett fra at gruppen "ikke rense" ikke oppleve skyllingsprosess behandling (trinn 2.1.3) før 30 minutters justering (trinn 2.1.4). (A) gjennomsnittlig hastighet skylles menn tendens til å være større enn ikke skylles menn (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6), født: ingen signifikant forskjell ble oppdaget av Mann-Whitney U test). Hastigheten ble målt for 30 s basert på videoer innspilt etter justering. (B) gjennomsnittlig hastighet skylles kvinner tendens til å være større enn ikke skylles kvinner (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6), født: ingen signifikant forskjell ble oppdaget av Mann-Whitney U test). Hastigheten ble målt for 30 s basert på video registreres etter justering tiden, etter trinn 4 (oppsporer intervall = 0,5 s). (C) frekvensen av vokter forsøk var større for par skylles individer (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6). ** p < 0,01 av Mann-Whitney U test). (D) varigheten av vokter forsøk tendens til å være større for par skylles enkeltpersoner (skylles (n = 6), ikke skylles (n = 6), født: ingen signifikant forskjell ble oppdaget av Mann-Whitney U test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Individuelle dyrking og fastsetting av scenen og sex
Her beskrev vi metoden som brukes i våre tidligere studie5 for å forberede jomfru Tigriopus dyr med deres paring opplevelsen kontrollert under sporing av deres utvikling (Figur 4 og figur 7). Som Tigriopus arter benyttes som modell dyr i ulike biologiske som toksikologi16,18, økologiske fysiologi19,20,21, og evolusjonære genetikk13,22,23,24, denne metoden har et potensial til å gi en verdifull måte å vurdere påvirkning av miljømessige og genetiske faktorer på disse Raudåta livssyklus.
For å oppnå vellykket regi, vanlig søk og samling av CI er copepodids fra en masse kultur (trinn 1.2) avgjørende fordi samlingen ved senere stadier kan føre mis iscenesettelse av dyrene. I tillegg er en grundig søk etter exuviae (trinn 1.3) også avgjørende for nøyaktig regi. Øke frekvensen av innsamling og staging eventuelt som intervallet mellom molts varierer fra en til flere dager avhengig av Art og oppdrett betingelse2,25,26. Forskjeller i antenner morfologi mellom copepodids og voksne kvinner er ikke synlig betydelig i noen arter og bestander av Tigriopus16,25. Derfor er oppsetning før sexing nyttig å skille voksne hunner fra avanserte copepodids av begge kjønn.
Atferdsmessige tester og manuell analyse av atferdsmessige egenskaper
Generelt, er en av de viktigste delene av etologiske studier definisjon og beskrivelse av hendelser av interesse. Metodene i denne artikkelen ble først utviklet for vår siste studie5 og supplert med beskrivelsen av copulation og visuelle hjelpemidler (Figur 10). I tillegg til at spiller konsistens i dyr håndtering også en viktig rolle i atferdsmessige eksperimenter. For eksempel skylling av Raudåta kan potensielt lette noen aspekter av deres atferd (supplerende figur 1) og derfor er ønskelig utføres på en konsekvent måte blant eksemplene, som standardisert i trinn 2.1.3. Vi forventer materiell i denne artikkelen vil hjelpe kontrollert og reproduserbar studier på kompis vokter oppførselen til Tigriopus, fremme reproduktiv og økologiske studier av dette rikelig innbygger i høyt tidevann bassenger.
En mulig begrensning med denne metoden er lav forstørrelse innhentet bilder. Selv om filmer med vårt system tillater identifikasjon av fremtredende kropp strukturer inkludert urosomes og mannlige første antenner, kan man ikke kunne observere mer subtile strukturer som bein og kjønnsorganer med vår metode siden det ikke ansette mikroskopiske forstørrelsen for video opptak. Mens Kelly et al. rapporterte at de klarte å observere spermatophore overføre fra menn til kvinner av T. japonicus under en mikroskopisk observasjon på 100 X forstørrelse (ingen video registrert)7, vi har ikke kunnet observere en spermatophore i våre filmer, kanskje på grunn av begrensning av bildeoppløsningen.
Todimensjonal sporing av parene
Selv om denne metoden ikke tillater tredimensjonale sporing av dyr, gjør det todimensjonal banen analyse av dyreplankton uten merking kjemisk dyr (cf. Smult et al. 201027) ved å bruke programmer distribuert gratis. Hvis størrelsen på en filmfil er for stor til å bli behandlet i ImageJ, kan redusere oppløsningen til filen og konvertere den til en grå skala film. Mens metoden beskrevet ble opprinnelig utviklet for voksen par T. californicus (Figur 12 og figur 13), er det også tilgjengelig for voksen-yngel par og enkelt enkeltpersoner (supplerende figur 1) som andre Tigriopus arter i prinsippet. Vi forventer ytterligere metoden skal gjelder for kortsiktige (fra millisekundet til de andre tidsskalaer) banen analyse av dyreplankton av andre taxa med nødvendige justeringer.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av tilskudd fra Sumitomo Foundation, Japan (stipend for grunnleggende vitenskap forskningsprosjekter, gi nummer: 150932) og Research Institute av Marine dyr, Japan (2018 personlige forskningsstipend) til STI og RSB stipend fra USA National Science Foundation (DEB-1556466) til RSB. Vi takker Ms. Kiana Michelle Woodward for tilbakemelding på metoden dyrking og oppsett.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
