Summary
Stuurman bewaken gedrag speelt een belangrijke rol bij de voortplanting van intertidal roeipootkreeften van het geslacht Tigriopus. Methoden voor het bestuderen van dit probleem zijn echter niet goed beschreven geweest. Hier beschrijven we methoden voor: 1) individuele cultuur van maagdelijke Tigriopus dieren, en 2) kwantitatieve analyse van hun stuurman bewaken gedrag.
Abstract
Roeipootkreeften van het geslacht Tigriopus, die gemeenschappelijke zoöplankton in rotsachtige tij zwembaden, Toon precopulatory stuurman bewaken gedrag waar een man een potentiële partner te vormen een paar sluitingen. Terwijl dit verschijnsel heeft belangstelling voor onderzoekers, zijn methoden voor de analyse niet goed beschreven. Hier beschrijven we procedures voor: 1) individuele kweken en opvoering van de Tigriopus jeugdigen en volwassenen, en 2) video-gebaseerde analyse van hun stuurman bewaken gedrag. Het kweken van de methode kunt experimentele controle van de schil van de ervaring van dieren, alsmede de mogelijkheid voor het bijhouden van hun ontwikkeling voordat gedrags proeven. De analysemethode kan kwantitatieve evaluatie van verschillende aspecten van de stuurman bewaken gedrag, met inbegrip van het vastleggen van pogingen door mannetjes en zwemmen traject van stuurman bewaken paren. Hoewel deze methoden werden oorspronkelijk vastgesteld voor ethologische studies over Tigriopus, met de juiste wijzigingen ze kunnen ook worden toegepast op studies van andere zoöplankton in verschillende onderzoeksgebieden, zoals fysiologie, toxicologie, en ecologische genetica.
Introduction
Intertidal roeipootkreeften van het geslacht Tigriopus worden op grote schaal verspreid in rotsachtige hoge intertidal zwembaden over verschillende continenten1. Deze roeipootkreeften stuurman bewaken gedrag vertonen als onderdeel van hun voortplanting, waar een volwassen man een potentiële partner (jonge of volwassen vangt) met behulp van haar verslaafd eerste antennes voorafgaand aan de copulatie (Figuur 1 en Figuur 2)2 ,3,4,5. Hoewel dit verschijnsel een onderwerp van ethologische en biochemische studies voor decennia2,3,6,7, gedetailleerde procedures voor onderzoek naar dit probleem geweest, met inbegrip van individuele cultuur van virgin dieren en criteria van gedrags gebeurtenissen gezien in een poging van stuurman bewaken, zijn niet goed beschreven. Dus, stellen we hier methoden ter bestudering van het gedrag onder een gecontroleerde experimentele omgeving mogelijk maken.
Individuele kweken en opvoering van dieren
Eerdere studies van reproductie van de Tigriopus dienst conventioneel een paar loskoppelen van de methode ter voorbereiding van jonge exemplaren (copepodids) en volwassen vrouwtjes op gedrags proeven en experimenten3,8,9 fokken ,10. Deze methode maakt echter dieren formulier paren en potentieel copuleren voorafgaand aan tests (besproken in Ito 198811), die gedrags eigenschappen van dieren5 veranderen kunnen. Daarnaast is er ook een potentieel om het miskennen van de ontwikkelingsstadia van roeipootkreeften met de conventionele protocollen zoals ze op zichtbare lichaamsgrootte voor staging vertrouwen. In deze paper beschrijven we een individuele kweken methode die wordt gebruikt in onze recente studie met Tigriopus californicus5, die werd ontworpen om het aanpakken van deze beperkingen door controle pairing ervaring van dieren en het bijhouden van hun ontwikkeling van copepodid tot volwassen stadia.
Kwantitatieve analyse van stuurman bewaken gedrag
De stuurman bewaken gedrag Tigriopus soorten is onderzocht, niet alleen op het gebied van ethologie2,6 , maar ook op andere gebieden zoals ecotoxicologie en evolutionaire genetica3,4, 7 , 8 , 9 , 10. echter de vorige studies hebben uitgelegd de loop van dit gedrag vooral in geschreven formulieren zonder voldoende visuele illustraties te schetsen van zowel het gedrag en de methoden om te studeren, waardoor de technische belemmeringen voor de replicatie en vooruitgang van de studies. Wij bieden hier, gedetailleerde beschrijvingen van een aantal van de belangrijkste gebeurtenissen in de stuurman bewaken gedrag van Tigriopus roeipootkreeften ondersteund door beeldmateriaal. We tonen ook aan apparatuur en methoden voor de kwantitatieve analyse van het gedrag. Deze methoden toestaan evaluatie van gedrags eigenschappen van dieren tijdens stuurman-bewaken pogingen in juist gerepliceerde experimenten.
Met deze methoden streven we naar een methodologische basis van gecontroleerde en reproduceerbare studies op de stuurman bewaken gedrag van het geslacht Tigriopus.
Protocol
1. bereiding van Virgin dieren gedrags observatie
- Verkrijgen van bevruchte eieren en laten uitkomen.
- Verzamelen gravid vrouwtjes voeren duidelijk oranje (dat wil zeggen, bevruchte en in geavanceerde stadia van ontwikkeling) eieren (Figuur 3 c) van een voorraadculturen met een pipet van Pasteur. Spoel de vrouwtjes door zachtjes pipetteren hen in schone kweekmedium om overdracht van andere dieren, met inbegrip van de nauplial larven die uitgebroed kunnen hebben in de cultuur te vermijden.
Opmerking: In dit protocol, kunstmatig zeewater met een zoutgehalte van 35% wordt gebruikt als kweekmedium. Gebruik ander medium (bijvoorbeeld kunstmatige zeewater met een hoger zoutgehalte of een extra opgeloste stof) afhankelijk van het doel van een experiment.
Opmerking: Zie Barreto et al. 201512 voor een methode voor vestiging laboratorium cultuur voorraden en Pereira et al. 201613 voor voorbeelden van collectie sites van natuurlijke populaties van T. californicus. Peterson et al. rapporteerde ook hun sites van de collectie van T. californicus, T. fulvusen T. japonicus met lengte- en breedtegraad informatie9. Gebruik plastic pipetten met een capaciteit van ongeveer 30-50 mL voor het verzamelen van Tigriopus roeipootkreeften van rots zwembaden. - Plaats elke vrouw individueel in een put van een 6-well cel cultuur plaat met schone kweekmedium (Figuur 4, links). Zorg ervoor dat geen andere dieren (met inbegrip van nauplial larve) is de verontreiniging van de put.
- Het handhaven van de platen in een incubator ingesteld bij 20 ° C met een 12-uurs licht-donker cyclus op de cultuur van de vrouwtjes totdat ze ei blaasjes vrijgeven. Deze stap duurt over het algemeen één tot tien dagen afhankelijk van soort en ontwikkelingsstadia van embryo's. Ondertussen, het voeden van elke gravid vrouw tweemaal per week met twee korrels van fijn grond (ongeveer < 0,5 mm diameter) vis eten (Zie Tabel van materialen voor details).
Opmerking: Gebruik verschillende temperaturen en lichte cycli afhankelijk van het doel van een experiment. Hogere temperaturen kunnen het vergemakkelijken van een snellere ontwikkeling van de embryo's.
Opmerking: Voorkomen dat overtollig voedsel rottend in putten. Als voedsel puin begint te verval, Pipetteer uit putten met een pipet van Pasteur. - Nadat het ei blaasjes zijn vrijgegeven, verwijdert u de vrouwtjes uit de cultuur putjes met een pipet van Pasteur.
Opmerking: Geïnsemineerd vrouwtjes zijn geschikt voor het kuitschieten meerdere klauwen van nakomelingen2,3. Indien nodig, breng de vrouwtjes in andere putten voor het verzamelen van verdere klauwen.
- Verzamelen gravid vrouwtjes voeren duidelijk oranje (dat wil zeggen, bevruchte en in geavanceerde stadia van ontwikkeling) eieren (Figuur 3 c) van een voorraadculturen met een pipet van Pasteur. Spoel de vrouwtjes door zachtjes pipetteren hen in schone kweekmedium om overdracht van andere dieren, met inbegrip van de nauplial larven die uitgebroed kunnen hebben in de cultuur te vermijden.
- Verzamelen copepodids voor individuele cultuur.
- Houd de platen met gearceerde naupliën in de incubator en cultuur van de naupliën totdat ze tot de eerste fase van de copepodid (CI) (Figuur 4, Midden ontwikkelen). Deze stap duurt doorgaans van één tot twee weken. Voer elk goed met verschillende korrels van de fijn gemalen vis eten tijdens het zoeken naar CI dieren eens in de twee dagen. Het bijvullen van verdampt steigerend water met gedestilleerd water.
Opmerking: Als zwevend puin de weergave belemmert, scheren met een klein stukje keukenrol. - Zodra CI dieren beginnen te ontstaan, ze verzamelen uit de putjes met een P-10 micropipet met haar pipetting volumeset op ongeveer 8 µL, onder een stereomicroscoop op 10 X tot 40 X vergroting (Figuur 4, rechts). Wassen van elke CI dier waarbij het zachtjes in schone kunstmatig zeewater en plaats deze in een put van 24-well cel cultuur plaat met 2-3 mm diepte (ongeveer 400-600 µL) met kunstmatig zeewater.
Opmerking: Vermijd over nauplial exuviae of andere dieren in de putten voor individuele cultuur te dragen.
- Houd de platen met gearceerde naupliën in de incubator en cultuur van de naupliën totdat ze tot de eerste fase van de copepodid (CI) (Figuur 4, Midden ontwikkelen). Deze stap duurt doorgaans van één tot twee weken. Voer elk goed met verschillende korrels van de fijn gemalen vis eten tijdens het zoeken naar CI dieren eens in de twee dagen. Het bijvullen van verdampt steigerend water met gedestilleerd water.
- Ontwikkeling van de personen bijhouden door het tellen van molted exuviae.
- Onderzoeken binnenkant van elk putje voor molted exuviae elke twee tot drie dagen (pas frequentie indien nodig) door stereomicroscopic observatie onder een donker-veld verlichting op 10 X tot 40 X vergroting. Exuviae van copepodids zijn transparant en herkenbaar met haren benen, een paar caudal rami (dat wil zeggen, dunne structuren caudal eind uitsteekt), en/of segmentatie van de prosome en urosome (Figuur 5). Focus en verlichting te detecteren exuviae op verschillende diepten in een goed (figuur 6A) wijzigen.
Opmerking: Molted exuviae zijn kleiner dan het dier dat hen heeft molted. Start onderzoek van lagere vergroting voor een dier, zijn relatief recente exuviae en een verschuiving naar hogere vergroting voor oudere (dat wil zeggen, kleinere) exuviae.
Opmerking: Als exuviae in een put zijn beschadigd, elimineren de put van verdere developmental bijhouden om te voorkomen dat de miskenning van de ontwikkelingsstadia.
Opmerking: Als zwevend puin belemmert de weergave (figuur 6B), scheren met een klein stukje keukenrol. - Het opnemen van een totaal aantal van copepodid exuviae in elk putje met een merk tally op het deksel van de plaat (Figuur 7). Voeg een regel aan het merk een nieuw exuviae is gevonden in de put.
Opmerking: Als er nauplial exuviae besmet in de put, te elimineren van de graaf. - Elk individu voeden met twee korrels van de fijn gemalen vis eten. Het bijvullen van verdampt steigerend water met gedestilleerd water tot het handhaven van het zoutgehalte.
Opmerking: Feed copepodids elke twee of drie dagen om te voorkomen dat ze consumeren en schadelijk molted exuviae, die potentieel schatting van ontwikkelingsstadium (stap 1.3.4 beïnvloeden kunnen). - Schatten ontwikkelingsstadium van het dier op basis van het nummer van de exuviae. Als er geen exuviae, wordt het individu geschat op CI stadium. Als er één tot vier exuviae, wordt het individu geschat op bij CII CV stadia. Als er vijf exuviae, wordt het individu geschat op een volwassene.
- Onderzoeken binnenkant van elk putje voor molted exuviae elke twee tot drie dagen (pas frequentie indien nodig) door stereomicroscopic observatie onder een donker-veld verlichting op 10 X tot 40 X vergroting. Exuviae van copepodids zijn transparant en herkenbaar met haren benen, een paar caudal rami (dat wil zeggen, dunne structuren caudal eind uitsteekt), en/of segmentatie van de prosome en urosome (Figuur 5). Focus en verlichting te detecteren exuviae op verschillende diepten in een goed (figuur 6A) wijzigen.
- Identificeren van geslacht van volwassenen op basis van morfologie.
- Geslacht dieren door het onderzoeken van hun morfologie. Volwassen Tigriopus mannetjes bezitten geniculate eerste antennes met verslaafd en bolvormige structuren aan het distale einde (figuur 3A). Volwassen vrouwtjes bezitten soepeler en relatief dunner eerste antennes (figuur 3B) dan die van mannen. Sommige vrouwtjes vertonen ook donkergroen van gonadale lipide in hun lichaam (figuur 3B, 3D).
- Markeer het geslacht op het deksel van de put (figuur 7B).
2. gedrags Test- en Video-opname van stuurman bewaken gedrag
- Selecteer dieren van gewenste fase en seks voor een gedrags test op een test dag.
- De geselecteerde personen in cultuur wells voeden met fijn grond visvoer en laten eten gedurende 30 minuten. Ondertussen gaan stap 2.1.2 ter voorbereiding van testen kamers.
- Bereiden van twee platen van 48-well platte onderste cel cultuur als testen kamers; ene plaat (hierna genoemd "plaat A") is voor mannen en de andere ("plaat B") is voor de doelstellingen (bv copepodids, volwassen vrouwtjes, volwassen mannetjes). Voeg 400 µL van schone kunstmatig zeewater met een zoutgehalte van 35% in putjes van de platen. Plaats de platen op een LED licht pad bedekt met een doorzichtige acryl board als een lichte diffuser (Figuur 8).
Opmerking: Gebruik een ander medium afhankelijk van een doel van een experiment.
Opmerking: Om te voorkomen dat overtollige warmte, gebruik geen gloeilampen of TL lampen als een achtergrondverlichting. - Spoel na de 30-min voedertijd in 2.1.1 beschreven, elk dier waarbij het zachtjes in een opeenvolging van vier putjes van de plaat van een 24-well gevuld met schoon kunstmatig zeewater (Figuur 9) ter voorkoming van de overdracht van puin en exuviae cultuur putjes eveneens.
- Plaats de gespoeld individuen in de putten van de platen A en B op de LED licht pad. Laat 30 minuten voor aanpassing van de dieren in de putjes.
- Stel een video camera boven plaat A gedurende de aanpassingsperiode (Figuur 8). Gebruik een statief of een stand te houden van de camera.
- De camera richten op de mannetjes binnenkant plaat A om een waarneming van antennes.
Opmerking: Verklein de flikkering van de achtergrondverlichting in films en een framesnelheid die gelijk is aan of de helft van een elektrische frequentie instellen en gebruiken van een langere belichtingstijd. Houd ook de LED licht pad bedekt met een doorzichtige acryl board zoals beschreven in stap 2.1.2.
- Start na de aanpassingsperiode beschreven in stap 2.1.4, video-opname en de gedrags test.
- Overbrengen in de doelstellingen van de plaat B plaat A met een pipet van Pasteur. Als het experiment gevoelig voor chemische componenten in medium is, pipetten voor elk testen paar wijzigen
Opmerking: Wanneer een dier uit plaat B pipetteren, niet jagen in het water met een pipet van Pasteur als water verstoring kan het dier stimuleren en uitlokken van zijn overtollige beweging. Houd een uiteinde van de pipet iets boven het wateroppervlak en wachten voor het individu te komen onder het puntje. Pipetteer het zachtjes omhoog met een kleine hoeveelheid kunstmatige zeewater en vervolgens eject naar het in een putje op plaat A. - Volgens een proefopzet, toestaan een mannetje en een doelstelling voor de interactie in elk putje voor een gewenste periode van observatie tijd (bijvoorbeeld 10 minuten) na de overdracht.
- Video opname stoppen na de tijd van de waarneming. Indien nodig, de opgenomen films downloaden vanaf de camera naar een computer.
- Overbrengen in de doelstellingen van de plaat B plaat A met een pipet van Pasteur. Als het experiment gevoelig voor chemische componenten in medium is, pipetten voor elk testen paar wijzigen
3. Handmatige analyse van gedrags eigenschappen
- Onderzoeken van de film voor de timing wanneer elke doelstelling werd overgedragen in de put op plaat A.
- Inleiding en beëindiging timing van gebeurtenissen van belang bestuderen en bereken latency, duur en frequentie van de gebeurtenissen.
- Inleiding van bewaking poging door een mannetje definiëren als een contactpersoon van het mannetje de antenne met elk lichaamsdeel van de doelgroep (Figuur 10, links boven). De antennal contactpersoon wordt vaak voorafgegaan door een swift (< 0,5 s) jagen of pounce.
- Definieer beëindiging van bewaking poging als een punt wanneer beide antennes van het mannetje van het lichaam van een doel (Figuur 10, rechtsboven losmaken). Bereken de frequentie van het bewaken van pogingen als:
- Inleiding van copulatie definiëren door een bocht van de dorsale lichaam van een man die wordt gevolgd door een herhaalde druk op een urosome tegen die van het vrouwtje (Figuur 10, rechts onderaan). Frequentie van de push is meerdere malen per seconde.
Opmerking: Een bewaking man kruipt naar het caudal einde van een vrouw lichaam voorafgaand aan de copulatie (Figuur 10, linksonder). - Beëindiging van de copulatie definiëren door detachement van de urosomes na de gebeurtenissen in 3.2.4 beschreven.
Opmerking: Copulatie duurt doorgaans plaats gedurende enkele minuten in het geval van T. californicus en T. japonicus.
4. tweedimensionale Tracking van individuen en paren
- Het genereren van een videoclip met een aflevering van belang (bijvoorbeeld de eerste 3 s van een bewaking poging) door te korten op de film opgenomen in stap 2 met film editing software.
- Installeren van ImageJ14 uit: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Download dan MTrackJ, een motion-tracking plugin voor ImageJ15, door instructies te volgen op: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- ImageJ openen en importeren van een film van belang (bijvoorbeeld bestand > importeren > met behulp van QuickTime; "Convert 8-bits grijstinten" wilt verminderen opslageenheid vereiste voor beeldverwerking).
- Ruimtelijke en tijd kalibratie uit te voeren.
- Selecteer het gereedschap rechte lijn selecteren in het venster ImageJ voor ruimtelijke kalibratie.
- Teken een selectie lijn langs een object met een bekende lengte (bijv . de diameter van een goed) in het venster film.
- Open het menu "Instellen schaal" (Analyze > schaal instellen). Voer de bekende lengte in het vak "Bekend afstand" en zijn eenheid (bijvoorbeeld mm) in het vak "Eenheid van lengte". Klik op de "Global" checkbox voor het gebruik van de schaal voor andere videoclips.
- Open het menu "Properties" (afbeelding > Eigenschappen) voor het kalibreren van de tijd. Frame interval (reciproke van de framerate) invoeren in het vak "Frame interval".
- Tracering configureren met MTrackJ.
- Open de MTrackJ plugin van Plugins > MtrackJ op ImageJ. Klik op de knop "Tracking" in het MTrackJ-dialoogvenster te openen een tracking configuratiemenu.
- Een tracking-interval instellen door te controleren "Verplaats naar volgende tijd index na het toevoegen van punt" en een nummer in te voeren in "Tijd stap grootte" vak in het venster van het dialoogvenster Configuratie. Voor het uitvoeren van frame-voor-frame bijhouden, voer "1" in het vak "Tijd stap grootte".
- Check "Toepassen lokale cursor uitlijnen tijdens tracking" en kies "Donkere centroid" als een functie van de module. Met deze optie kunt een automatische detectie van het zwaartepunt van een donkere-object (dat wil zeggen, een individu of een paar) binnen een vierkante detectie ("module bereik") rond een cursor. Kies een grootte van het plein ter dekking van een hele pair of het dier in de film (bijvoorbeeld 31 x 31 pixels).
- Klik op "OK" om te passen de gekozen opties.
- Uitvoeren van tweedimensionale bijhouden.
- Klik op de knop "Toevoegen" in het MTrackJ-dialoogvenster venster om te beginnen met het bijhouden.
- Plaatst een cursor (detectie plein) ter dekking van een paar of een individu worden bijgehouden. Klik om dit te detecteren de donkere zwaartepunt van het object in het vierkant.
- Herhaal stap 4.6.2 voor een gewenste aantal frames.
- Voor het genereren van gegevenstabellen, klikt u op "Maatregel" knop in het dialoogvenster MTrackJ. De gegevens in twee vensters worden weergegeven: "MTrackJ: Tracks" venster bevat een overzicht van de bijgehouden tweedimensionale traject en "MTrackJ: Points" toont gedetailleerde gegevens voor elk punt van de tijd. Sla elke tabel, kies Bestand > opslaan als... menu op ImageJ.
Opmerking: Raadpleeg de online handleiding geleverd door de ontwikkelaar (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) voor een beschrijving van elke kolom met gegevens. - Voor het genereren van een film met een bijgehouden traject getekend als een gekleurde lijn, klikt u op de "Movie" knop in het dialoogvenster MTrackJ. Sla de gegenereerde film, kies Bestand > opslaan als... menu op ImageJ.
- Sla het gehele resultaat. Klik op de "Save" knop in het dialoogvenster MTrackJ opslaan van de resultaten met inbegrip van de gegevens (stap 4.6.4) en het bijgehouden tweedimensionale traject (stappen 4.6.2 en 4.6.3).
Representative Results
De individuele kweken in stap 1 beschreven methode kunt voorbereiding en de enscenering van virgin dieren zonder voorafgaande ervaring met het in paren rangschikken.
De gedrags test beschreven in stap 2 kunt video-opname en observatie van de stuurman bewaken gedrag van Tigriopus roeipootkreeften. Het volgende onderzoek van de video-opnamen met de methoden beschreven in stap 3 en 4 maakt een kwantitatieve analyse van verschillende aspecten van het gedrag dat is afgebeeld in Figuur 1.
Figuur 11 ziet u een verschil in de gemiddelde duur van het bewaken van pogingen tussen paren van man-vrouw- en man-man paren van T. californicus. Een handmatige analyse aangetoond dat man-man paren toonde relatief kortere duur dan mannetje-vrouwtje paren koppelen.
Voorbeelden gevaar opleverende bijgehouden met de analysemethode worden gepresenteerd in Figuur 12 en een representatief resultaat van de analyse van de snelheid is afgebeeld in Figuur 13. Tweedimensionale ruimtelijke tracking van de nieuw gevormde bewaking paren van T. californicus bleek dat de man-man paren neiging om hogere snelheid dan mannetje-vrouwtje paren vertonen de eerste 3 albums van pogingen bewaken.
Figuur 1: Stuurman bewaken gedrag in Tigriopus. (A) een volwassen mannetje omklemde een minderjarige (copepodid) met de eerste antennes (aangegeven door blauwe pijlen). Bar = 1 mm. (B) een overzicht van stuurman bewaken gedrag. Een man probeert te vangen een doel individu (links) en vormt een paar met het (midden). In man-man paren en sommige paren van man-vrouw beëindigt een bewaking poging zonder de copulatie. Dit cijfer is gewijzigd van Tsuboko-Ishii en Burton 20175. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Ontwikkelingsstadia van Tigriopus. Tigriopus soorten ondergaan in het algemeen zes nauplius fasen (vanaf NI aan NVI), vijf stadia van de copepodid (van het CI CV) en een volwassen stadium (CVI)16. Mannetjes maken bewaking pogingen voor jeugdigen vanaf een vroeg stadium van copepodids (CI in T. japonicus en T. fulvus6,17 ) en CII in T. californicus3, alsmede voor volwassenen van beide geslachten5 . Dit cijfer is gewijzigd van Tsuboko-Ishii en Burton 20175. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Morfologie van volwassenen (T. californicus). (A) volwassen mannetje. (B) volwassen vrouwtje. (C) Gravid volwassen vrouwtje met een ei-sac met bevruchte en ontwikkelde (duidelijk oranje) eieren. (D) Gravid volwassen vrouwtje met een ei-sac met onbevruchte of onontwikkelde (donkergroen) eieren. Pijlen geven aan ei blaasjes. Bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: overzicht van de voorbereidingen voor de individuele cultuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Molted exuviae. (A) Exuviae van CI CV stadia van een enkel dier van T. californicus. Bar = 1 mm. (B) Exuviae van CI aan CV stadia van een individuele cultuur goed. Witte puin is uitwerpselen van een dier gekweekt in de put (niet weergegeven in de afbeelding). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: zoeken naar exuviae onder een stereomicroscoop. Bars = 1 mm. (A) Focal verandering van een stereomicroscoop voor detectie van exuviae op verschillende diepten. Magenta pijlen geven gerichte exuviae en grijze pijlen geven ongericht exuviae. Afbeelding bovenz─│de richt zich op de linker exuviae, die is verzonken op de bodem van de put. Afbeelding onderz─│de richt zich op de juiste exuviae, die onder de middelgrote oppervlakte zweeft. (B) bovenste afbeelding toont een voorbeeld van obstructie van onderzoek door puin drijvend op de middellange oppervlak. Een groene pijl geeft een exuviae verborgen onder het puin. Afbeelding onderz─│de toont een resultaat van oppervlaktereiniging met een klein stukje keukenrol. Een exuviae (aangegeven door een groene pijl) is zichtbaar na het schoonmaken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: tijdelijke en van dieren sexing. Voorbeelden van het merk exuviae aantal en geslacht van de dieren op een deksel van een plaat van de cultuur. (A) een voorbeeld van een goed met vijf exuviae en een volwassen dier. Het getal van de lijnen in het merk tally op het deksel staat het nummer van de exuviae gevonden in de put. Wanneer het aantal exuviae vijf bereikt, het geslacht van het dier kan worden bepaald op basis van antennes morfologie (Zie ook Figuur 3). (B) een voorbeeld van een gemarkeerde deksel van een plaat van de cultuur. Bovenste rijen bevatten oudere (CIV tot volwassene) dieren en onderste rijen jongere (dat wil zeggen, nieuw verzamelde) dieren (CI CIII). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Behavioral onderzoeksmethode. Setup voor video-opname van stuurman bewaken gedrag (links) en een overzicht van gedrags test (rechts). Dit cijfer is gewijzigd van Tsuboko-Ishii en Burton 20175. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: Rinse van dieren vóór een gedrags test Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: definitie van gebeurtenissen in de handmatige analyse onderzocht. Voorbeelden van gebeurtenissen die zijn waargenomen met betrekking tot stuurman-bewaken poging. Namen van de gebeurtenissen gedefinieerd en geanalyseerd in stap 3 worden aangegeven. Gebeurtenissen die zijn ingesloten in een gestippelde lijn kunnen niet worden waargenomen in enkele pogingen van stuurman bewaken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11: Verschil in duur tussen paren van man-vrouw- en man-man paren van T. californicusbewaken. Elke driehoek symbool staat voor gegevens van een geteste paar. Bars en snorharen vertegenwoordigen respectievelijk medianen en interkwartielafstand. Gemiddelde duur van de opname was groter voor man-vrouw pairs (man-vrouw (n = 22), man-man (n = 29); **p < 0.01 door Mann-Whitney U test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 12: trajecten voor paren in de eerste drie seconden van het bewaken van pogingen. Voorbeelden van bijgehouden tweedimensionale trajecten van man-vrouw pairs (links) en man-man paren (rechts) van T. californicus. Puntjes op de trajecten vertegenwoordigen tijd punten (30 kaders per seconde). Bars = 10 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 13: Verschil in gemiddelde snelheid na de inleiding van het bewaken tussen paren van man-vrouw- en man-man paren van T. californicus. Elke driehoek symbool staat voor gegevens van een geteste paar. Bars en snorharen vertegenwoordigen respectievelijk medianen en interkwartielafstand. Gemiddelde snelheid van het paar in de eerste 3 albums van bewaken pogingen was groter voor man-man paren (man-vrouw (n = 13), man-man (n = 35). ***p < 0.001 door Mann-Whitney U test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: Effect van behandeling spoelen op gedrag van Tigriopus. Elke cirkel of een driehoek symbool staat voor gegevens van een geteste persoon of paar. Bars en snorharen vertegenwoordigen respectievelijk medianen en interkwartielafstand. Personen in "gespoeld" en "niet gespoeld" groepen werden behandeld op dezelfde wijze, behalve dat de groep "niet gespoeld" geen de spoeldouche behandeling (stap 2.1.3) vóór de tijd van 30 minuten aanpassing (stap 2.1.4 ondervonden). (A) de gemiddelde snelheid van gespoeld mannetjes neiging groter dan die van niet gespoeld mannetjes (gespoeld (n = 6), niet gespoeld (n = 6), n.s.: geen significant verschil werd ontdekt door Mann-Whitney U testen). De snelheid werd gemeten voor 30 s gebaseerd op video's opgenomen na de tijd van de aanpassing. (B) de gemiddelde snelheid van gespoeld vrouwtjes neiging groter dan die van niet gespoeld vrouwtjes (gespoeld (n = 6), niet gespoeld (n = 6), n.s.: geen significant verschil werd ontdekt door Mann-Whitney U testen). De snelheid werd gemeten voor 30 s gebaseerd op video's opgenomen na de aanpassing tijd, volgende stap 4 (volgen van interval = 0,5 s). (C) frequentie van het bewaken van pogingen was groter voor paren van gespoeld individuen (gespoeld (n = 6), niet gespoeld (n = 6). ** p < 0.01 door Mann-Whitney U test). (D) duur van het bewaken van pogingen de neiging groter voor paren van gespoeld individuen (gespoeld (n = 6), niet gespoeld (n = 6), n.s.: geen significant verschil werd ontdekt door Mann-Whitney U testen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Individuele kweken en vastberadenheid van fase en seks
We beschreven hier gebruikte methode in onze vorige studie5 voor het bereiden van maagdelijke Tigriopus dieren met hun pairing ervaring gecontroleerd terwijl het bijhouden van hun ontwikkeling (Figuur 4 en Figuur 7). Zoals Tigriopus soorten worden gebruikt als model dieren op verschillende biologische gebieden als toxicologie16,18, ecologische fysiologie19,20,21, en evolutionaire genetica13,22,23,24, deze methode heeft een potentieel om een waardevolle middelen ter beoordeling van invloed van milieu- en genetische factoren op de levenscyclus van deze roeipootkreeften.
Om succesvolle enscenering, regelmatige onderzoek en verzameling van CI is copepodids van een massacultuur (stap 1.2) essentieel, aangezien collectie in latere stadia in verkeerde enscenering van de dieren resulteren kan. Bovendien, is een uitgebreide zoektocht voor exuviae (stap 1.3) ook essentieel voor nauwkeurige enscenering. De frequentie van de collectie en de enscenering indien nodig, zoals het interval tussen molts van één tot meerdere dagen afhankelijk van soort varieert en het grootbrengen van voorwaarde2,25,26te verhogen. Verschillen in morfologie van de antennes tussen copepodids en volwassen vrouwtjes zijn niet zichtbaar significant in sommige soorten en populaties van Tigriopus16,25. Vandaar, klaarzetten voordat sexing is nuttig om te onderscheiden van volwassen vrouwtjes van geavanceerde copepodids van beide geslachten.
Gedrags tests en handmatige analyse van gedrags eigenschappen
In het algemeen, is een van de meest kritieke onderdelen van ethologische studies definitie en beschrijving van de gebeurtenissen van belang. De methoden die in dit document ingevoerd werden eerst ontwikkeld voor onze recente studie5 en aangevuld met de beschrijving van coïtus en de visuele hulpmiddelen (Figuur 10). Naast dat, speelt consistentie in dierlijke behandeling ook een belangrijke rol in behavioral experimenten. Bijvoorbeeld, spoelen van roeipootkreeften potentieel, sommige aspecten van hun gedrag (aanvullende figuur 1) kan vergemakkelijken en daarom is het wenselijk te worden uitgevoerd op een consistente wijze onder monsters, zoals in stap 2.1.3 gestandaardiseerd. Wij verwachten dat de materialen verstrekt in dit document zal helpen gecontroleerde en reproduceerbare studies over de stuurman bewaken gedrag van Tigriopus, bevordering van reproductieve en ecologische studies van deze overvloedige inwoner van hoog tij zwembaden.
Een mogelijke beperking met deze methode is de lage vergroting van verkregen beelden. Hoewel films opgenomen met ons systeem toestaan identificatie van prominente lichaam structuren met inbegrip van urosomes en mannelijke eerste antennes, mei een niet zitten kundig voor meer subtiele structuren zoals benen en genitaliën observeren met onze methode, omdat het niet doet dienst microscopische vergroting voor video-opname. Terwijl Kelly et al. rapporteerde dat zij konden observeren Spermatofoor overbrengen van mannetjes naar vrouwtjes van T. japonicus onder een microscopische observatie op 100 X vergroting (geen video opgenomen)7, we zijn niet geweest kundig voor observeren een Spermatofoor in onze films, misschien als gevolg van de beperking van de resolutie van de afbeelding.
Tweedimensionale bijhouden van paren
Hoewel deze methode kan geen driedimensionale bijhouden van dieren, maakt het een twee-dimensionale traject analyse van zoöplankton zonder chemisch labeling dieren (cf. Reuzel et al. 201027) door gebruik te maken van programma's voor gratis verspreid. Als de grootte van een filmbestand te groot om te worden verwerkt in ImageJ is, kan men verminderen van de resolutie van het bestand en het omzetten van een grijs schaal film. Terwijl de beschreven methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor volwassen paren van T. californicus (Figuur 12 en Figuur 13), is het ook beschikbaar voor volwassen-juveniele pairs en enkele personen (aanvullende figuur-1) alsmede andere soorten Tigriopus in principe. Verder verwachten wij dat de methode te zijn van toepassing op korte termijn (van de milliseconde naar de tweede tijd schalen) traject analyse van zoöplankton van andere taxa met eventueel benodigde aanpassingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Sumitomo Foundation, Japan (subsidie voor Basic projecten van de wetenschap-onderzoek, verlenen nummer: 150932) en onderzoek instituut van mariene ongewervelden, Japan (2018 individuele onderzoeksbeurs) STI RSB en een subsidie uit de VS National Science Foundation (DEB-1556466) aan de RSB. Wij danken mevrouw Kiana Michelle Woodward voor feedback over het kweken en tijdelijke methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
