Summary
친구를 지키는 행동 속 Tigriopus의 조간 copepods의 재생산에 중요 한 역할을 한다. 그러나,이 행동 공부 방법을 잘 설명 되지 않았습니다. 여기 우리는 방법에 대 한 설명: 처녀 Tigriopus 동물, 그리고 그들의 동료를 지키는 행동의 정량 분석 2)의 1) 개별 문화.
Abstract
록 키 조 수 웅덩이에 일반적인 동물성 플 랭크 톤, Tigriopus, 속의 copepods 남성 한 쌍을 형성 하는 잠재적인 친구를 잠금 precopulatory 친구 지키고 동작 표시. 이 현상을 연구자의 관심을 모으고 있다, 그러나 그것의 분석에 대 한 방법을 잘 설명 되지 않았습니다. 여기 우리는 절차에 대 한 설명: 1) 개별 경작 하 고 Tigriopus 청소년 및 성인, 및 그들의 동료를 지키는 행동의 2) 비디오 기반 분석의 준비. 자란 방법 실험 제어를 경험 행동 테스트 하기 전에 그들의 발달을 추적 하는 능력 뿐 아니라 동물의 껍질 벗기기 수 있습니다. 분석 방법은 친구를 지키는 행동, 남성에 의해 시도 캡처하고 수영 친구 지키고 쌍의 궤적 등의 여러 측면의 정량적 평가 있습니다. 이러한 메서드는 ethological 연구 Tigriopus에 원래 설립 되었다, 하지만 적절 한 수정 그들은 또한에 적용할 수 있는 다른 동물성 플 랭크 톤 생리학, 독물학, 같은 다른 연구 분야의 연구 및 생태 유전학입니다.
Introduction
속 Tigriopus 의 조간 copepods1여러 대륙 걸쳐 바위 높은 조간 풀에 널리 배포 됩니다. 그들의 재생산, 성인 남성 (청소년 또는 성인) 잠재적인 친구를 캡처의 일환으로 동료를 지키는 행동을 전시 하는 이러한 copepods 결합(그림 1 및 그림 2) 전에 그것의 구부려 진된 첫 번째 안테나를 이용 하 여2 ,3,,45. 이 현상은 수십 년2,3,6,7,이 행동의 연구에 대 한 자세한 절차에 대 한 ethological 그리고 생화학 연구의 대상이 되었습니다 비록 포함 처녀 동물의 개별 문화와 행동 이벤트 친구 지키는 시도의 기준을 잘 설명 되지이 않았습니다. 따라서, 여기 우리가 제어 실험 환경에서 동작의 연구를 활성화 하는 방법을 설정 합니다.
개별 경작 및 동물의 준비
Tigriopus 의 재생산의 이전 연구는 전통적으로 분리 행동 테스트에 대 한 청소년 (copepodids) 및 성인 여성을 준비 하는 방법 및 실험3,8,9 번 식 쌍 고용 ,10. 그러나,이 메서드는 잠재적으로 양식 쌍 동물을 하 고 다음으로 동물5의 행동 속성을 변경할 수 있습니다 (이토 198811에서 설명), 테스트 이전 교 수 있습니다. 또한, 준비에 대 한 명백한 신체 크기에 의존 하는 그들은 기존의 프로토콜 copepods의 발달 단계를 잘못 판단 하는 가능성도 있다. 이 문서에서 설명 하는 Tigriopus californicus5, 동물의 페어링 경험을 통제 하 고 그들의 발달을 추적 하 여 이러한 한계를 해결 하기 위해 설계 되었습니다 우리의 최근의 연구에 사용 되는 개별 자란 방법 성인 단계를 copepodid.
친구를 지키는 행동의 정량 분석
진화 유전학3,4, ecotoxicology 등 다른 분야에서 뿐만 아니라 인 성 학2,6 의 분야에서 뿐만 아니라 Tigriopus 의 동료를 지키는 행동 공부 하고있다 7 , 8 , 9 , 그러나 10. 연구 충분 한 시각적 삽화 동작와, 그것을 연구 하는 방법에 대 한 기술적인 장애물을 만드는 없이 양식을 작성 주로이 행동의 과정을 설명 했다,는 복제 및 연구의 발전 여기, 우리 Tigriopus copepods 시각적 자료에 의해 지원의 친구 지키고 동작의 키 이벤트의 일부에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 또한 장비와 행동의 정량 분석을 위한 방법을 설명합니다. 이러한 메서드는 정확 하 게 복제 실험에 친구를 지키는 시도 하는 동안 동물의 행동 속성의 평가 수 있습니다.
이러한 방법으로 우리 속 Tigriopus의 동료를 지키는 행동에 제어 및 재현성 연구의 방법론적 기초를 제공 하고자 합니다.
Protocol
1. 처녀 동물 행동 관찰에 대 한 준비
- 수정 된 난 자 취득 하 고 부 화 하도록 허용.
- 파스퇴르 피 펫 주식 문화에서 분명 오렌지 (즉, 수정 및 개발의 고급 단계) 계란 (그림 3C)을 들고 벗 여성을 수집 합니다. 부드럽게 문화에 부 화 할 수 있습니다 nauplial 애벌레를 포함 한 다른 동물의 양도 피하기 위해 깨끗 한 문화 매체에 pipetting으로 암컷을 씻어.
참고:이 프로토콜에 35%의 염 분을 함께 인공 해 수 문화 매체로 사용 됩니다. 실험의 목적에 따라 다른 매체 (예: 인공 해 수는 높은 염 분 또는 추가 용액)을 사용 합니다.
주: Barreto 외. 201512 실험실 문화 주식의 설립에 대 한 방법 및 페 레이 라 외. 201613 T. californicus의 자연 인구의 컬렉션 사이트의 예를 참조 하십시오. 피터슨 외. 또한 위도 및 경도 정보9 T. californicus, T. fulvus및 t. 나무 의 그들의 컬렉션 사이트를 보고. 약 30-50 mL의 용량을 가진 플라스틱 펫을 사용 하 여 Tigriopus copepods 록 풀에서 수집. - 깨끗 한 문화 매체 (그림 4, 왼쪽)와 6-잘 셀 문화 접시의 우물에 개별적으로 각 여성을 배치 합니다. 어떤 다른 동물 (를 포함 하 여 nauplial 유 충) 잘 오염 되는 것을 확인 하십시오.
- 그들은 계란 낭을 발표할 때까지 여성 문화 12 시간 빛 어두운 주기와 20 ° C에서 설정 하는 인큐베이터에 접시를 유지 합니다. 이 단계는 일반적으로 종 및 태아의 발달 단계에 따라 1 ~ 10 일 걸립니다. 한편, 잘게 지상 (약 < 0.5 m m 직경에서) 물고기 음식의 두 곡물과 각 벗 여성 일주일에 두 번 피드 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조).
참고: 다른 온도 및 실험의 목적에 따라 가벼운 주기를 사용 합니다. 높은 온도 배아의 더 급속 한 발전을 용이 하 게 수 있습니다.
참고: 초과 음식 우물에서 썩 어 떠나 피하십시오. 음식 파편은 부패 하기 시작, 파스퇴르 피 펫과 우물에서 플라스틱. - 계란 낭 출시 후 파스퇴르 피 펫과 문화 우물에서 여성을 제거 합니다.
참고: 수정 여성 자손2,3의 여러 클러치를 산란 할 수 있다. 필요한 경우, 추가 클러치를 수집 하는 다른 우물에 암컷을 전송.
- 파스퇴르 피 펫 주식 문화에서 분명 오렌지 (즉, 수정 및 개발의 고급 단계) 계란 (그림 3C)을 들고 벗 여성을 수집 합니다. 부드럽게 문화에 부 화 할 수 있습니다 nauplial 애벌레를 포함 한 다른 동물의 양도 피하기 위해 깨끗 한 문화 매체에 pipetting으로 암컷을 씻어.
- Copepodids 개별 문화에 대 한 수집 합니다.
- 인큐베이터에 빗금된 nauplii와 플레이트를 유지 하 고 그들은 첫 번째 copepodid (CI) 단계 (그림 4, 중간)에 개발 될 때까지 nauplii 문화. 이 단계는 일반적으로 1 ~ 2 주 걸립니다. 잘게 땅의 여러 곡물과 잘 각 피드 한 번 매 2 일 CI 동물에 대 한 검색 하는 동안 음식 생선. 증류수와 증발된 양육 물 리필.
참고: 경우 보기를 방해 하는 부동 파편, 종이 타월의 작은 조각으로 그것을 탈지. - CI 동물 등장 하기 시작, 약 8 µ L, 10 X 40 X 확대 (그림 4, 오른쪽)에 stereomicroscope 아래에서 설정 하는 pipetting 볼륨 그들을 P-10 micropipette와 우물에서 수집 합니다. 부드럽게 깨끗 한 인공 해 수에 pipetting으로 각 CI 동물을 세척 하 고 포함 하는 인공적인 바닷물의 2-3 m m 깊이 (약 400-600 µ L) 24-잘 셀 문화 판의 우물에.
참고: nauplial exuviae 또는 개별 문화에 대 한 웰 스에 다른 동물 운반 하지 마십시오.
- 인큐베이터에 빗금된 nauplii와 플레이트를 유지 하 고 그들은 첫 번째 copepodid (CI) 단계 (그림 4, 중간)에 개발 될 때까지 nauplii 문화. 이 단계는 일반적으로 1 ~ 2 주 걸립니다. 잘게 땅의 여러 곡물과 잘 각 피드 한 번 매 2 일 CI 동물에 대 한 검색 하는 동안 음식 생선. 증류수와 증발된 양육 물 리필.
- Molted exuviae를 계산 하 여 개인의 발전을 추적 합니다.
- 10 X 40 X 확대에 어두운 필드 조명 아래 stereomicroscopic 관찰 하 여 (필요한 경우 주파수 조정) 2 ~ 3 일 마다 molted exuviae에 대 한 각 잘 내부 검사. Exuviae copepodids의 투명 하 고 곤두 다리, 꼬리 라미 (즉, 얇은 구조는 꼬리 끝에 튀어나온), prosome 및 urosome (그림 5)의 세분화의 쌍으로 인식할 수 있습니다. 집중 하 고 잘 (그림 6A)에 다른 깊이에서 exuviae를 감지 하는 조명 변경 합니다.
참고: Molted exuviae는 그들을 molted는 동물 보다 작습니다. 동물 및 비교적 최근의 exuviae 변화에 대 한 낮은 배율에서 높은 확대 이전 (즉, 더 작은) exuviae에 대 한 검사를 시작 합니다.
참고: exuviae는 잘에서 손상 된 경우 발달 단계의 오판을 피하기 위해 더 발달 추적에서 잘을 제거 합니다.
참고: 경우 부동 파편 방해 보기 (그림 6B), 종이 타월의 작은 조각으로 그것을 탈지. - 집계 표시 접시 뚜껑 (그림 7)에 각 잘에서 copepodid exuviae의 총 수를 기록 합니다. 새로운 exuviae에는 잘 발견으로 마크 한 줄을 추가 합니다.
참고: nauplial 경우 exuviae에는 잘 오염, 수에서 그들을 제거. - 잘게 땅의 두 곡물과 각 개별 피드 물고기 음식. 증류수는 염 분을 유지 하기 위해 증발된 양육 물 리필.
참고: 소비 및 개발 단계 (단계 1.3.4)의 추정에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 molted exuviae 손상에서 그들을 방지 하기 위해 2 ~ 3 일 마다 copepodids 피드. - exuviae의 수에 따라 동물의 발달 단계를 견적 한다. 아무 exuviae 경우에, 개인은 CI 단계에서 것으로 추정 됩니다. 1-4 exuviae 경우 개인은 추정 CII에 이력서 단계에. 5 exuviae 경우 개인 성인 추정.
- 10 X 40 X 확대에 어두운 필드 조명 아래 stereomicroscopic 관찰 하 여 (필요한 경우 주파수 조정) 2 ~ 3 일 마다 molted exuviae에 대 한 각 잘 내부 검사. Exuviae copepodids의 투명 하 고 곤두 다리, 꼬리 라미 (즉, 얇은 구조는 꼬리 끝에 튀어나온), prosome 및 urosome (그림 5)의 세분화의 쌍으로 인식할 수 있습니다. 집중 하 고 잘 (그림 6A)에 다른 깊이에서 exuviae를 감지 하는 조명 변경 합니다.
- 형태에 따라 성인의 섹스를 식별 합니다.
- 그들의 형태학을 검사 하 여 섹스 동물입니다. 성인 Tigriopus 남성 선단부 (그림 3A)에 걸려들 고 구형 구조와 geniculate 첫 번째 안테나를가지고 있습니다. 성인 여성은 소유 남성 보다 부드럽고 상대적으로 얇은 첫 번째 안테나 (그림 3B). 일부 여성 또한 그들의 시체 (그림 3B, 3D)에 gonadal 지질에서 진한 녹색 색깔을 전시 한다.
- (그림 7B) 우물의 뚜껑에 섹스를 표시 합니다.
2. 행동 테스트와 친구를 지키는 행동의 비디오 녹화
- 테스트 당일 원하는 무대와 행동 테스트에 대 한 섹스의 동물을 선택 합니다.
- 가늘게 지상 물고기 음식 문화 우물에서 선택한 개인을 피드 하 고 30 분 동안 그것을 먹을 수 있도록. 한편, 2.1.2 테스트 챔버 준비 단계를 진행 합니다.
- 테스트 챔버;으로 두 48-잘 플랫 바닥 세포 배양 배지 준비 1 개의 판 (이 하 "접시 A"에 게 불리는) 남성 고 대상 (예: copepodids, 성인 여성, 성인 남성)입니다 다른 ("접시 B"). 격판덮개의 우물에서 35%의 염 분을 깨끗 한 인공 해 수의 400 µ L를 추가 합니다. 가벼운 기관총 (그림 8)으로 반투명 아크릴 보드로 덮여 LED 빛 패드에 접시를 놓습니다.
참고: 실험의 목적에 따라 다른 매체를 사용 합니다.
참고: 과도 한 열을 방지 하려면 사용 하지 마십시오 백열 또는 형광 램프는 백라이트로. - 2.1.1에 설명 된 30 분 수 유 시간 후 부드럽게 가득한 깨끗 한 인공 해 수 (그림 9) 파편과 문화 우물에서 exuviae의 수행을 방지 하기 위해 24-잘 접시의 4 개의 우물의 승계에 pipetting으로 각 동물을 씻어.
- A와 B 플레이트 LED 빛 패드의 우물에 씻어 서 개인을 놓습니다. 우물에 동물의 조정에 대 일 분을 허용 합니다.
- (그림 8) 조정 기간 플레이트 A 위의 비디오 카메라를 설정 합니다. 카메라를 삼각대 나 스탠드를 사용 합니다.
- 접시 안테나의 관측을 허용 하는 A 안에 남성에 카메라 초점을.
참고: 영화에 백라이트의 깜박임 줄이기 위해, 프레임 속도 크거나 또는 전기 주파수의 절반을 설정 하 고 더 긴 노출 시간을 사용 하 여. 또한, LED 빛 패드 2.1.2 단계에서 설명한 대로 반투명 아크릴 보드로 덮여 유지.
- 2.1.4 단계에 설명 된 조정 기간 후 비디오 녹화 및 동작 테스트를 시작 합니다.
- 플레이트 B에서에서 파스퇴르 피 펫 플레이트 A 목표를 전송. 실험 매체에 화학 성분에 민감한 경우에, 각 테스트 쌍 펫을 변경 합니다.
참고: 때 접시 B에서에서 동물 pipetting 할 하지 쫓아 그것 파스퇴르 피 펫으로 물에 물 소요 수 있습니다 동물을 자극 하 고 초과 움직임을 유도. 약간 물 표면 위에 피 펫의 끝을 잡고 고 팁 아래 서 개인 기 다. 작은 양의 인공 해 수를 부드럽게 플라스틱 그리고 접시 A.에 잘으로 추출 - 실험 계획에 따라 남자와 대상 전송 후 원하는 관찰 시간 (예: 10 분) 동안에 각 잘 상호 작용을 허용 합니다.
- 관측 시간 후 비디오 녹화를 중지 합니다. 필요한 경우 컴퓨터에 카메라에서 기록된 영화를 다운로드.
- 플레이트 B에서에서 파스퇴르 피 펫 플레이트 A 목표를 전송. 실험 매체에 화학 성분에 민감한 경우에, 각 테스트 쌍 펫을 변경 합니다.
3. 수동 분석 행동 속성
- 각 대상에 대답 잘으로 전근 때 타이밍에 대 한 영화 검토
- 시작 및 종료 시기 관심 이벤트를 검토 하 고 기간, 대기 시간, 이벤트의 빈도 계산.
- (그림 10, 왼쪽 상단) 대상의 어떤 신체 부분으로 남자의 안테나의 접촉으로 남성에 의해 감시 시도의 시작을 정의 합니다. 더듬이 접촉 신속 앞에 종종 (< 0.5 s) 쫓 거 나 뛰 쳐.
- 남자의 두 안테나 (그림 10, 오른쪽 상단) 대상의 시체에서 분리 될 때 감시 시도의 종료 지점으로 정의 합니다. 시도 지키고의 주파수를 계산.
- 그 여성 (그림 10, 오른쪽 하단)에 대 한 urosome의 반복적인 보도 뒤 남자의 등 신체 굴곡에 의해 결합의 시작을 정의 합니다. 밀어의 주파수는 초당 여러 번입니다.
참고: 감시 남성 결합 (그림 10, 왼쪽 하단) 전에 여성 신체의 꼬리 끝 아래로 크롤링합니다. - 3.2.4에서 설명 하는 이벤트 후에 urosomes의 분리에 의해 결합의 종료를 정의 합니다.
참고: 결합 일반적으로 일어난다 토니 californicus 과 T. 나무의 경우에 몇 분 동안.
4. 2 차원 추적 개인 및 쌍의
- 영화 편집 소프트웨어와 함께 2 단계에서 기록 영화를 트리밍 하 여 관심 (예: 첫 번째 3 감시 시도의 s)의 한 에피소드를 갖춘 비디오 클립을 생성 합니다.
- ImageJ14 에서 설치: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. 다음 다운로드 MTrackJ, ImageJ15, 모션 추적 플러그인으로 지시 뒤에: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- ImageJ 열고 관심의 영화를 가져오기 (예를 들어, 파일 > 가져오기 >를 사용 하 여 QuickTime; 이미지 처리에 필요한 메모리를 줄이기 위해 "변환 8 비트 회색조"를 선택).
- 공간 및 시간 보정을 수행 합니다.
- ImageJ 창 공간 보정에 대 한 직선 라인 선택 도구를 선택 합니다.
- 영화 창에서 알려진된 길이 (예: 우물의 직경)를 가진 개체에 따라 선택 라인을 그립니다.
- "비율 설정" 메뉴를 열고 (분석 > 비율 설정). "알려진 거리" 상자에 "단위의 길이" 상자에서 그것의 단위 (예: mm) 알려진된 길이 입력 합니다. 다른 비디오 클립에 대 한 규모를 사용 하 여 "Global" 확인란을 클릭 합니다.
- "속성" 메뉴를 엽니다 (이미지 > 속성) 시간 보정에 대 한. 프레임 간격 (프레임 속도의 상호) "프레임 간격" 상자에 입력 합니다.
- MTrackJ를 추적을 구성 합니다.
- 플러그인에서 MTrackJ 플러그인을 열고 > ImageJ에 MtrackJ. 추적 열 MTrackJ 대화 창에서 "추적" 버튼을 클릭 합니다 구성 메뉴.
- "포인트를 추가한 후 다음 시간 인덱스 이동"을 선택 하 여 추적 간격 설정 구성 대화 창에서 "시간 스텝 크기" 상자에 숫자를 입력 하 고. 프레임별으로 추적을 수행 하려면 "시간 스텝 크기" 상자에 "1" 입력 합니다.
- "적용 로컬 커서 추적 중 스냅"를 확인 하 고 스냅 기능으로 "어두운 중심"을 선택 합니다. 이 옵션에는 자동 검색을 검색 평방 ("스냅 범위") 커서 주위에서 어두운 개체 (즉, 개인 또는 한 쌍)의 중심을 수 있습니다. 광장 전체 쌍 또는 동물 영화 (예: 31 x 31 픽셀)의 크기를 선택 합니다.
- 선택한 옵션을 적용 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
- 2 차원 추적을 수행 합니다.
- 추적을 시작 하려면 MTrackJ 대화 창에서 "추가" 버튼을 클릭 합니다.
- 한 쌍 또는 개인을 추적을 커서 (감지 광장)를 배치 합니다. 어두운 중심 광장 내에서 개체의 검색을 클릭 합니다.
- 원하는 프레임 수에 대 한 단계 4.6.2를 반복 합니다.
- 데이터 테이블을 생성 하기 위해 MTrackJ 대화 창에서 "측정" 버튼을 클릭 합니다. 데이터는 두 개의 창에 표시 됩니다: "MTrackJ:: 트랙" 창 추적된 2 차원 궤적의 요약을 표시 하 고 각 시간 지점에 대 한 자세한 데이터를 표시 하는 "MTrackJ:: 포인트". 각 테이블을 저장 하려면 파일을 선택 > ImageJ 메뉴 다른 이름으로 저장.
참고: 각 데이터 열에 대 한 개발자 (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/)에서 제공 하는 온라인 설명서를 참조 하십시오. - 영화 색된 선으로 그려진 추적 궤적을 생성 하기 위해 MTrackJ 대화 창에서 "영화" 버튼을 클릭 합니다. 생성 된 동영상을 저장 하려면 파일 > ImageJ 메뉴 다른 이름으로 저장.
- 전체 결과 저장 합니다. (단계 4.6.4) 데이터 및 추적 된 2 차원 궤적 (4.6.2 단계와 단계 4.6.3)를 포함 하 여 결과 저장 하려면 MTrackJ 대화 창에서 "저장" 버튼을 클릭 합니다.
Representative Results
1 단계에서 설명한 개별 자란 방법 준비와 페어링의 사전 경험 없이 처녀 동물의 준비 수 있습니다.
2 단계에서 설명한 행동 테스트 비디오 녹화 및 Tigriopus copepods의 동료를 지키는 행동의 관찰 수 있습니다. 3, 4 단계에 설명 된 방법으로 녹화 된 비디오의 다음 시험 그림 1에 표시 된 행동의 여러 측면의 정량 분석을 수 있습니다.
그림 11 남성 여성 쌍 및 T. californicus의 남성-남성 쌍 사이 시도 감시의 평균 기간에 차이 보여 줍니다. 수동 분석-남성 쌍 남성 여성 쌍 보다 페어링의 상대적으로 짧은 기간 보여준 시연 했다.
궤적 추적 분석 방법의 예는 그림 12 에 제시 하 고 대표 속도 분석 결과 그림 13에 표시 됩니다. T. californicus 의 새로 형성된 된 감시 쌍의 2 차원 공간 추적-남성 쌍 첫번째 3에서 남성 여성 쌍 보다 더 높은 속도 표시 하는 경향이 공개 시도 감시의 s.
그림 1: 친구를 지키는 행동 Tigriopus에. (A) 성인 남성 (파란색 화살표에 의해 표시 된) 첫 번째 안테나와 청소년 (copepodid) clasping. 바 = 1 m m. (B) 동료를 지키는 행동의 개요. 남성 대상 개인 (왼쪽)를 포착 하 고 그것은 (가운데)와 한 쌍을 형성. 남성 쌍, 일부 남성 여성 쌍 감시 시도 결합 없이 종료 됩니다. 이 그림은 Tsuboko-이 시이 고 버튼 20175에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Tigriopus의 발달 단계. Tigriopus 종은 일반적으로 (에서 NVI NI) 6 nauplius 단계, (CV 하 CI)에서 5 copepodid 단계 및 성인 단계 (CVI)16을 받 다. Copepodids ( 나무 토니와 토니 fulvus6,17 CI)와 토니 californicus3, CII의 초기 단계에서 청소년 뿐만 아니라 남녀5의 성인 남성 감시 시도 확인 . 이 그림은 Tsuboko-이 시이 고 버튼 20175에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 성인 (T. californicus)의 형태. (A) 성인 남성입니다. (B) 성인 여성입니다. (C) 벗. 수정 및 개발 (명확 하 게 오렌지) 계란 계란 골목 성인 여성. (D) 벗 성인 여성 unfertilized 또는 미 개발 계란 골목을 (진한 녹색) 계란. 화살표는 계란 낭을 나타냅니다. 바 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 개별 문화에 대 한 준비의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: exuviae Molted. T. californicus의 단일 동물의 CV 단계에 CI에서 (A) Exuviae 바 = 1 m m. (B) CI에서 이력서에 Exuviae 단계는 개별 문화에 잘. 하얀 파편에 (이미지에는 표시 되지 않음) 잘 경작 한 동물의 배설물입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6:는 stereomicroscope에서 exuviae에 대 한 검색. 바 = 1. (A) 초점 변경 다른 깊이에 exuviae의 검색을 위한 stereomicroscope. 마젠타 화살표 표시 초점된 exuviae 고 회색 화살표는 산만된 exuviae을 나타냅니다. 상위 이미지는 우물의 바닥에 침 몰 한 왼쪽된 exuviae에 집중 한다. 하단 이미지 중간 표면 아래에 떠 있는 오른쪽 exuviae에 집중 한다. (B) 최고의 이미지는 중간 표면에 떠 있는 파편에 의해 검사의 방해의 예를 보여 줍니다. 녹색 화살표는 exuviae 파편 아래 숨겨진 나타냅니다. 하단 이미지 표면 종이 타월의 작은 조각으로 청소의 결과 보여 줍니다. (녹색 화살표로 표시 됨)는 exuviae 청소 후 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 준비 및 동물의 sexing. Exuviae의 수와 문화 접시의 뚜껑에 동물의 섹스를 표시 하는 방법의 예. (A) 5 exuviae 및 성인 동물을 포함 하는 잘에 대 한 예입니다. 뚜껑에 집계 표시에 줄 수를에 잘 발견 하는 exuviae의 수를 나타냅니다. Exuviae의 수는 5에 도달 하면, 동물의 섹스 수 수에 따라 결정 안테나 형태 ( 그림 3참조). (B)는 문화 판의 표시 뚜껑의 예입니다. 상위 행 포함 오래 된 (성인 CIV) 동물 하 고 아래쪽 행 포함 젊은 (즉, 새로 수집 된) 동물 (CIII CI). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 행동 테스트 계획. 친구를 지키는 행동 (왼쪽)의 비디오 녹화 및 동작 테스트 (오른쪽)의 개요에 대 한 설정. 이 그림은 Tsuboko-이 시이 고 버튼 20175에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 행동 테스트 전에 동물의 린스 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 수동 분석에서 검사 하는 이벤트의 정의. 친구를 지키는 시도 관하여 관찰 이벤트의 삽화. 이벤트 정의 및 3 단계에서 분석의 이름이 강조 표시 됩니다. 이벤트는 점선에 일부 짝을 지키는 시도에 관찰 하지 않을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11: 남성 여성 쌍 및 T. californicus의 남성-남성 쌍 사이의 기간을 지키고 차이. 각 삼각형 기호 한 테스트 쌍에서 데이터를 나타냅니다. 바와 수염 medians과 interquartile 범위를 각각 나타냅니다. 캡처의 평균 기간 남성 여성 쌍 컸다 (남성-여성 (n = 22), 남성 (n = 29); * *p < 0.01 맨-휘트니 U 테스트에 의해). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12: 시도 감시의 처음 3 초에 쌍을 궤도. 남성 여성 쌍 (왼쪽)와 토니 californicus의 남성-남성 쌍 (오른쪽)의 2 차원 궤적을 추적된의 예. 궤도 시간 포인트를 (30 프레임 / 초)를 나타냅니다. 바 = 10 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13: 남성 여성 쌍 및 T. californicus의 남성-남성 쌍 사이 감시의 개시 후 평균 속도 차이. 각 삼각형 기호 한 테스트 쌍에서 데이터를 나타냅니다. 바와 수염 medians과 interquartile 범위를 각각 나타냅니다. 첫 번째 3에서 쌍의 속도 평균 s 시도 감시의 남성-남성 쌍 컸다 (남성-여성 (n = 13), 남성 (n = 35). * * *p < 0.001 맨-휘트니 U 테스트에 의해). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Tigriopus의 동작에 치료를 rinsing의 보충 그림 1: 효과. 각 원 또는 삼각형 기호 1 테스트 개인 또는 쌍에서 데이터를 나타냅니다. 바와 수염 medians과 interquartile 범위를 각각 나타냅니다. "씻어 서" 및 "안 씻어 서" 그룹에서 개인은 "안 씻어 서" 그룹 (단계 2.1.4) 30 분 조정 시간 전에 rinsing 치료 (2.1.3 단계)를 경험 하지 않았다를 제외 하 고 동일한 방식으로 처리 합니다. (A) 씻어 서 수 컷의 평균 속도 경향이 안 씻어 서 남성 보다 (씻어 서 (n = 6), 안 씻어 서 (n = 6), n.s.: 맨-휘트니 U에 의해 상당한 차이가 감지 테스트). 30에 대 한 속도 측정 되었다 s 동영상에 따라 조정 시간 후 기록. (B) 씻어 서 암컷의 평균 속도 경향이 안 씻어 서 여성 보다 (씻어 서 (n = 6), 안 씻어 서 (n = 6), n.s.: 맨-휘트니 U에 의해 상당한 차이가 감지 테스트). 30에 대 한 속도 측정 되었다 s 동영상에 따라 다음과 같은 4 단계 조정 시간 후 기록 (추적 간격 0.5 = s). (C) 시도 지키고의 주파수는 씻어 서 개인의 쌍에 대 한 큰 (씻어 서 (n = 6), 안 씻어 서 (n = 6). * * p < 0.01 맨-휘트니 U 테스트에 의해). (D) 시도 지키는 기간 경향이 씻어 서 개인의 쌍에 대 한 큰 (씻어 서 (n = 6), 안 씻어 서 (n = 6), n.s.: 맨-휘트니 U에 의해 상당한 차이가 감지 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
개별 경작 및 단계와 섹스의 결정
여기 우리 페어링 경험을 그들의 개발 (그림 4 및 그림 7)를 추적 하는 동안 제어 처녀 Tigriopus 동물을 준비 우리의 이전 연구5 에 사용 되는 방법을 설명 합니다. Tigriopus 종 독성16,18,21, 생태 생리학의19,20,등 다양 한 생물학 분야에서 모델 동물로으로 진화 하 고 유전학13,22,,2324이 방법은 이러한 copepods의 라이프 사이클에 환경 및 유전적 요인의 영향을 평가 하는 중요 한 수단을 제공 하는 잠재력이 있다.
성공적인 준비, 일반 검색 및 CI의 컬렉션 대량 문화 (1.2 단계)에서 copepodids은 중요, 나중 단계에서 컬렉션 동물의 잘못 준비 단계에서 발생할 수 있습니다. 또한, exuviae (1.3 단계)에 대 한 철저 한 검색 또한 정확한 준비를 위해 필수적 이다. 컬렉션 및 molts 사이의 간격 1 종에 따라 몇 일에서 다릅니다으로 필요한 경우, 준비 상태2,,2526양육의 주파수를 증가. 안테나 형태 copepodids과 성인 여성 간의 차이 일부 종 Tigriopus16,25의 인구에서 가시 중요 합니다. 따라서, 파는 이전 준비 성인 여성도 섹스의 고급 copepodids에서 구별 도움이 됩니다.
행동 테스트 및 행동 속성의 수동 분석
일반적으로, ethological 연구의 가장 중요 한 부분 중 하나 이며 정의 관심 이벤트의 설명. 이 종이에 도입 하는 방법 처음 우리의 최근 연구5 개발 하 고 결합 하 고 시각 보조 기능 (그림 10)의 설명으로 보충 했다. 그 외에, 동물 처리에 일관성도 중요 한 역할 행동 실험에 재생합니다. 예를 들어 copepods의 rinsing 잠재적으로 그들의 행동 (보충 그림 1)의 일부 측면을 촉진 수 있습니다 이며 따라서 2.1.3 단계에서와 같은 표준화 된 샘플 중 일관 된 방식으로 수행 하는 것이 좋습니다. 우리는이 문서에 제공 되는 자료 제어 및 재현성 연구 Tigriopus, 높은 파도 풀의이 풍부한 주민의 생식 및 생태 연구 추진의 동료를 지키는 행동에 도움이 될 것입니다 기대 합니다.
이 방법은 한 가지 가능한 한계는 얻은 이미지의 낮은 확대. 우리의 시스템과 기록 영화 urosomes와 남성 첫 번째 안테나를 포함 하 여 저명한 신체 구조의 식별 수 있도록, 비록 한 수 없습니다 때문에 사용 하지 않는 우리의 방법으로 다리와 생식 기 같은 더 미묘한 구조를 관찰 하 비디오 녹화에 대 한 현미경 확대입니다. 켈리 그 외 여러분 보고 그들이 100 배 확대 (비디오 기록 없음)에서 미세한 움직임만 T. 나무 의 여성 남성에서 전송 spermatophore를 관찰할 수 있지만7, 우리 수 되지 않은 관찰 하는 우리의 영화, 이미지 해상도의 한계 때문에 아마도 spermatophore.
쌍의 2 차원 추적
이 방법은 동물의 3 차원 추적을 허용 하지 않습니다, 그것은 수 동물성 플 랭크 톤의 2 차원 궤적 분석 화학적 동물 (cf라벨 없이. 그 외 201027라 드)를 무료로 배포 하는 프로그램을 이용 하 여. 동영상 파일의 크기에 ImageJ 처리 너무 크면, 한 파일의 해상도 줄일 수 그레이 스케일 영화로 그것을 변환. 설명된 방법 T. californicus (그림 12 와 그림 13)의 성인 쌍에 대 한 원래 개발 되었다, 그러나 그것은 또한 성인 청소년 쌍 및 단일 개인 (보충 그림 1)로 사용할 수 원칙적으로 다른 Tigriopus 종. 우리는 더 적절 한 조정으로 다른 taxa의 동물성 플 랭크 톤의 단기 (두 번째 시간의 척도에 밀리초)에서 적용 궤적 분석 되도록 메서드를 기대 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 스미 토모 재단, 일본에서 교부 금에 의해 지원 (기본 과학 연구 프로젝트, 부여 번호를 부여: 150932) 및 연구 연구소의 해양 무척 추 동물, 미국에서 STI와 RSB, 그리고 부여를 일본 (2018 개별 연구 보조금) 국립 과학 재단 (뎁-1556466) RSB 하. 우리 양 Kiana 미셸 우드 워드 자란 고 준비 방법에 대 한 의견 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
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