Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

نموذج الماوس هايبراندروجينيك لدراسة متلازمة تكيس المبيض

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,4, 1,4,5
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

يصف لنا تطوير نموذج الماوس مثل متلازمة تكيس المبايض العجاف مع بيليه ديهدروتستوسترون لدراسة الفسيولوجيا المرضية لمتلازمة تكيس المبايض والذرية من هذه السدود مثل متلازمة تكيس المبايض.

Abstract

هايبراندروجينيميا يلعب دوراً حاسما في الوظيفة الإنجابية والايض لدى الإناث، وهي السمة المميزة لمتلازمة تكيس المبيض. وضع نموذج ماوس مثل متلازمة تكيس المبايض الهزيل الذي يحاكي النساء مع متلازمة تكيس المبايض مجدية سريرياً. في هذا البروتوكول، يصف لنا نموذج من هذا القبيل. عن طريق إدراج بطول 4 ملم من دهت (ديهدروتستوسترون) كريستال مسحوق بيليه (الطول الكلي لبيليه 8 ملم)، واستبدال شهريا، نحن قادرون على إنتاج نموذج ماوس مثل متلازمة تكيس المبايض مع المصل دهت مستويات 2 إضعاف أعلى من الفئران غير مزروع مع دهت (لا-DHT). لاحظنا الخلل في الصحة الإنجابية والتمثيل الغذائي دون تغيير وزن الجسم وتكوين الجسم. وفي حين نستعرض بدرجة عالية من العقم، مجموعة فرعية صغيرة من هذه الفئران الإناث مثل متلازمة تكيس المبايض يمكن الحصول على الحوامل وذريتهم إظهار تأخر سن البلوغ وزيادة التستوستيرون كبالغين. هذا النموذج مثل متلازمة تكيس المبايض العجاف الماوس أداة مفيدة لدراسة الفسيولوجيا المرضية لمتلازمة تكيس المبايض والذرية من هذه السدود مثل متلازمة تكيس المبايض.

Introduction

هايبراندروجينيسم هو السمة المميزة لمتلازمة تكيس المبيض (بكس) وفقا لمعايير المعهد الوطني للصحة والاندروجين الزائد والمجتمع بكس (AE-متلازمة تكيس المبايض). المرأة مع متلازمة تكيس المبايض يجدون صعوبة في الحصول على الحوامل، وزادت من خطر مضاعفات الحمل1. حتى لو أنها تحصل على الحوامل، قد ذريتهم الإناث نتائج ضارة بصحة2،3. وقد وضعت نماذج حيوانية باستخدام مختلف استراتيجيات4،5،،من67،،من89،10،11 , 12 ونستعرض العديد من الميزات لمتلازمة تكيس المبايض (anovulation و/أو ضعف التسامح الجلوكوز والإنسولين) مع زيادة وزن الجسم والسمنة المرتبطة بحجم adipocyte تضخم وزيادة الوزن adipocyte. هناك اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية لإنتاج النماذج الحيوانية المستخدمة لدراسة متلازمة تكيس المبايض. واحد هو العلاج مع مستويات عالية من الاندروجين مباشرة (حقن الاندروجين الخارجية/الإدراج) أو غير مباشر (مثل حظر تحويل الاندروجين إلى الإستروجين مع مثبط aromatase) بعد الولادة13. آخر طريق هايبريكسبوسوري الجنين من الاندروجين أثناء الحمل14،15 لدراسة الأبناء. على سبيل المثال، وضع الإناث ذرية من القرد الريسوسي16،17والأغنام18والقوارض المعرضين لمستويات الاندروجين الذكور خلال فترة داخل الرحم الصفات مثل متلازمة تكيس المبايض لاحقاً في الحياة. هذه النماذج إلى حد كبير تعزيز فهمنا للآثار الاندروجين مرتفعة، وبرمجة الجنين والرحم من الآثار البيئية. ومع ذلك، قد هذه النماذج القيود الخاصة بها: 1) الحيوانات وضع السمنة وذلك فمن الصعب فصل آثار هايبراندروجينيميا من السمنة الناجمة عن الصحة الإنجابية والخلل في التمثيل الغذائي؛ 2) قبل الحمل، تظهر النساء مع متلازمة تكيس المبايض الفعل مستويات عالية من الاندروجين، وهكذا تعرضت بويضات الاندروجين الزائد قبل الإخصاب؛ 3) الجرعات الدوائية التستوستيرون (T) أو ديهدروتستوسترون (دهت) تستخدم بعد الولادة أو خلال فترة الحمل قد لا تعكس بيئة الاندروجين متلازمة تكيس المبايض. تم قياس مستويات هرمون التستوستيرون و DHT في سائل جرابي المبيض و/أو المصل، والتستوستيرون ومستويات DHT 1.5 إلى 3.9 إضعاف أعلى بين النساء مع متلازمة تكيس المبايض5،،من1920،21 ،،من2223 مقارنة بالمرأة التي لم تتأثر. لقد أنشأنا ماوس الكبار نموذجي23،24،25 أن يتطور الإنجابية والايض الخلل في خلال أسبوعين بدء التعرض المزمن دهت من الإدراج بيليه بطول 4 مم كريستال مسحوق دهت (الطول الكلي لبيليه 8 ملم). ينتج هذا النموذج مستويات DHT المصل التي على وشك 2-fold أعلى (يشار إليها على أنها 2xDHT) مقارنة بالفئران التحكم دون علاج دهت. الفئران 2xDHT لا يحمل التعديلات من استراديول المصل القاعدي، التستوستيرون، LH، وهل عدم وضع السمنة، وإظهار وزن المبيض مماثلة، مصل مستويات الكولسترول، والأحماض الدهنية الحرة، اللبتين، TNFα وايل-623،24، 25 نسبة إلى عناصر التحكم حتى يصل إلى 3.5 شهور بعد دهت الإدراج23،،من2425. بالإضافة إلى ذلك، بالتزاوج الإناث التي وضعت بالفعل ملامح متلازمة تكيس المبايض، علينا دراسة أثر بيئة الأمهات هايبراندروجينيك عن الصحة الإنجابية والأيضية ل ذرية15.

هذا النموذج الجديد (ذات الصلة بمعايير المعاهد الوطنية للصحة والمجتمع عبد اللطيف-متلازمة تكيس المبايض) نماذج المرض بإنتاج مماثلة نسبيا مستويات الاندروجين إلى أولئك النساء مع "متلازمة تكيس المبايض" 2-3-fold التستوستيرون أعلى أو مستويات DHT مقارنة بالمرأة التي لم تتأثر. ومع ذلك، يتم الاحتفاظ هذا النموذج دهت الخارجية المستمرة وليس من هايبراندروجينيسم الذاتية مبرمجة حالما يتم سحب دهت. والهدف العام لهذه المادة هو التركيز على 1) كيفية جعل بيليه دهت؛ 2) كيفية توليد العجاف-متلازمة تكيس المبايض مثل الماوس النموذجي؛ 3) استراتيجيات تقييم ذرية الإناث من هذه السدود. القياسات والتقييم تعمل الأخرى لم تعالج في هذه المخطوطة ولكن يمكن العثور عليها في5،15،،من2324،،من2526.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

نقدم هنا، بروتوكولات مفصلة دهت بيليه إعداد والإدراج، والصحة الإنجابية والايض اختبار. الفئران المستخدمة في هذه الدراسة كانت خلفية مختلطة (C57/B6، CD1، 129Sv)، وتواصلت مع الغذاء والمياه libitum الإعلانية في دائرة ضوء/الظلام ح 14/10 في 24 درجة مئوية في برودواي البحوث بناء منشأة الحيوان في كلية جامعة جونز هوبكنز الطب. وافق جميع الإجراءات لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان جامعة جونز هوبكنز.

1-إنشاء نموذج الماوس مثل متلازمة تكيس المبايض

  1. إعداد بيليه دهت
    1. أنابيب سيلاستيك اﻷوتوكﻻف لتعقيم. قطع أنابيب سيلاستيك بطول 15 ملم مع شفرة حلاقة؛
    2. ختم جانب واحد عن طريق حقن سيليكون لاصقة طبية في الأنبوب بإبرة يتثلم ز 20 المرفقة بحقنه 3 مل. المكبس ينبغي سحبها من المحاقن ومن ثم لاصق إدراجها في الخزان. يتم إعادة إدراجها المكبس ودفعت لاصق إلى أن تبدأ في الظهور من الإبرة. إبرة يتثلم من قبل قطع جانب الحافة الحادة ز 20 إبرة مع أي مقص قوي. يجب أن يكون طول السليكون في الأنبوب أكثر من 2 مم إلى السماح لاقتطاع ما بعد الإنتاج؛
    3. بين عشية وضحاها الجافة؛ تحقق من وجود فقاعات الهواء على الجانب مختومة. وتستخدم تلك مع لا فقاعات الهواء للكريات دهت. يمكن استخدام الآخرين دهت لا مراقبة الكريات.
    4. ارتداء قفازات ونظارات واقية وقناع معطف مختبر قبل بيليه دهت في غطاء لتفادي التعرض دهت للجلد.
    5. مسحوق دهت صب في بلاستيك وزن القارب والصحافة على الجانب المفتوح من اللاصق توج أنابيب (المنتجة في ألف 1-1) في مسحوق دهت.
    6. يمكن تهدأ مسحوق دهت إلى أسفل مع قصاصة الورق كبيرة التي يتم تقويمها.  تستمر حتى دهت يصل ارتفاعها من 4 مم (أو الطول المطلوب). التحقق من طول دهت مع مسطرة، وختم الجانب مفتوحة مع السيليكون، الجافة بين عشية وضحاها.
    7. قص كل جانب مختومة لجعل طول السليكون 2 مم في الطول. وسيكون إجمالي طول بيليه 8 مم.
    8. ختم جانبي أنابيب سيلاستيك الفارغة كبيليه السيطرة (لا-DHT).
    9. تبقى الكريات في أنبوب 50 مل مخروطية ملفوفة بإحباط (لمنع التعرض للضوء) في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. الكريات دهت الحفاظ على فعالية كاملة لمدة 3 أشهر على الأقل من التخزين.
  2. دهت الإدراج واستبدال
    1. ما يصل إلى 20 دهت مغمورة الكريات أو الكريات التحكم بشكل منفصل في أنبوب 50 مل مخروطية مع 30 مل عقيمة المالحة 0.9 في المائة عن 24 ساعة في 37 درجةمئوية للموازنة قبل الإدراج.
    2. قبل الجراحة، وهي تطهير الأسطح والقفازات مع كليد وتغطي أسطح العمل مع ورقة ماصة تدعمها بلاستيكية نظيفة (لوحة العمليات الجراحية).  يتم تطهير جميع الصكوك التي تأتي في اتصال مع الحيوانات قبل دخول المرفق الحيوان بالتعقيم.  الصكوك سيسمح جافة وباردة قبل الاستخدام.
    3. وتستخدم الفئران الإناث عمرها 2 شهر (4 – 5 الفئران/قفص). يتم حقن الفئران إينترابيريتونيلي مع إكسيلازيني (3.5 مغ/كغ وزن الجسم) والكيتامين (78.8 مغ/كغ وزن الجسم) حقنه الأنسولين باستخدام. العمليات الحسابية لخلط وجرعات التخدير في الجدول 1.
    4. بعد أن يتحقق، مقيسة بفقدان إصبع القدم ريفلكس التخدير الكافي وإبطاء التنفس، وسوف هيأهم الماوس لإجراء عملية جراحية.
    5. تطهير جلد المنطقة مع تدين استخدام شاش معقم ونظيف مع الإيثانول 70%.  المنطقة سوف تكون رسمت مرة أخرى مع تدين.
    6. قطع حفرة حوالي 5 مم طول مع المقص تحت الجلد بالقرب من الرقبة. استخدام تروتشار ز 10، جعل نفق صغير (15 ملم) باتجاه روسترال. يتم إدراج بيليه دورسالي تروتشار.
    7. ثم فتح مختومة بمادة لاصقة الجراحية. يدوياً التقريبي حواف الجرح بالملقط ولطيف جرات الفرشاة لتطبيق طبقة رقيقة من سائل لاصق على حواف الجرح التقريبي. تراكم 3 طبقات رقيقة من مادة لاصقة لضمان اللاصقة موزعة بالتساوي حول الجرح. وينبغي تمديد اللاصقة 1 سم على كل جانب من حواف الجرح الرئيسي يعارضها. يمكن أيضا استخدام خياطة أو مشابك جراحية إغلاق الثقب. إعادة وضع الفئران في قفص، مبنى على حدة، مع لوحة حرارة للانتعاش. استبدال بيليه كل 4 أسابيع للحفاظ على مستوى ثابت من التعرض الاندروجين. سيتم إزالة بيليه الأصلي وسيتم إدراج بيليه جديدة كما هو موضح في A1.15 في موقف مماثل.
    8. اختبار استروس سيكليسيتي بعد 3 أيام إدراج دهت. ويتم تقييم مرحلة دورة الشبقية بعلم الخلايا المهبلية.  يتم جمع الخلايا المهبلية لمدة 16 يوما متتالية باستخدام بيبيتور p10 لبخ عقيمة المالحة (حوالي 10 ميليلتر) في تجويف المهبل وثم سحب المياه المالحة مع طرف ماصة معقمة نفس.  مزيج مع المحلول الملحي الخلايا المهبلية سلوغيد من جدار المهبل ويتم جمعها.
    9. انتشار المحلول الملحي مع الخلايا إلى شريحة مسمى. يمكن أن تحتوي كل شريحة على ست عينات. تتم تسمية الشرائح ملاحظة العينة التي يتم وضعها في كل موقع من المواقع الستة.
    10. بعد المياه المالحة قد تماما جفت على الشريحة، وضع الشرائح في حاوية مع الإيثانول 100% لإصلاح الخلايا. الشرائح وينبغي أن تكون ثابتة لمدة 5 دقائق على الأقل، ولكن يمكن أن تظل في مثبت إلى أجل غير مسمى حتى استخدامها مرة أخرى.
    11. وضع الشرائح المصبوغة الحلول لكل المخزن المؤقت ب 1 دقيقة ويغسل جيم الشرائح بماء الصنبور وجاف في درجة حرارة الغرفة.
    12. دراسة مورفولوجيا الخلايا تحت مجهر خفيفة موضوعي 10 X.  مورفولوجيا الخلايا للتمييز بين بروستروس (P)، السفاد (ه)، ميتيستروس (M) وديستروس (د) يرد في المراجع27،،من2829.
    13. عدد الأيام في كل مرحلة ومقسوما على العدد الكلي لأيام حساب النسبة المئوية من الوقت في كل مرحلة.
    14. اختبار تحمل الجلوكوز في فترة 21 يوما بعد الإدراج دهت بالصيام الفئران بين عشية وضحاها (ح 16) والحقن 2 غ/كغ من وزن الجسم من سكر العنب 20% إينترابيريتونيلي. على سبيل المثال، إذا كان وزن جسم ماوس ز 25، هذا الفأر سوف يكون حقن 250 ميليلتر من 20% سكر العنب مع حقنه الأنسولين cc (0.5 مل) 50. يجري تقييم مستويات السكر بشرائط الاختبار والسكر بأخذ عينات من الدم من الوريد الذيل في 0، 15، 30، 60، 90، 120 دقيقة. هذا هو وصف بالتفصيل في مكان آخر30.
  3. جمع الدم
    1. جمع الدم في أيام مختلفة بعد الإدراج دهت (نحن تحد من حجم مجموعة 100 ميليلتر الستيرويد و 30ul لفحص LH/FSH) بين 9 و 10:00 ص بالوريد اللهاة نزيف مع مجلة لانسيت. هذا هو وصف في11.
    2. الطرد المركزي الدم في 6,000 س ز في 4 ˚C لمدة 10 دقائق، وجمع طبقة المصل في أنبوب 1.5 مل آخر التي يمكن تخزينها في-80 درجةمئوية حتى المقايسة.

2-تقييم الإنجابية لمحات نسل الإناث من أمراض مزمنة دهت إدراج السدود

  1. التزاوج
    1. يتم نقل الماوس الإناث لفحصها في القفص مع الذكور خصبة ثبت (الذي كان سابقا الجراء مع ماوس الإناث) في 15 يوما عقب الإدراج بيليه.
    2. الوثيقة من وزن الجسم لسد كل أسبوع تحديد ما إذا كان الماوس الحوامل. السد زيادات الوزن أكثر من 3 غرام في أسبوع يشير إلى الحمل.
    3. جمع دم سدود في الأسبوع الثاني بعد أن نلاحظ زيادة الوزن من السدود أكبر من الجيل الثالث 3g من قبل ذلك بأسبوع.
  2. سن البلوغ بفتح المهبل والسفاد أول تقييم
    1. تحقق من فتح المهبل بالفحص البصري كل يوم بعد أن يتم الفطام الجراء في 21 يوما بعد الولادة (PND)، قياس المسافة الناحية الشرجية التناسلية وتسجيل سن افتتاح المهبل.
    2. بمجرد فتح المهبل، جمع الخلايا المهبلية يوميا، كما هو موضح في 1.2.8–1.2.11 للتحقق من سيكليسيتي استروس.
    3. مراقبة مورفولوجيا الخلايا كوصف 1.2.12، والسفاد الأول يعرف التاريخ أن كافة الخلايا هي الخلايا الظهارية كورنيفيد.
  3. لكمه الإذن ووزن الجسم
    1. تراجع تلميح انسيت في لصق الوشم وعلامة كل ألجرو مع وشم على أخمص قدميه كما هو موضح في مرجع12 في 7 الحزب الوطني الديمقراطي، وتزن الفئران كل 7 أيام حتى 70 يوما عمر.
    2. الإذن لكمه الفئران عدد منهم استخدام النظام في الشكل 1 بين 12 إلى 16 اكتئاب. للتمييز بين الجنسين، ودراسة الجانب البطني من الجسم، سيكون الإناث حلمات مرئية.
    3. جمع الدم في القرن 21، 26، 70 اكتئاب بعد الولادة كما هو موضح أعلاه في 1.3.1
  4. التحليل الهرموني
    1. مستويات DHT في مصل الدم تقاس بكل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) والتي ترادف اللوني السائل الشامل قياس الطيف الكتلي (LC-MS)23،24،،من3132. T يقاس LC-مرض التصلب العصبي المتعدد، أو فأر/ماوس أليسا التي تم التحقق من صحتها بجامعة فيرجينيا يجند التحليل الأساسية في مركز البحوث في الاستنساخ23،24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مصل مستويات DHT واختبار تحمل الجلوكوز

قيست مستويات DHT من مصل الدم التي جمعت كلا أليسا، ومرض التصلب العصبي المتعدد-LC وفقا للبروتوكول 1.24 – 1.25، و 2.9 من 3.0. القيم المطلقة دهت تختلف بين الطيف الكتلي وإليزا، مع ذلك، حظيرة النسبي (نحو إضعاف) مقابل دهت الإدراج لا دهت مماثل من فحوصات على حد سواء، وعبر تجارب15،،من2324 ( الشكل 2A).  هي إلى حد كبير زيادة مستويات DHT من يسبق من خلال الحمل في الفئران DHT ولا دهت، إلا أن مستويات DHT 2-fold أعلى في الفئران دهت مقارنة بالفئران لا دهت في كلا بريجيستاشونال (يوم واحد قبل التزاوج) والحمل (حوالي 14 يوما) النقاط الزمنية (الشكل 2). نظراً للمستويات المطلقة دهت تختلف بين أليسا و LC-مرض التصلب العصبي المتعدد، نقوم بحساب المستويات النسبية (إضعاف التغيير: مستوى DHT مع دهت الإدراج مقابل دهت لا الإدراج) ضمن فحوصات. وأظهرت الفئران الإناث مع دهت ضعف تحمل الجلوكوز بالنسبة للا-دهت (الشكل 3) في 2 أسابيع بعد الإدراج دهت وفقا للبروتوكول 1.23.

ذرية الإناث الجسم الوزن والبلوغ

بينما عموما يعانون من العقم، بعض السدود الحصول على الحوامل، وقد ماتت (حوالي 30% معدل الحمل، وباختبار خصوبة 10 سدود ونحن سوف عادة الحصول على 3 سدود الحوامل، الرجوع إلى بروتوكول 2.1). ولذلك يمكننا تقييم آثار الاندروجين المزمن في السدود على نسل الإناث. ذرية الإناث من السدود دهت إدراج تسمى دهت-بنات، وتلك من السدود لا-دهت إدراج تسمى بنات لا دهت. لاحظ أننا لا فرق بين لا دهت ودهت-بنات لسن افتتاح المهبل. بيد السفاد الأول من دهت-بنات يتأخر كثيرا (اليوم 35 لابنه لا دهت؛ يوم 42 لابنتها دهت). وهذا يرتبط بوزن الجسم انخفاض في اكتئاب 35 و 42 على حد سواء في دهت-بنات بالنسبة للبنات لا دهت (الشكل 4؛ الرجوع إلى بروتوكول 2.4-2.7).

المستويات الهرمونية وسيكليسيتي استروس في الذرية الإناث

مستويات هرمون تستوستيرون لا تتغير في 21 الحزب الوطني الديمقراطي، ولكن خفضت في 26PND. ومع ذلك، يتم زيادة التستوستيرون في اكتئاب 70 (الشكل 5، الرجوع إلى بروتوكول 2.9-3.0). أظهر الكبار دهت بنات تعطلت استروس سيكليسيتي مقارنة بالبنات الكبار لا-دهت، تشهد أوقات أطول بشكل ملحوظ في مليون دينار وأقل وقت في ف وه (الشكل 6 أ، ب؛ وفقا للأسلوب في البروتوكول 1.17-1.22).

Figure 1
رقم 1: تحديد الماوس. داخل قفص واحد، هو الماوس الإذن لكمات في موضع آخر لتمثيل عدد الماوس. ماوس #1 إلى 3 من كمات على الإذن اليمنى، وهو اللكم #4 إلى 6 في أذنه اليسرى ينظر إلى دورسالي. إذا كان الماوس هو اللكم على آذان في موقف #1 و #4، أنها #7؛ في 2 و 5، هو #8؛ في 3 و 6 من 9 #؛ في منتصف الإذن اليسرى هو #10؛ الموضع 1 و 10 هو #11؛ إلخ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مصل دهت المستويات. مصل مستويات DHT. (أ) يتم قياس مستويات DHT المصل أليسا وقياس الطيف الكتلي. على الرغم من اختلاف القيم المطلقة، فحوصات اثنين أظهرت مماثلة إضعاف الاختلافات بين دهت ودهت لا يعامل الفئران. (ب) تغير "دهت المصل" إضعاف مقارنة بمستويات غير دهت في وقت الحمل وتحسين نقاط. لا-دهت (الحانات مفتوحة) والفئران الإناث مزروع دهت (أشرطة سوداء) قبل (يوم واحد قبل التزاوج) وخلال فترة الحمل (حوالي 14 يوما الحمل). القيم هي يعني ±S.E.M-N = 5-8 كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: اختبار تحمل الجلوكوز (فريق العمل العالمي)- لا دهت ودهت مزروع الفئران كانت صامت بين عشية وضحاها وتم حقن الجلوكوز (2 غ/كغ وزن الجسم) إينترابيريتونيلي، وتم قياس جلوكوز الدم الذيل في نقاط زمنية مختلفة. دهت معاملة الفئران أظهرت مستويات السكر زيادة كبيرة بين 30 إلى 120 دقيقة مقارنة لا-دهت يعامل الفئران. القيم هي يعني ±S.E.M-N = 4-12 كل مجموعة. * ف < 0.05 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: المعاملة دهت الأمهات قبل الحمل أدى إلى انخفاض الوزن في ذرية الإناث في اكتئاب 35 و 42- وتم قياس وزن الجسم (المحور الصادي) في أيام ما بعد الولادة كما هو مبين (س). يتعرض دهت ذرية: شريط أسود؛ لا ذرية – DHT: فتح بار. القيم هي يعني ±S.E.M-N = 9-14 كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: المصل دهت المستويات. تم جمع الدم في الصباح في اكتئاب 21 26، 70 في الصباح. مصل مستويات DHT المحور (ص) من نسل الإناث من بنات لا دهت (الحانات مفتوحة) ودهت-بنات (أشرطة سوداء). القيم هي يعني ±S.E.M-N = 5-11 كل مجموعة. وقد تم تعديل هذا الرقم من مرجع2الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: المزمن الاندروجين الأمهات الزائد يؤدي إلى الانزعاج سيكليسيتي في البنات الكبار- (أ) تمثيل استروس سيكليسيتي من نسل الإناث. (ب) النسبة المئوية للوقت المستهلك في كل مرحلة استروس المحور (ص) خلال 15 يوما (س) تقاس بالفحص الخلوية للخلايا المهبلية. القيم هي يعني ±S.E.M-N = 5-9 كل مجموعة. مرحلة دورة الشبقية المحور (ص). مليون دينار: اجتمع/ديستروس؛ P: بروستروس؛ هاء: السفاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table 1
الجدول 1: كوكتيل الكيتامين/إكسيلازيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هايبراندروجينيسم من سمات رئيسية لمتلازمة تكيس المبايض. مستويات DHT المصل (اثنان إضعاف أعلى في الفئران دهت من الفئران لا دهت) المستخدمة في هذا البروتوكول هي أقل من تلك التي أبلغ عنها بغيرها من المحققين في الدراسات السابقة وهي محسوبة تناسبياً تقليد النساء مع متلازمة تكيس المبايض5،19، ،من 2021. على عكس النماذج الأخرى، لا يغير من هذا الطراز دهت إضعاف وزن الجسم وتكوين الجسم كله مقارنة مع الفئران لا دهت ليصل إلى 3.5 شهور بعد دهت الإدراج23،24. وتحتفظ هذه الفئران دهت مزروع الكبار دهت الخارجية المستمرة. على الرغم من أن لا يتم تبديل تكوين الجسم كله، لوحظ تغيير هيكل ووظيفة adipocytes في الهزيل بكس النساء20. هناك ما يبرر إجراء دراسة متأنية لمستودعات مختلفة. لاحظ سيكليسيتي استروس البصر خلال أسبوع واحد بعد دهت الإدراج15 ، وخفض معدل الخصوبة خلال تقييم خصوبة لمدة 3 أشهر23.

مجموعة فرعية صغيرة من دهت معاملة الفئران الإناث التي كانت قادرة على الحصول على الحوامل وذرية وفرت فرصة لتقييم أثر هايبراندروجينيميا بريجيستاشونال، والحمل، والتمريض في وضع الجنين. متعددة تربية الإناث مطلوبة من أجل الحصول على تجربة التي تسيطر عليها بشكل صحيح، مما يستلزم أن مالا يقل عن 10 أزواج التزاوج المنشأة. دهت-بنات فقط تتعرض دهت خلال فترة الحمل وقبل 21 السلطة الوطنية الفلسطينية. دهت-بنات أظهرت انخفاض الوزن مقارنة بالبنات لا دهت، مما يشير إلى أن زيادة الوزن أو السمنة ليست متغير التباس في الآثار الفسيولوجية الملاحظة15.

في الدراسات الأولية، نحن التحقق من مستويات DHT المصل على مر الزمن. ووجدنا لا اختلافات كبيرة في مصل الدم دهت في 1، 2، 3، و 4 أسابيع23،24. مستويات DHT انخفض بعد 4 أسابيع، ولذلك نحن استبدال بيليه دهت كل 4 أسابيع. لا يمكننا أن نلاحظ آثار انخفاض دهت حتى أنهم تم تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 أشهر. من المهم أن احتضان الكريات في المحلول الملحي ل 24 ساعة فقط قبل الإدراج. هذه الخطوة غير الحرجة حتى الإفراج عن دهت من بيليه (الإفراج عن دهت ببطء من خلال أنابيب سيلاستيك). يمكن فحص استروس سيكليسيتي بعد 3 أيام إدراج دهت، ويمكن فحص اللطاخة المهبلية أيضا مباشرة في المياه المالحة دون جاف ووصمة عار تحت مجهر خفيفة بعد أن كنت على دراية بالخلية أنواع27.

النمط الظاهري الأيضية يمكن تقييم في أو بعد أسبوعين (14 يوما) من الإدراج دهت. ومع ذلك، آثار دهت على التمثيل الغذائي في نهاية الأسبوع الرابع (28 يوما) هي قليلاً يخفف، على الرغم من أن يتم ملاحظة لا تخفيف للخلل في الإنجاب. ولذلك، علينا أن نقيم وظيفة الأيض عادة في نهاية 2، 3، 5، 6، 7 أسابيع (14، 21، 35، 42 و 49 يوما، 2 مرات مجموع الإدراج). هو إنتاج الكريات بطء الإفراج عن المنشطات في المختبر تقنية ناضجة وقد اعتمدت على نطاق واسع بمختبرات مختلفة33،34.  وهو يمثل بديلاً فعالاً من حيث التكلفة للمنتجات المتاحة تجارياً، والتي يمكن أن يتجاوز مبلغ 50/بيليه (90 يوم دهت بيليه، 5 ملغ/بيليه، الجيش الجمهوري الأيرلندي، غ-161). المنتج التجاري لديها ميزة لا تحتاج إلى استبداله لمدة تصل إلى 90 يوما، بينما بيليه الموصوفة في هذا التقرير يحتاج إلى استبداله كل 28 يوما. للدراسات على نطاق واسع، أن المحققين قد تجد أنه أكثر اقتصادا لإنتاج الكريات الخاصة بهم حتى مع إضافة العمل المطلوب لاستبدال الكريات كل 4 أسابيع.

كما لاحظ آخرون، نماذج مع غرس دهت المزمن بعد الولادة لا تظهر زيادة LH نابض التردد، وهذا قد يشير إلى مختلف الآليات المرضية من الاندروجين المرتفعة الناجمة عن وظيفة الإنجاب بين التنمية و بداية متأخرة اكتسبت هايبراندروجينيسم. مع أحكام هذا البروتوكول، ونحن قادرة على التحقيق في الذرية الإناث من أمراض مزمنة هايبراندروجينيك السدود. يمكن الاستفادة من هذا النموذج في محاولة لفهم الصحة الإنجابية (مثل جريب التنمية والاباضه (المجاميع صفراء)، والخصوبة) والآثار الأيضية (التمثيل الغذائيمثل السكر أو الدهن وتكوين الجسم ومستودع الدهنية التوزيع). ويضيف لدينا البروتوكول أداة جديدة للتحقيق والإنجابية الاندروجين المرتفعة الناجمة عن الخلل في التمثيل الغذائي؛ وتنأى الفسيولوجيا المرضية الناجمة عن الاندروجين مرتفعة من تلك التي يمكن أن تكون بسبب السمنة. يمكن استخدام هذا النموذج لاستكشاف آثار محددة الأنسجة الاندروجين مرتفعة لدى الإناث. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق المنهجية التي ذكرت هنا لإنتاج دهت بيليه بسهولة لدراسة أخرى هرمونات الستيرويد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء الكشف عنها.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها المعاهد الوطنية للصحة (منح HD068130 R00 إلى جنوب غرب) ومركز أبحاث مرض السكري بالتيمور: الطيارين وجدوى منحة (جنوب غرب).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
  2. Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
  3. de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , 1933719117749761 (2018).
  4. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  5. van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
  6. Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
  7. Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
  8. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  9. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
  10. Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
  11. Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
  12. Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
  13. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  14. Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS? Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
  15. Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
  16. Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome? Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
  17. Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome - a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
  18. Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
  19. Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
  20. Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
  21. Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
  22. Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
  23. Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
  24. Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
  25. Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
  26. van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function? Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
  27. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).
  28. Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
  29. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  30. Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  31. Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
  32. McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
  33. Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
  34. Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).

Tags

الإنمائية البيولوجيا، العدد 140، المبيض المتعدد الكيسات متلازمة، ديهدروتستوسترون (دهت)، استروس سيكليسيتي، الاندروجين، سن البلوغ، نسل الإناث
نموذج الماوس هايبراندروجينيك لدراسة متلازمة تكيس المبيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., … More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter