Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,4, 1,4,5
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

אנו מתארים את התפתחות מודל העכבר PCOS דמוי רזה עם גלולה דיהידרוטסטוסטרון ללמוד הפתופיזיולוגיה של PCOS, הצאצא של סכרים PCOS דמוי אלה.

Abstract

Hyperandrogenemia משחק תפקיד קריטי בתפקוד הרבייה וחילוף אצל נקבות, סימן ההיכר של תסמונת השחלות הפוליציסטיות. פיתוח מודל רזה PCOS דמוי העכבר המחקה נשים עם PCOS הוא בעל משמעות קלינית. ב פרוטוקול זה, נתאר מודל כזה. על-ידי הוספת באורך 4 מ מ של DHT (דיהידרוטסטוסטרון) קריסטל אבקת גלולה (האורך הכולל של גלולה הוא 8 מ מ), מחליף אותו מדי חודש, אנחנו מסוגלים לייצר דגם עכבר דמוי-PCOS עם סרום DHT רמות 2 קיפול גבוה יותר מאשר עכברים לא מושתל דיהידרוטסטוסטרון (DHT-לא). הבחנו תפקוד הרבייה וחילוף ללא שינוי במשקל הגוף ואת הרכב הגוף. בעוד מפגין רמה גבוהה של בעיות פוריות, תת קבוצה קטנה של עכברים הנשי אלה PCOS כמו שאפשר להכנס להריון צאצאיהם מראים עיכוב ההתבגרות טסטוסטרון מוגבר כמבוגרים. המודל הזה PCOS דמוי העכבר רזה הוא כלי שימושי כדי לימוד הפתופיזיולוגיה של PCOS, הצאצא של סכרים PCOS דמוי אלה.

Introduction

Hyperandrogenism היא סימן ההיכר של תסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS) על פי קריטריונים NIH, של עודף אנדרוגן, החברה PCOS (AE-PCOS). נשים עם PCOS יש קושי להיכנס להריון, הגדילו את הסיכון לסיבוכים הריון1. אפילו אם הם להיכנס להריון, צאצאיהם נקבה יש2,של תוצאות בריאותיות שליליות3. מודלים אלו פותחו מגוון אסטרטגיות4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 . מציג תכונות רבות של PCOS (anovulation ו/או לקוי סובלנות גלוקוז, אינסולין) עם משקל גוף מוגבר והשמנה המשויך adipocyte מוגדלת בגודל ובמשקל מוגברת adipocyte ינאו ישנן שתי אסטרטגיות מרכזיות לייצר מודלים המשמשים ללמוד PCOS. אחד הוא טיפול עם רמות גבוהות של אנדרוגנים ישירות (אקסוגני אנדרוגן הכניסה/הזרקת) או בעקיפין (כגון חסימת המרה אנדרוגן לאסטרוגן עם ארומטאז) לאחר הלידה13. נוספת היא על ידי העובר hyperexposure של אנדרוגנים במהלך ההיריון14,15 ללמוד את הצאצא. לדוגמה, הצאצא הנקבה קוף רזוס16,17, כבשים18, מכרסמים שנחשפו לרמות זכר של אנדרוגן במהלך התקופה תוך רחמי לפתח תכונות כמו PCOS בהמשך החיים. מודלים אלה משופרת באופן משמעותי את ההבנה שלנו של אפקטים האנדרוגן, תיכנות העובר ואת ההשפעות הסביבתיות הרחם. עם זאת, מודלים אלה יש מגבלות משלו: 1) חיות לפתח השמנת יתר, לכן קשה להפריד את ההשפעות של hyperandrogenemia לבין השמנת יתר הנגרמת הרבייה מטבולי לקוי; 2) לפני ההריון, נשים עם PCOS כבר מוצג רמות גבוהות של אנדרוגנים, וכך נחשפו oocytes אנדרוגן עודף לפני ההפריה; 3) במינון תרופתי של טסטוסטרון (T) או דיהידרוטסטוסטרון (DHT) המשמש לאחר הלידה או במהלך ההיריון אינן משקפות בהכרח את הסביבה אנדרוגן של PCOS. נמדדו רמות טסטוסטרון ו- DHT נוזל הזקיקים בשחלות ו/או סרום, טסטוסטרון ו- DHT רמות הם מקפלים 1.5 ל 3.9 גבוהה יותר בנשים עם PCOS5,19,20,21 22, ,23 בהשוואה לנשים לא מושפע. יצרנו של העכבר למבוגרים דגם23,24,25 שמתפתח תפקוד הרבייה וחילוף בתוך שבועיים אתחול של חשיפה כרונית DHT מן ההכנסה של גלולה עם 4 מ מ אורך אבקת DHT קריסטל (האורך הכולל של גלולה הוא 8 מ מ). מודל זה מייצר רמות DHT בסרום שנמצאים על קיפול כפול גבוה יותר (המכונה 2xDHT) מזה של בקרת עכברים ללא טיפול DHT. העכברים 2xDHT לא להציג שינויים של לעשות LH, טסטוסטרון, אסטרדיול בסרום הבזליים לא לפתח השמנת יתר, ולהראות משקל דומה השחלות, רמות של כולסטרול, חומצות שומן, לפטין, TNFα ו- IL-623,24, 25 יחסית שולט אפילו עד 3.5 חודשים לאחר DHT ההכנסה23,24,25. בנוסף, על ידי הזדווגות הנקבות שכבר פיתחו תכונות של PCOS, נוכל ללמוד את ההשפעה של hyperandrogenic האימהי סביבה על הבריאות ועל הרבייה מטבולי של הצאצאים15.

הפרדיגמה החדשה (רלוונטי על הקריטריונים NIH וחברה AE-PCOS) מודלים המחלה על ידי ייצור דומה יחסית רמות אנדרוגנים לאלה של נשים עם PCOS 2 - טסטוסטרון גבוה יותר 3-fold או רמות DHT בהשוואה לנשים לא מושפע. עם זאת, מודל זה נשמר על ידי DHT אקסוגני מתמשך ולא hyperandrogenism אנדוגני מתוכנת ברגע DHT נסוגה. המטרה הכוללת של מאמר זה היא להתמקד 1) כיצד להפוך בגדר DHT; 2) כיצד לייצר רזה-PCOS כמו עכבר דוגמן 3) אסטרטגיות כדי להעריך את הצאצאים הנשי של אלה סכרים. אחרים מדידות והערכה של פנוטיפים שאינן מטופלות כתב יד זה אך ניתן למצוא5,15,23,24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כאן, אנו מציגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור הכניסה והכנה של גלולה DHT, ולבדיקת הרבייה וחילוף. העכברים השתמשו במחקר זה היו מעורבים רקע (C57/B6, CD1, 129Sv), היו נשמרות עם אוכל ומים ad libitum במחזור/כהה 14/10 h ב 24 ° C במתקן ברודווי בניין מחקר בבעלי חיים בביה ס אוניברסיטת ג'ונס הופקינס של הרפואה. כל ההליכים אושרו על ידי ג'ונס הופקינס אוניברסיטת חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה.

1. יצירת מודל עכבר דמוי-PCOS

  1. DHT צניפה הכנה
    1. אוטוקלב אבובים silastic לחטא. לחתוך silastic צינורות באורך של 15 מ מ עם סכין גילוח;
    2. חותם צד אחד על ידי הזרקת סיליקון דבק רפואי לתוך הצינור עם מחט קהות 20 גרם המצורפת מזרק 3 מ. המשאבה צריכה להיות מופנמים מ המזרק ולאחר מכן דבק מוכנס לתוך המאגר. המשאבה היא להכניס מחדש, דבק נדחף למטה עד שיתחיל מגיחים המחט. המחט קהות נעשית על ידי חיתוך בצד קצה חד של 20 גרם המחט במספריים חזקים בכל. האורך של סיליקון בצינור צריך להיות יותר מ 2 מ מ כדי לאפשר חיתוך שלאחר הייצור;
    3. לילה יבש; בדוק אם יש בועות אוויר בצד אטום. אלה עם בועות אוויר לא משמשים כדורי DHT. אחרים יכולים לשמש כדורי הבקרה לא-DHT.
    4. ללבוש כפפות, מסיכה, משקפי מגן, חלוק המעבדה לפני ביצוע DHT-גלולה בשכונה כדי להימנע מחשיפה DHT העור.
    5. אבקת DHT לשפוך לתוך פלסטיק שוקלים הסירה ולחץ הצד הפתוח של הדבק הכתיר צינורות (מיוצר A1.1) לאבקה DHT.
    6. אבקת DHT יכול להיות מהודקת עם מהדק נייר גדול זה הוא straightened.  המשך עד DHT המגיע לגובה של 4 מ מ (או באורך הרצוי). בדוק את האורך של DHT עם סרגל, לאטום את הצד הפתוח עם סיליקון, יבש למשך הלילה.
    7. חותכים כל צד אטום כדי להפוך את האורך של סיליקון באורך של 2 מ מ. האורך הכולל של גלולה יהיה 8 מ מ.
    8. חותם צידי אבובים silastic ריק כמו גלולה שליטה (לא-DHT).
    9. שמור כדורי צינור חרוטי 50 מ ל עטוף בנייר כסף (כדי למנוע חשיפה קלה) בטמפרטורת החדר עד השימוש. כדורי DHT לשמור על יעילות מלאה במשך 3 חודשים לפחות של שטח אחסון.
  2. DHT ההכנסה והחלפת
    1. עד 20 DHT כדורי או שליטה כדורי טובע בנפרד צינור חרוטי 50 מ עם 30 מ ל סליין 0.9% סטרילי במשך 24 שעות ביממה ב- 37 °C עבור equilibration לפני הכניסה.
    2. לפני הניתוח, משטחים וכפפות תעוקר עם clidox, משטחי עבודה מכוסה פלסטיק נקי מגובה מגבוני נייר (משטח כירורגית).  כל הכלים יבואו במגע עם בעלי חיים הם ושוקמו מיציאתם המתקן בבעלי חיים על ידי autoclaving.  מכשירים יורשו יבש וקריר לפני השימוש.
    3. בן חודש 2 נקבות עכברים משמשים (4 – 5 עכברים/כלוב). עכברים מוזרקים intraperitoneally עם חריגות השירותים הווטרינריים (3.5 מ"ג/ק"ג bw), קטמין (78.8 mg/kg bw) באמצעות על מזרק אינסולין. חישובים עבור ערבוב של הרדמה הוא טבלה 1.
    4. לאחר הרדמה נאותה מושגת, כפי שהיא נמדדת על ידי אובדן של הבוהן רפלקס הנשימה מואטת, העכבר להיות הכנה לניתוח.
    5. לחטא את העור של האזור עם betadine בעזרת גזה סטרילי ונקי עם 70% אתנול.  האזור שוב ימותג betadine.
    6. לחתוך חור בסביבות 5 מ מ אורך עם מספריים מתחת לעור ליד הצוואר. שימוש של 10 גרם trochar, גורם מנהרה קטנה (15 מ מ) לכיוון rostral. בגדר נוסף dorsally עם trochar.
    7. הפתח ואז אטומה עם דבק כירורגי. משוער באופן ידני הפצע בקצוות עם מלקחיים וקווים צחצוח עדין כדי להחיל בשכבה דקיקה של דבק נוזלי על קצוות הפצעים משוערת. הצטברות 3 שכבות דק של דבק כדי לוודא שהדבק מופץ באופן שווה על הפצע. הדבק צריך להרחיב 1 ס מ מכל צד של קצוות הפצע. אני בטוח. בתפר או כירורגיים יכול לשמש גם כדי לסגור את החור. לשים עכברים בחזרה לכלוב, שוכן באופן אינדיבידואלי, עם כרית חום להתאוששות. החלפת גלולה כל 4 שבועות כדי לשמור על רמה קבועה של חשיפה אנדרוגן. בגדר המקורי יוסרו, גלולה החדש יתווסף כפי שמתואר A1.15 במצב דומה.
    8. בדיקה לאחר תקופת היובש estrous אחרי 3 ימים של DHT ההכנסה. ייחום הבמה מוערך על ידי ציטולוגיה הנרתיק.  תאי נרתיק נאספים 16 ימים רצופים על-ידי שימוש pipettor p10 להשפריץ מלח סטרילית (µL סביב 10) לתוך חלל הנרתיק ואז פורש את תמיסת המלח עם קצה פיפטה עקר אותו.  תאי נרתיק sloughed של קיר הנרתיק לערבב עם תמיסת מלח, נאספים.
    9. מורחים תמיסת מלח עם תאים לשקופית עם תוויות. כל שקופית יכול להכיל ששת המדגמים. שקופיות מסומנות לציין איזו דגימה ממוקמת בכל אחד מהמיקומים שש.
    10. לאחר מלוחים יש לגמרי התייבש בשקופית, לשים שקופיות לתוך מיכל עם 100% אתנול לתקן תאים. שקופיות להיות קבועה לפחות 5 דקות, אך יכול להישאר לשבועיים ללא הגבלת זמן עד שימוש נוסף.
    11. להכניס שקופיות פתרונות מכתימים 1 דקות כל עבור מאגר B ושקופיות ג לשטוף עם מים מהברז ויבש בטמפרטורת החדר.
    12. בדוק מורפולוגיה תאים במיקרוסקופ 10 X אובייקטיבית אור.  מורפולוגיה לתא להבחין proestrus (P), ייחום (E), metestrus (ז), diestrus (ד) מתואר הפניות27,28,29.
    13. ספירת הימים בכל שלב ומופרדים המספר הכולל של ימים כדי לחשב את אחוז הזמן בכל שלב.
    14. מבחן גלוקוזה ב 21 ימים לאחר ההוספה DHT על ידי צום העכברים בן לילה (16 שעות), הזרקת דור 2/ק"ג משקל גוף של dextrose 20% intraperitoneally. לדוגמה, אם משקל הגוף העכבר 25 גרם, העכבר הזה להיות מוזרק עם 250 µL של 20% דקסטרוז עם מזרק אינסולין 50 cc (0.5 מ ל). רמות הגלוקוז הם מוערך על ידי רצועות סוכר ובדיקה באמצעות דגימת דם וריד הזנב-0, 15, 30, 60, 90, 120 דקות. זה מתואר ב פירוט במקום30.
  3. איסוף דם
    1. לאסוף דם שונים ימים לאחר ההוספה DHT (אנחנו נגביל אוסף נפח µL 100 על סטרואידים, 30ul עבור LH/FSH assay) בין 9 ל-10 בבוקר על ידי submandibular הווריד. מדמם עם lancet. זה מתואר ב-11.
    2. צנטריפוגה דם ב x 6,000 g ב- 4 ˚C למשך 10 דקות, ולאסוף את השכבה סרום לתוך צינור 1.5 mL אחר שניתן לאחסן ב- 80 °C עד וזמינותו.

2. להעריך את הרבייה פרופילים של הצאצאים הנשי של DHT באופן כרוני מוכנס סכרים

  1. הזדווגות
    1. העכבר הנשי להיבדק מועברת לתוך הכלוב עם זכר מפרה מוכחת (שהיה לה בעבר הגורים עם עכבר נקבה)-15 ימים לאחר הכניסה גלולה.
    2. המסמך משקל הגוף של סכר כל שבוע כדי לקבוע אם העכבר בהריון. סכר משקל בעליות של יותר מ 3 g תוך שבוע מצביעה על הריון.
    3. איסוף הדם של סכרים השבוע השני לאחר שאנו צופים משקל הגוף מוגברת של סכרים גדול יותר מאשר 3g של שבוע לפני.
  2. גיל ההתבגרות לאומדן פתח הנרתיק, ייחום ראשון
    1. בדוק את פתח הנרתיק על-ידי בדיקה ויזואלית כל יום לאחר הגורים נגמלים ביום 21 אחרי לידה (PND), למדוד את המרחק anogenital ולהקליט הגיל של פתח הנרתיק.
    2. פעם נפתח הנרתיק, לאסוף תאי נרתיק מדי יום, כפי שמתואר 1.2.8–1.2.11 כדי לבדוק estrous לאחר תקופת היובש.
    3. להתבונן תא מורפולוגיה כפי שמתואר 1.2.12, ייחום ראשון מוגדר לתאריך כי כל התאים הם תאי אפיתל cornified.
  3. אגרוף במשקל ועל אוזנו הגוף
    1. טובלים את הטיפ נולד לתוך העיסה קעקוע לסמן כל pup עם קעקוע על הבוהן, כפי שמתואר הפניה12 -7 PND ואני שוקל עכברים מדי 7 ימים עד 70 ימים של גיל.
    2. עכברים ניקוב האוזן צריכים למספר אותם באמצעות מערכת איור 1 בין 12 עד 16 PND. כדי להבחין בין מין, לבחון בצד הגחוני של הגוף, הנקבות יהיה גלויים הפטמות.
    3. לאסוף את הדם-21, 26, 70 PND לאחר הלידה כפי שמתואר לעיל 1.3.1
  4. Assay הורמונלי
    1. רמות DHT בנסיוב הדם נמדדים על ידי שניהם מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית טנדם מסה ספקטרומטר (LC-MS)23,24,31,32. T נמדד על ידי LC-MS, או עכברוש/עכבר אליסה זה אומת על-ידי אוניברסיטת וירג'יניה ליגנד Assay הליבה במרכז לחקר רבייה23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רמות DHT בסרום ובדיקה סובלנות גלוקוז

רמות DHT נמדדו מסרום שנאספו על ידי שני אליסה ועל ידי LC-MS לפי פרוטוקול 1.24 – 1.25, 2.9, 3.0. הערכים המוחלטים של DHT שונים בין ספקטרומטר מסה, אליסה, עם זאת, כאשר הקיפול יחסית (בסביבות 2-fold) של DHT לעומת לא-DHT ההכנסה של שני מבחני ודי דומה על פני ניסויים15,23,24 ( איור 2A).  רמות DHT באופן משמעותי הוגדלה מ לפני הריון דרך הריון בעכברים DHT וגם לא-DHT, עם זאת, רמות DHT קיפול כפול גבוה בעכברים DHT בהשוואה העכברים לא-DHT בשני pregestational (יום אחד לפני ההזדווגות), הריון (בסביבות 14 ימים) נקודות זמן (איור 2B). מאז ברמות המוחלטות של DHT שונים בין אליסה LC-MS, נוכל לחשב את רמות היחסי (מקפלים שינוי: רמת DHT עם DHT ההכנסה לעומת לא-DHT ההכנסה) בתוך מבחני. עכברים נקבה עם DHT הראו ליקויי גלוקוזה ביחס לא-DHT (איור 3) ב 2 שבועות בעקבות DHT ההכנסה על פי פרוטוקול 1.23.

הצאצאים נקבה גוף משקל, גיל ההתבגרות

אמנם בדרך כלל עקרים, כמה סכרים להריון ויש הגורים (בסביבות 30% שעור ההריונות, אז בדיקות פוריות של 10 dams לנו בדרך כלל לקבל 3 סכרים בהריון, עיין פרוטוקול 2.1). אנחנו ולכן ניתן להעריך כרונית אנדרוגן תופעות סכרים על הצאצאים הנשי. הצאצאים הנשי של DHT מוכנס סכרים נקראים DHT-בנות, ואילו אלה של לא-DHT מוכנס סכרים נקראות בנות לא-DHT. הבחנו אין הבדל בין לא-DHT DHT-בנות לגיל של פתח הנרתיק. עם זאת, ייחום ראשון של DHT-הבנות מתעכב באופן משמעותי (היום 35 לבת לא-DHT; ליום DHT-בת 42). . זה קשור עם משקל הגוף מופחתת ב- PND 35 והן 42 ב- DHT-בנות יחסית בנות לא-DHT (איור 4; עיין פרוטוקול 2.4 – 2.7).

רמות ההורמונים, estrous לאחר תקופת היובש בצאצאים הנשי

רמות הטסטוסטרון לא ישונה-21 PND, אבל הם מופחת ב 26PND. עם זאת, טסטוסטרון הוא גדל ב 70 PND (איור 5, עיין פרוטוקול 2.9 – 3.0). למבוגרים דיהידרוטסטוסטרון הבנות הראה הפרעת estrous לאחר תקופת היובש לעומת הבנות לא למבוגרים-DHT, שנתקל פעמים משמעותית יותר ב- M/D ופחות זמן P ו- E (איור 6A, B; על פי שיטת פרוטוקול 1.17 – 1.22).

Figure 1
איור 1: העכבר זיהוי. בתוך כלוב אחד, עכבר היא האוזן אגרוף במיקום שונה כדי לייצג מספר העכבר. העכבר #1 עד 3. הוא ניקב על האוזן הימנית, #4 כדי 6 הוא חבט על האוזן השמאלית צפו ב dorsally. אם העכבר הוא חבט על אוזניים במיקום #1 ו #4, זה #7; 2 ו- 5, הוא #8; 3 ו 6 הוא #9; ב אמצע האוזן השמאלית היא #10; במיקום 1 ו- 10 הוא #11; וכו אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סרום DHT רמות. רמות DHT בסרום. (א) רמות DHT סרום נמדדים על ידי אליסה והן ספקטרומטריית. הערכים המוחלטים אמנם שונים, מבחני שני הראה דומה מקפלים ההבדלים בין DHT לא-DHT מטופלים עכברים. (B) בסרום DHT קיפול שינוי ביחס רמות-DHT בנקודות preconceptional וזמן ההיריון. לא-DHT (הסורגים פתוח) ועכברים מושתל-DHT (קווים שחורים) נקבה לפני (יום אחד לפני ההזדווגות) בזמן ההיריון (בסביבות 14 ימים של ההיריון). ערכים הם רעים ±S.E.M. N = 5-8 לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: בדיקת הגלוקוז סובלנות (GTT). לא-DHT ועכברים DHT מושתל היו התענה בן לילה גלוקוז (2 g/kg BW) הוזרק intraperitoneally ו הגלוקוז בדם הזנב נמדד בנקודות זמן שונות. DHT מטופלים עכברים הראו רמות הגלוקוז ולעלייה משמעותית בין 30 עד 120 דקות לעומת לא-DHT מטופלים עכברים. ערכים הם רעים ±S.E.M. N = 4-12 לכל קבוצה. * P < 0.05 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: טיפול DHT אימהי שלפני ההריון, גרמו משקל הגוף מופחתת בצאצאים הנשי-PND 35 ו- 42- משקל הגוף (ציר y) נמדד בימים אחרי לידה כפי שמוצג (ציר x). הצאצאים חשופים DHT: פס שחור; אין צאצאים – DHT: בר פתוח. ערכים הם רעים ±S.E.M. N = 9-14 לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: סרום DHT רמות. דם נאסף בבוקר על PND 21, 26, 70 בבוקר. סרום DHT רמות (ציר y) מנקבה צאצאי בנותיו לא-DHT (הסורגים פתוח) ובנות DHT (קווים שחורים). ערכים הם רעים ±S.E.M. N = 5-11 לכל קבוצה. דמות זו שונתה אסמכתא2אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: כרונית אימהי אנדרוגן עודף מוביל מופרע לאחר תקופת היובש של בנות למבוגרים. (א) ייצוג estrous לאחר תקופת היובש של הצאצאים הנשי. (B) אחוז הזמן בילה בכל שלב estrous (ציר y) במהלך 15 ימים (ציר x) נמדד בבדיקה cytological של תאי נרתיק. ערכים הם רעים ±S.E.M. N = 5-9 לכל קבוצה. השלב ייחום (ציר y). M/D: פגשתי/diestrus; P: proestrus; E: ייחום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: קוקטייל קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hyperandrogenism היא תכונה מרכזית של PCOS. סרום DHT רמות (שני לקפל גבוה בעכברים DHT מאשר בעכברים לא-DHT) בשימוש פרוטוקול זה נמוכים יותר מאלה שדווחו על-ידי חוקרים אחרים במחקרים קודמים, מכוילים לחקות באופן יחסי נשים עם PCOS5,19, 20,21. שלא כמו דגמים אחרים, מודל DHT 2-fold זה אינו משנה את משקל הגוף ואת הרכב הגוף כולו לעומת לא-DHT עכברים עד 3.5 חודשים לאחר DHT ההכנסה23,24. אלו עכברים DHT מושתל למבוגרים מתוחזקים על ידי DHT אקסוגני מתמיד. למרות הרכב הגוף כולו אינה משתנה, שינוי של מבנה ותפקוד adipocytes נצפתה PCOS רזה נשים20. בחינה זהירה של מחסני שונה היא מוצדקת. נצפתה לאחר תקופת היובש estrous לקוי בתוך שבוע אחד לאחר הכניסה DHT15 ואנו מופחתת פוריות במהלך ההערכה פוריות 3 חודש23.

קבוצת משנה קטנה של DHT מטופלים עכברים הנשי הצליחו להיכנס להריון, צאצא סיפקו הזדמנות להעריך את ההשפעה של hyperandrogenemia קדם הריונית, הריון, הנקה על התפתחות העובר. על מנת לקבל ניסוי מבוקר כראוי, הנקבות הרבייה מרובות נדרשים אשר מחייבת לפחות 10 זוגות ההזדווגות שתוקם. DHT-בנות נחשפים רק DHT במהלך ההיריון ולפני 21 הרשות הפלסטינית. DHT-הבנות הראו משקל הגוף מופחתת לעומת הבנות לא-DHT, המציין כי עודף משקל או השמנה אינה משתנה מבלבלים השפעות פיזיולוגיות שנצפה15.

במחקרים הראשונית, נוכל לאמת את רמות DHT סרום לאורך זמן. מצאנו הבדלים משמעותיים ללא סרום DHT-1, 2, 3 ו- 4 שבועות23,24. רמות DHT אחרי 4 שבועות, לכן, אנו להחליף גלולה DHT כל 4 שבועות. אנו לא מבחינים אפקטים מופחתת של DHT אפילו הם אוחסנו בטמפרטורת החדר במשך 3 חודשים. חשוב דגירה כדורי בתוך תמיסת מלח במשך 24 שעות לפני הכניסה. שלב זה הוא קריטי עבור שחרור אפילו של DHT בגדר (שחרור DHT באיטיות דרך הצנרת silastic). Estrous לאחר תקופת היובש יכול להיבדק אחרי 3 ימים של DHT ההכנסה, ובחן השמצות הנרתיק יכול להיות גם ישירות ב- saline ללא יבש של הכתם תחת מיקרוסקופ אור אחרי אתה מכיר התא סוגי27.

פנוטיפ מטבולית יכול להיות מוערך, או לאחר, שבועיים (14 יום) של DHT ההכנסה. עם זאת, ההשפעות של DHT על חילוף החומרים בסוף השבוע הרביעי (28 ימים) הם מעט הקלוש, למרות הנחתה לא נצפית על תפקוד הרבייה. לכן, אנחנו להעריך תפקוד חילוף החומרים בדרך כלל בקצה של 2, 3, 5, 6, 7 שבועות (14, 21, 35, 42, 49 ימים, פי 2 סה כ ההכנסה). הייצור של שחרור איטי כדורי סטרואידים במעבדה הוא טכניקה בוגרת אומצה באופן נרחב על ידי מעבדות שונות33,34.  הוא מייצג חלופה חסכונית מוצרים זמינים מסחרית, אשר עולה על 50 דולר/גלולה (90 יום DHT גלולה, 5 מ"ג/צניפה, איירה, NA-161). המוצר המסחרי יש היתרון של הצורך לא יוחלף עד 90 ימים, ואילו בגדר שתוארו בדו ח זה צריך להחליף כל 28 ימים. ללימודים בקנה מידה גדול, חוקרים ייתכן שיהיה חסכוני יותר לייצר כדורי שלהם גם עם העבודה נוסף נדרש להחליף כדורי כל 4 שבועות.

כפי שנצפה על ידי אחרים, מודלים עם השרשת DHT כרונית לאחר הלידה אינם מראים LH מוגברת פועמת תדר, זה עשוי להצביע מנגנונים פתולוגיים שונים של האנדרוגן המושרה תפקוד הרבייה בין התפתחותי, בגיל מאוחר רכשה hyperandrogenism. עם פרוטוקול זה, אנחנו יכולים לחקור את הצאצאים הנשי של סכרים hyperandrogenic באופן כרוני. אנחנו יכולים למנף את מודל זה לנסות להבין באופן מלא את הרבייה (למשל זקיק, ביוץ (הקורפוסים lutea) ופיתוח פוריות) ואת ההשלכות מטבולית (למשל מטבוליזם הגלוקוז או שומנים בדם, הרכב הגוף, אדיפוז דיפו הפצה). פרוטוקול שלנו מוסיף כלי חדש כדי לחקור את האנדרוגן המושרה הרבייה מטבולי לקוי; ו dissociates פתופיזיולוגיה הנגרמת על ידי האנדרוגן גבוהות מאלה יכול להיות בגלל השמנת יתר. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה הספציפית רקמות של אנדרוגנים גבוהות אצל נקבות. בנוסף, המתודולוגיה דיווחו כאן לייצור צניפה DHT ניתן להחיל בקלות במחקר של הורמונים סטרואידים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שום דבר לא לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (מענקים R00-HD068130 כדי ייגמר בתיקו), המרכז לחקר הסוכרת בולטימור: טייסים וגרנט היתכנות (כדי ייגמר בתיקו).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
  2. Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
  3. de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , 1933719117749761 (2018).
  4. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  5. van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
  6. Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
  7. Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
  8. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  9. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
  10. Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
  11. Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
  12. Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
  13. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  14. Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS? Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
  15. Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
  16. Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome? Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
  17. Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome - a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
  18. Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
  19. Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
  20. Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
  21. Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
  22. Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
  23. Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
  24. Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
  25. Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
  26. van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function? Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
  27. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).
  28. Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
  29. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  30. Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  31. Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
  32. McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
  33. Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
  34. Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).

Tags

התפתחותית ביולוגיה בעיה 140 השחלות הפוליציסטיות תסמונת דיהידרוטסטוסטרון (DHT) Estrous לאחר תקופת היובש אנדרוגן גיל ההתבגרות צאצא הנשי
מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., … More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter