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Developmental Biology

पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम का अध्ययन करने के लिए एक Hyperandrogenic माउस मॉडल

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,4, 1,4,5
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

हम एक दुबला पीसीओ के विकास का वर्णन dihydrotestosterone गोली के साथ माउस मॉडल की तरह पीसीओ के pathophysiology का अध्ययन करने के लिए और इन पीसीओ से वंश-बांध की तरह.

Abstract

Hyperandrogenemia प्रजनन और चयापचय समारोह में महिलाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम की पहचान है । एक दुबला पीसीओ की तरह माउस मॉडल है कि पीसीओ के साथ महिलाओं की नकल का विकास नैदानिक सार्थक है. इस प्रोटोकॉल में, हम इस तरह के एक मॉडल का वर्णन । एक 4 mm लंबाई DHT (dihydrotestosterone) क्रिस्टल पाउडर गोली डालने से (गोली की कुल लंबाई 8 मिमी है), और यह मासिक की जगह, हम एक पीसीओ का उत्पादन करने में सक्षम हैं-सीरम dht के स्तर के साथ माउस मॉडल की तरह 2 गुना अधिक चूहों से प्रत्यारोपित नहीं dht के साथ (नहीं-dht). हम शरीर के वजन और शरीर की संरचना को बदलने के बिना प्रजनन और चयापचय रोग मनाया । जबकि बांझपन का एक उच्च स्तर का प्रदर्शन, इन पीसीओ के एक छोटे सबसेट की तरह महिला चूहों गर्भवती हो और उनके वंश देरी यौवन और वयस्कों के रूप में वृद्धि हुई टेस्टोस्टेरोन दिखा सकते हैं । इस पीसीओ की तरह दुबला माउस मॉडल पीसीओ और इन पीसीओ की तरह बांधों से वंश की pathophysiology का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है.

Introduction

Hyperandrogenism पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम (पीसीओ) की पहचान NIH मानदंड और एण्ड्रोजन अतिरिक्त और पीसीओ (एई-पीसीओ) सोसायटी के अनुसार है । पीसीओ के साथ महिलाओं को कठिनाई गर्भवती हो रही है और गर्भावस्था जटिलताओं का खतरा बढ़ गया है1. यहां तक कि अगर वे गर्भवती हो, उनकी महिला वंश एक प्रतिकूल स्वास्थ्य परिणाम2,3है । पशु मॉडल विभिंन रणनीतियों4,5,6,7,8,9,10,11 का उपयोग कर विकसित किया गया है , 12 और प्रदर्शन पीसीओ की कई सुविधाओं (डिंबक्षरण, और या बिगड़ा ग्लूकोज और इंसुलिन सहिष्णुता) बढ़ी हुई शरीर के वजन और बढ़े हुए adipocyte आकार और वृद्धि हुई adipocyte वजन के साथ जुड़े मोटापे के साथ. पीसीओ अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि पशु मॉडल का उत्पादन करने के लिए दो प्रमुख रणनीतियों रहे हैं । एक एण्ड्रोजन के उच्च स्तर के साथ सीधे उपचार है (exogenous एण्ड्रोजन इंजेक्शन/सम्मिलन) या परोक्ष रूप से (जैसे aromatase अवरोध करनेवाला के साथ एस्ट्रोजन के लिए एण्ड्रोजन रूपांतरण अवरुद्ध) जन्म के बाद13. एक और14,15 वंश का अध्ययन करने के लिए हमल के दौरान एण्ड्रोजन के भ्रूण hyperexposure द्वारा है । उदाहरण के लिए, रीसस बंदर16,17, भेड़18से महिला वंश, और अंतर्गर्भाशयी अवधि के दौरान एण्ड्रोजन के पुरुष स्तर को उजागर कुतर-जैसे लक्षण जीवन में बाद में विकसित । इन मॉडलों काफी ऊंचा एण्ड्रोजन प्रभाव की हमारी समझ में वृद्धि हुई है, और भ्रूण प्रोग्राम, और गर्भाशय पर्यावरण प्रभाव । हालांकि, इन मॉडलों की अपनी सीमाएं हैं: 1) पशु मोटापा विकसित और यह इसलिए मोटापा प्रेरित प्रजनन और चयापचय रोग से hyperandrogenemia के प्रभाव को अलग करने के लिए मुश्किल है; 2) गर्भावस्था से पहले, पीसीओ के साथ महिलाओं को पहले से ही एण्ड्रोजन के उच्च स्तर का प्रदर्शन, इस प्रकार अंडाणुओं निषेचन से पहले एण्ड्रोजन अतिरिक्त करने के लिए उजागर किया गया है; 3) टेस्टोस्टेरोन की औषधीय खुराक (टी) या dihydrotestosterone (DHT) जन्म के बाद या गर्भ के दौरान इस्तेमाल किया पीसीओ के एण्ड्रोजन वातावरण को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं. टेस्टोस्टेरोन और dht के स्तर डिम्बग्रंथि फुफ्फुसीय द्रव और/या सीरम में मापा गया है, और टेस्टोस्टेरोन और dht के स्तर हैं १.५ से ३.९ गुना उच्च पीसीओ के साथ महिलाओं में5,19,20,21 ,२२,२३ की तुलना में अप्रभावित महिलाएँ हैं. हम एक वयस्क माउस मॉडल बनाया23,24,25 कि 4mm की लंबाई के साथ एक गोली की प्रविष्टि से पुरानी DHT जोखिम की दीक्षा के दो हफ्तों के भीतर प्रजनन और चयापचय रोग विकसित क्रिस्टल DHT पाउडर (गोली की कुल लंबाई 8 मिमी है) । इस मॉडल के बारे में 2 गुना उच्च (2xDHT के रूप में संदर्भित) dht उपचार के बिना नियंत्रण चूहों की तुलना में है कि सीरम DHT का स्तर पैदा करता है । 2xDHT चूहों बेसल सीरम एस्ट्राडियोल, टेस्टोस्टेरोन, LH के परिवर्तन का प्रदर्शन नहीं है और मोटापा विकसित नहीं है, और इसी तरह डिंबग्रंथि वजन, कोलेस्ट्रॉल के सीरम स्तर, नि: शुल्क फैटी एसिड, लेप्टिन, TNFα और IL-623,24, 25 के सापेक्ष भी नियंत्रण के लिए ३.५ महीने DHT प्रविष्टि23,24,25के बाद । इसके अतिरिक्त, महिलाओं है कि पहले से ही पीसीओ की सुविधाओं को विकसित किया है संभोग द्वारा, हम15वंश के चयापचय और प्रजनन स्वास्थ्य पर एक hyperandrogenic मातृ पर्यावरण के प्रभाव का अध्ययन कर सकते हैं ।

इस नए प्रतिमान (NIH के लिए प्रासंगिक और एई-पीसीओ सोसायटी मानदंड) मॉडल पीसीओ के साथ महिलाओं के उन लोगों के लिए एण्ड्रोजन के अपेक्षाकृत समान स्तर का उत्पादन द्वारा रोग 2-से 3 गुना उच्च टेस्टोस्टेरोन या DHT अप्रभावित महिलाओं की तुलना में स्तर । हालांकि, इस मॉडल नित्य exogenous dht द्वारा बनाए रखा है और नहीं क्रमादेशित अंतर्जात hyperandrogenism से एक बार dht वापस ले लिया है । इस अनुच्छेद के समग्र लक्ष्य 1 पर ध्यान केंद्रित करने के लिए) कैसे DHT गोली बनाने के लिए है; 2) कैसे माउस मॉडल की तरह एक दुबला-पीसीओ उत्पन्न करने के लिए; 3) इन बांधों से महिला वंश का मूल्यांकन करने के लिए रणनीति । अन्य माप और phenotypes का आकलन इस पांडुलिपि में संबोधित नहीं कर रहे हैं, लेकिन5,15,23,24,25,26में पाया जा सकता है ।

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Protocol

यहां, हम DHT गोली तैयारी और प्रविष्टि के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है, और प्रजनन और चयापचय परीक्षण के लिए । इस अध्ययन में प्रयुक्त चूहों एक मिश्रित पृष्ठभूमि (C57/B6, CD1, 129Sv) थे और खाद्य और जल विज्ञापन libitum के साथ बनाए रखा गया था एक 14/10 में 24 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश/जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय के स्कूल में ब्रॉडवे रिसर्च बिल्डिंग पशु सुविधा में अंधेरे चक्र चिकित्सा. सभी प्रक्रियाओं जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. पीसीओ जैसे माउस मॉडल बनाएं

  1. DHT गोली तैयारी
    1. आटोक्लेव silastic टयूबिंग को निष्फल । कट silastic ट्यूबों एक उस्तरा ब्लेड के साथ 15 मिमी की लंबाई के लिए;
    2. एक ओर सील एक 20 जी कुंद एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी सुई के साथ ट्यूब में चिकित्सा चिपकने वाला सिलिकॉन इंजेक्शन द्वारा एक तरफ । गोताख़ोर सिरिंज से वापस ले लिया जाना चाहिए और फिर जलाशय में डाला चिपकने वाला । गोताख़ोर फिर से डालने का है और चिपकने वाला धक्का दिया जब तक यह सुई से उभरने के लिए शुरू होता है । कुंद सुई किसी भी मजबूत कैंची के साथ 20 जी सुई के तेज टिप पक्ष को काटने के द्वारा किया जाता है । ट्यूब में सिलिकॉन की लंबाई 2 मिमी से अधिक के लिए पोस्ट-उत्पादन ट्रिमिंग के लिए अनुमति देना चाहिए;
    3. रात भर सूखी; सील की ओर हवा के बुलबुले के लिए जांच करें । कोई हवा बुलबुले के साथ उन DHT छर्रों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । दूसरों को कोई-DHT नियंत्रण छर्रों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    4. एक डाकू में dht गोली बनाने से पहले दस्ताने, मुखौटा, काले चश्मे और लैब कोट पहनें त्वचा को dht जोखिम से बचने के लिए ।
    5. एक प्लास्टिक नाव वजन में dht पाउडर डालो और चिपकने वाला छाया ट्यूबों के खुले पक्ष प्रेस (एक 1.1 में उत्पादित) dht पाउडर में ।
    6. DHT पाउडर एक बड़े कागज क्लिप है कि सीधा है के साथ नीचे tamped जा सकता है ।  जारी रखें जब तक DHT 4 मिमी (या वांछित लंबाई) की ऊंचाई तक पहुंच जाता है । एक शासक के साथ DHT की लंबाई की जांच करें, और सिलिकॉन के साथ खुले पक्ष सील, रातोंरात सूखी ।
    7. एक सील पक्ष में कटौती करने के लिए सिलिकॉन की लंबाई 2 मिमी लंबे समय तक बना । गोली की कुल लंबाई 8 मिमी हो जाएगा ।
    8. नियंत्रण के रूप में खाली silastic टयूबिंग के दोनों ओर सील (कोई-DHT) गोली ।
    9. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में छर्रों रखो पंनी के साथ लिपटे (प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए) कमरे के तापमान पर उपयोग तक । DHT छर्रों भंडारण के कम से कम 3 महीने के लिए पूर्ण प्रभावकारिता बनाए रखने ।
  2. DHT सम्मिलन और प्रतिस्थापन
    1. अप करने के लिए 20 DHT छर्रों या नियंत्रण छर्रों एक ५० मिलीलीटर में अलग से जलमग्न कर रहे हैं 30 मिलीलीटर बाँझ ०.९% खारा के साथ 24 घंटे के लिए ३७ डिग्रीसेल्सियस में equilibration के लिए बस प्रविष्टि से पहले.
    2. सर्जरी से पहले, सतहों और दस्ताने clidox से संक्रमित हैं और काम सतहों स्वच्छ प्लास्टिक समर्थित शोषक कागज (सर्जिकल पैड) के साथ कवर कर रहे हैं ।  पशुओं के संपर्क में आने वाले सभी यंत्रों को autoclaving द्वारा पशु सुविधा में दर्ज करने से पूर्व प्रदूषित कर रहे हैं ।  उपकरणों का उपयोग करने से पहले सूखी और शांत करने के लिए अनुमति दी जाएगी ।
    3. 2 महीने की मादा चूहे का इस्तेमाल किया जाता है (4 – 5 चूहे/ चूहों एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर Xylazine (३.५ मिलीग्राम/kg bw) और Ketamine (७८.८ मिलीग्राम/किलोग्राम bw) के साथ intraperitoneally इंजेक्ट कर रहे हैं । मिश्रण और संज्ञाहरण खुराक के लिए गणना 1 तालिकामें है ।
    4. के बाद पर्याप्त संज्ञाहरण हासिल की है, पैर की अंगुली पलटा और धीमा सांस लेने के नुकसान से मापा, माउस शल्य चिकित्सा के लिए prepped किया जाएगा ।
    5. betadine बाँझ धुंध का उपयोग कर के साथ क्षेत्र की त्वचा को संक्रमित और ७०% इथेनॉल के साथ साफ ।  क्षेत्र फिर से betadine के साथ चित्रित किया जाएगा ।
    6. गर्दन के पास त्वचा के नीचे कैंची के साथ 5 मिमी लंबाई के आसपास एक छेद में कटौती । एक 10 ग्राम trochar का प्रयोग, rostral दिशा में एक छोटी सी सुरंग (15 मिमी) बनाते हैं । गोली trochar के साथ पृष्ठीय रूप से डाला जाता है ।
    7. खोलने तो शल्य चिपकने के साथ बंद है । मैन्युअल रूप से लगभग संदंश और कोमल ब्रश स्ट्रोक के साथ घाव किनारों अनुमानित घाव किनारों के लिए तरल चिपकने का एक पतली फिल्म लागू करने के लिए । Buildup चिपकने के 3 पतली परतों को सुनिश्चित करने के लिए चिपकने वाला समान रूप से घाव पर वितरित किया जाता है । चिपकने वाला apposed घाव किनारों के प्रत्येक पक्ष पर 1 सेमी का विस्तार करना चाहिए । टांका या सर्जिकल क्लिप भी छेद बंद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूहों पिंजरे में वापस रखो, व्यक्तिगत रूप से घर में रखा, वसूली के लिए एक गर्मी पैड के साथ । हर 4 सप्ताह गोली की जगह एण्ड्रोजन जोखिम का एक निरंतर स्तर बनाए रखने के लिए । मूल गोली हटा दिया जाएगा और नई गोली के रूप में इसी तरह की स्थिति में एक 1.15 में वर्णित डाला जाएगा ।
    8. DHT लन के 3 दिन बाद टेस् मद cyclicity । मद चक्र चरण योनि cytology द्वारा मूल्यांकन किया जाता है ।  योनि कोशिकाओं को लगातार 16 दिनों के लिए एक p10 pipettor का उपयोग करके एकत्र कर रहे है बाँझ खारा (लगभग 10 µ एल) योनि गुहा में और फिर उसी बाँझ पिपेट टिप के साथ खारा वापस लेने की धार ।  योनि दीवार मिश्रण से खारा के साथ sloughed कोशिकाओं और एकत्र कर रहे हैं ।
    9. किसी लेबल की स्लाइड पर कक्षों के साथ खारा फैलाना. प्रत्येक स्लाइड में छह नमूने हो सकते हैं । स्लाइड नोट करने के लिए जो नमूना छह स्थानों में से प्रत्येक में रखा गया है लेबल हैं ।
    10. के बाद खारा पूरी तरह से स्लाइड पर सूख गया है, १००% इथेनॉल के साथ एक कंटेनर में स्लाइड डाल कोशिकाओं को ठीक करने के लिए । स्लाइड्स को कम से 5 मिनट के लिए तय किया जाना चाहिए, लेकिन आगे उपयोग होने तक निर्धारण अनिश्चित काल में रह सकता है ।
    11. 1 मिनट के लिए प्रत्येक के लिए धुंधला समाधान में स्लाइड रखो नल का पानी और सूखी कमरे के तापमान के साथ स्लाइड और सी. धो स्लाइड्स ।
    12. एक 10x उद्देश्य प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान की जांच ।  कक्ष आकृति विज्ञान भेद करने के लिए proestrus (P), मद (E), metestrus (M) और diestrus (D) संदर्भ में वर्णित है27,28,29.
    13. प्रत्येक चरण में दिनों की गणना और प्रत्येक चरण में प्रतिशत समय की गणना करने के लिए दिनों की कुल संख्या से विभाजित है ।
    14. परीक्षण ग्लूकोज सहिष्णुता पर 21 दिन DHT प्रविष्टि के बाद उपवास द्वारा चूहों रात भर (16 ज) और इंजेक्शन 2 जी/20% डेक्सट्रोज intraperitoneally के शरीर का वजन । उदाहरण के लिए, यदि कोई माउस बॉडी वेट 25 g है, तो इस माउस को ५० cc (०.५ mL) इंसुलिन सिरिंज के साथ 20% डेक्सट्रोज के २५० µ l के साथ इंजेक्ट किया जाएगा. ग्लूकोज का स्तर 0, 15, 30, ६०, ९०, १२० मिनट पर पूंछ नस से रक्त नमूना द्वारा ग्लूकोमीटर और परीक्षण स्ट्रिप्स द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं । इस विस्तार में वर्णन किया गया है कहीं30।
  3. रक्त संग्रह
    1. DHT सम्मिलन के बाद विभिन्न दिनों में रक्त एकत्र (हम FSH के लिए १०० µ एल के लिए संग्रह मात्रा सीमा और 30ul LH के लिए) 9 और 10 के बीच अवअधोहनुज नस नुकीला के साथ खून बह रहा द्वारा हूं । यह11में वर्णित है ।
    2. 10 मिनट के लिए 4 ˚सी में ६,००० x g पर रक्त केंद्रापसारक, और एक और १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सीरम परत इकट्ठा कि पर संग्रहीत किया जा सकता है-८० डिग्रीसेल्सियस तक परख ।

2. जीर्ण DHT डाला बांधों से महिला वंश के प्रजनन प्रोफाइल का आकलन

  1. संभोग
    1. मादा माउस का परीक्षण किया जा करने के लिए एक सिद्ध उपजाऊ पुरुष के साथ पिंजरे में ले जाया जाता है (है कि पहले से एक महिला माउस के साथ पिल्ले था) 15 गोली प्रविष्टि के बाद दिन ।
    2. दस्तावेज़ है बांध शरीर वजन हर हफ्ते अगर माउस गर्भवती है यह निर्धारित करने के लिए । एक सप्ताह में 3 ग्राम से अधिक के बांध का वजन बढ़ता है गर्भावस्था इंगित करता है ।
    3. बांधों के रक्त इकट्ठा दूसरे सप्ताह के बाद हम बांधों की वृद्धि हुई शरीर के वजन से पहले सप्ताह से 3 जी से अधिक का पालन करें ।
  2. यौवन का मूल्यांकन योनि खोलने और पहली मद द्वारा
    1. दृश्य निरीक्षण द्वारा योनि खोलने की जांच करें हर दिन पिल्ले के बाद 21 प्रसव के दिन (PND) में प्रातः, anogenital दूरी को मापने और योनि खोलने की उम्र रिकॉर्ड.
    2. एक बार योनि खोलता है, दैनिक योनि कोशिकाओं को इकट्ठा, के रूप में 1.2.8 में वर्णित – 1.2.11 मद cyclicity जांच करने के लिए ।
    3. 1.2.12 वर्णित के रूप में कक्ष आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें, और पहले मद की तिथि के रूप में परिभाषित किया गया है कि सभी कोशिकाएं cornified उपकला कोशिकाएं हैं ।
  3. शरीर के वजन और कान पंच
    1. टैटू पेस्ट में नुकीला टिप डुबकी और निशान के रूप में 7 PND पर संदर्भ12 में वर्णित के रूप में पैर की अंगुली पर टैटू के साथ प्रत्येक पिल्ला, और वजन चूहों हर 7 दिन उंर के 70days तक ।
    2. कान पंच चूहों उन्हें 12 से 16 PND के बीच चित्रा 1 में प्रणाली का उपयोग कर नंबर करने के लिए । सेक्स भेद करने के लिए, शरीर के ventral पक्ष की जांच, महिलाओं दिखाई निपल्स होगा ।
    3. 1.3.1 में ऊपर बताए अनुसार जन्म के बाद 21, 26, ७० PND पर रक्त एकत्रित करें
  4. हार्मोनल परख
    1. रक्त सीरम में DHT का स्तर दोनों एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) और तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS)23,24,31,३२द्वारा मापा जाता है । टी नियंत्रण रेखा से मापा जाता है-MS, या एक चूहा//माउस एलिसा है कि प्रजनन23,24में अनुसंधान के लिए केंद्र में वर्जीनिया Ligand परख कोर के विश्वविद्यालय द्वारा मांय किया गया है ।

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Representative Results

सीरम DHT का स्तर और ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण

DHT का स्तर दोनों एलिसा द्वारा एकत्र सीरम से मापा और LC-MS प्रोटोकॉल के अनुसार 1.24-1.25, और २.९, ३.० थे । dht निरपेक्ष मूल्यों जन स्पेक्ट्रोमेट्री और एलिसा के बीच अलग हैं, तथापि, रिश्तेदार गुना (लगभग 2-गुना) dht बनाम कोई dht प्रविष्टि दोनों परख और प्रयोगों के पार15,23,24 से समान है ( चित्र 2a) ।  dht का स्तर काफी दोनों dht और कोई-dht चूहों में गर्भावस्था के माध्यम से पक्षपात से बढ़ रहे हैं, तथापि, dht का स्तर 2-dht चूहों की तुलना में दोनों गर्भावधि (एक दिन संभोग से पहले) और गर्भावधि (चारों ओर 14 दिन) में उच्च गुना कर रहे हैं समय अंक (चित्रा बी) । dht के निरपेक्ष स्तर के बाद से एलिसा और नियंत्रण रेखा के बीच अलग-एमएस, हम रिश्तेदार के स्तर की गणना (परिवर्तन: dht सम्मिलन के साथ dht स्तर बनाम नहीं-dht सम्मिलन) परख के भीतर । dht के साथ महिला चूहों बिगड़ा ग्लूकोज नहीं-dht के सापेक्ष सहिष्णुता दिखाया (चित्रा 3) 2 सप्ताह में १.२३ प्रोटोकॉल के अनुसार dht प्रविष्टि के बाद ।

महिला वंश शरीर वजन और यौवन

जबकि आम तौर पर ऊसर, कुछ बांधों गर्भवती हो और पिल्ले है (लगभग 30% गर्भावस्था दर, तो परीक्षण प्रजनन क्षमता 10 बांधों हम आम तौर पर मिल जाएगा 3 गर्भवती बांधों, प्रोटोकॉल के लिए देखें २.१) । इसलिए हम मादा वंश पर बांधों में पुरानी एण्ड्रोजन प्रभाव का मूल्यांकन कर सकते हैं । dht डाला बांधों से महिला वंश dht कहा जाता है-बेटियों, और कोई नहीं से उन-डाला बांध dht कहा जाता है, नहीं dht बेटियों । हम नहीं-dht और dht-योनि खोलने की उंर के लिए बेटियों के बीच कोई अंतर नहीं देखा । हालांकि, dht के पहले मद-बेटियों काफी देरी (दिन ३५ के लिए नहीं dht बेटी है, dht के लिए दिन ४२-बेटी) । यह दोनों ३५ में कम शरीर के वजन के साथ जुड़ा हुआ है और ४२ dht में PND-बेटियों के सापेक्ष नहीं-dht बेटियों (आंकड़ा 4; प्रोटोकॉल को देखें 2.4-2.7) ।

महिला वंश में हार्मोनल स्तर और मद cyclicity

टेस्टोस्टेरोन का स्तर 21 PND में बदल नहीं रहे हैं, लेकिन 26PND पर कम कर रहे हैं. हालांकि, टेस्टोस्टेरोन ७० PND में वृद्धि हुई है (चित्रा 5, प्रोटोकॉल 2.9 – 3.0 करने के लिए देखें). वयस्क dht बेटियों दिखाया बाधित मद cyclicity की तुलना में वयस्क नहीं, DHT बेटियों, एम में काफी लंबे समय का अनुभव/डी और पी और ई में कम समय (चित्रा 6A, बीके अनुसार प्रोटोकॉल में 1.17-1.22) विधि ।

Figure 1
चित्र 1: माउस पहचान । एक पिंजरे के भीतर, माउस माउस संख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए अलग स्थिति में छिद्रित कान है । माउस #1 3 के लिए सही कान पर छिद्रित है, और 6 के लिए #4 बाएं कान पर छिद्रित है पृष्ठीय देखा । यदि माउस कान पर दोनों #1 और #4 स्थिति में छिद्रित है, यह #7 है; पर 2 और 5, #8 है; पर 3 और 6 #9 है; बाएं कान के बीच में #10 है; पर 1 और 10 स्थिति #11 है; आदि मौजूद थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सीरम DHT का स्तर । सीरम DHT का स्तर । (क) सीरम DHT का स्तर दोनों एलिसा और मास-स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा जाता है । हालांकि निरपेक्ष मूल्यों अलग हैं, दो परख dht और नहीं, चूहों का इलाज dht के बीच समान गुना मतभेद दिखाया । (ख) सीरम dht के सापेक्ष परिवर्तन गैर-dht के स्तर पर गर्भाधान और गर्भावधि समय अंक । नहीं-dht (खुली सलाखों) और dht-प्रत्यारोपित (काली सलाखों) महिला चूहों से पहले (एक दिन संभोग से पहले) और गर्भावस्था के दौरान (लगभग 14 हमल के दिन) । मान ± S.E.M. N = 5-8 प्रति समूह का अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (GTT). कोई-dht और dht प्रत्यारोपित चूहों रात भर उपवास किया गया और ग्लूकोज (2 ग्राम/kg BW) intraperitoneally इंजेक्ट किया गया था, और पूंछ रक्त ग्लूकोज अलग समय बिंदुओं पर मापा गया था । dht इलाज चूहों में काफी वृद्धि हुई 30 से १२० मिनट के बीच ग्लूकोज का स्तर नहीं-dht इलाज चूहों की तुलना में दिखाया । मान ± S.E.M. N = 4-12 प्रति समूह का अर्थ है । * P < 0.05 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पूर्व गर्भावस्था मातृ DHT उपचार ३५ और ४२ PND में महिला वंश में कम शरीर के वजन में हुई । शरीर का वजन (Y-अक्ष) (X-अक्ष) दिखाया के रूप में प्रसव के बाद के दिनों में मापा गया था । DHT-उजागर वंश: काली पट्टी; नहीं-DHT वंश: ओपन बार । मान ± S.E.M. N = 9-14 प्रति समूह का अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सीरम DHT का स्तर । सुबह में PND 21, 26, ७० पर रक्त एकत्रित किया गया । सीरम dht के स्तर (Y-अक्ष) के महिला वंश से नहीं, dht बेटियों (खुली सलाखों) और dht-बेटियों (काली सलाखों) । मान ± S.E.M. N = 5-11 प्रति समूह का अर्थ है । इस आंकड़े से संशोधित किया गया है संदर्भ2कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: पुरानी मातृ एण्ड्रोजन अतिरिक्त वयस्क बेटियों में परेशान cyclicity के लिए सुराग । (क) महिला वंश के मद cyclicity का निरूपण. (ख) योनि कक्षों की कोशिकाविज्ञान परीक्षा द्वारा मापी गई 15 दिनों (X-अक्ष) के दौरान प्रत्येक मद अवस्था (Y-अक्ष) पर बिताए गए समय का प्रतिशत. मान ± S.E.M. N = 5-9 प्रति समूह का अर्थ है । मद चक्र चरण (Y-अक्ष) । M/D: met/diestrus; प: proestrus; ई: मद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: Ketamine/xylazine कॉकटेल ।

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Discussion

Hyperandrogenism पीसीओ की एक प्रमुख विशेषता है । सीरम dht के स्तर (दो गुना में dht चूहों में अधिक नहीं-dht चूहों) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया पिछले अध्ययनों में अंय जांचकर्ताओं द्वारा सूचित उन से कम है और आनुपातिक5,19पीसीओ के साथ महिलाओं की नकल करने पर तुले हैं, 20,21. अंय मॉडलों के विपरीत, यह 2 गुना dht मॉडल शरीर के वजन और पूरे शरीर नहीं परिवर्तन के साथ तुलना में ३.५ महीने तक dht सम्मिलन23,24के बाद के लिए चूहों dht है । इन वयस्क dht प्रत्यारोपित चूहों नित्य exogenous dht द्वारा बनाए रखा जाता है । हालांकि पूरे शरीर संरचना बदल नहीं है, संरचना और adipocytes के समारोह के परिवर्तन दुबला पीसीओ20महिलाओं में मनाया गया है । विभिन्न डिपो की सावधानी से परीक्षा का वारंट निर्गत है । हम एक सप्ताह के भीतर बिगड़ा मद cyclicity मनाया DHT प्रविष्टि15 के बाद और एक 3 महीने के प्रजननता मूल्यांकन23के दौरान प्रजनन क्षमता कम ।

DHT के छोटे सबसेट इलाज महिला चूहों कि गर्भवती पाने के लिए सक्षम थे और वंश एक पूर्व के प्रभाव का आकलन करने का अवसर प्रदान की गर्भावधि, गर्भावधि और भ्रूण विकास पर नर्सिंग hyperandrogenemia. आदेश में एक अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोग प्राप्त करने के लिए, कई प्रजनन महिलाओं की आवश्यकता है जो आवश्यक कि कम से कम 10 संभोग जोड़े स्थापित किया जाना है । dht-बेटियों ही हमल के दौरान संपर्क कर रहे है और पहले 21 ॄणा । dht-बेटियों की तुलना में कम शरीर के वजन दिखाया नहीं dht बेटियों, यह दर्शाता है कि मोटापा या अधिक वजन मनाया शारीरिक प्रभाव15में एक विस्थापित चर नहीं है ।

प्रारंभिक अध्ययन में, हम समय के साथ सीरम DHT के स्तर की पुष्टि की । हम 1, 2, 3, और 4 सप्ताह23,24में सीरम DHT में कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया । dht स्तर 4 सप्ताह के बाद गिरावट आई है, इसलिए, हम हर 4 सप्ताह DHT गोली की जगह । हम DHT के कम प्रभाव का पालन नहीं भी वे 3 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया गया है । यह बस प्रविष्टि से पहले 24 घंटे के लिए खारा में छर्रों गर्मी के लिए महत्वपूर्ण है । यह कदम भी गोली से dht के रिलीज के लिए महत्वपूर्ण है (धीरे silastic टयूबिंग के माध्यम से जारी dht) । मद cyclicity की जांच की जा सकती है DHT सम्मिलन के 3 दिनों के बाद, और योनि धब्बा भी सीधे खारा में सूखी बिना जांच की जा सकती है और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दाग के बाद आप सेल प्रकार27से परिचित ।

चयापचय phenotype, या के बाद, 2 सप्ताह (DHT सम्मिलन के 14 दिन) में मूल्यांकन किया जा सकता है । हालांकि, चयापचय पर DHT के चौथे सप्ताह के अंत में प्रभाव (28 दिन) थोड़ा तनु हैं, हालांकि कोई क्षीणन प्रजनन रोग के लिए मनाया जाता है । इसलिए, हम चयापचय समारोह के अंत में सामान्य रूप से आकलन 2, 3, 5, 6, 7 सप्ताह (14, 21, ३५, ४२, और ४९ दिन, 2 बार कुल प्रविष्टि). प्रयोगशाला में धीमी गति से जारी स्टेरॉयड छर्रों का उत्पादन एक परिपक्व तकनीक है कि व्यापक रूप से विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया गया है३३,३४.  यह एक लागत प्रभावी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों, जो $50/गोली (९० दिन DHT गोली, 5दिन/गोली, इरा, एनए-१६१) से अधिक कर सकते है विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है । वाणिज्यिक उत्पाद की जरूरत नहीं करने के लिए ९० दिनों के लिए प्रतिस्थापित किया जा करने का लाभ है, जबकि गोली इस रिपोर्ट में वर्णित करने के लिए हर 28 दिनों की जगह की जरूरत है । बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए, जांचकर्ताओं यह और भी जोड़ा काम करने के लिए हर 4 सप्ताह छर्रों की जगह की आवश्यकता के साथ अपने ही छर्रों उत्पादन किफायती मिल सकता है ।

के रूप में दूसरों के द्वारा मनाया, जन्म के बाद पुरानी DHT आरोपण के साथ मॉडल वृद्धि हुई LH गुणवाला आवृत्ति दिखाने के लिए और इस विकास के बीच ऊंचा एण्ड्रोजन प्रेरित प्रजनन समारोह के विभिन्न रोग तंत्र बाहर बात कर सकते हैं और देर-शुरुआत का अधिग्रहण hyperandrogenism. इस प्रोटोकॉल के साथ, हम लंबे समय से hyperandrogenic बांधों से महिला वंश की जांच करने में सक्षम हैं । हम इस मॉडल को पूरी तरह से प्रजनन (जैसे कूप विकास, ovulation (कॉर्पोरा lutea), और प्रजनन क्षमता) और चयापचय परिणाम (जैसे ग्लूकोज या लिपिड चयापचय, शरीर रचना, वसा डिपो को समझने की कोशिश कर सकते हैं वितरण) । हमारे प्रोटोकॉल ऊंचा एण्ड्रोजन प्रेरित प्रजनन और चयापचय रोग की जांच करने के लिए नए उपकरण कहते हैं; और उन है कि मोटापे के कारण हो सकता से ऊंचा एण्ड्रोजन के कारण pathophysiology dissociates । इस मॉडल को महिलाओं में ऊंचा एण्ड्रोजन के ऊतक विशिष्ट प्रभावों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, कार्यप्रणाली DHT गोली उत्पादन के लिए यहां की सूचना आसानी से अंय स्टेरॉयड हार्मोन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ नहीं ।

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान R00-HD068130 करने के लिए S.W.) और बाल्टीमोर मधुमेह अनुसंधान केंद्र: पायलटों और व्यवहार्यता अनुदान (करने के लिए S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

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References

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पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम का अध्ययन करने के लिए एक Hyperandrogenic माउस मॉडल
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Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

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