Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Een muismodel van Hyperandrogenic te bestuderen polycysteus ovarium syndroom

doi: 10.3791/58379 Published: October 2, 2018

Summary

We beschrijven de ontwikkeling van een mager PCOS-achtige muismodel met dihydrotestosteron pellet te bestuderen van de pathofysiologie van PCOS en de nakomelingen van deze PCOS-achtige dammen.

Abstract

Hyperandrogenemia speelt een cruciale rol in functie van de reproductieve en metabole bij vrouwtjes en is het waarmerk van polycysteus ovarium syndroom. Het ontwikkelen van een mager PCOS-achtige muismodel dat nabootst van vrouwen met PCOS is klinisch zinvol. In dit protocol beschrijven we een dergelijk model. Door het invoegen van een 4 mm lengte van DHT (dihydrotestosteron) crystal poeder pellet (totale lengte van pellet is 8 mm), en vervangt het maandelijks, zijn wij in staat om te produceren een muismodel van PCOS-achtige met serum DHT niveaus 2 vouw hoger dan muizen niet geïmplanteerd met DHT (neen-DHT). Reproductieve en metabole dysfunctie waargenomen zonder gewicht en lichaamssamenstelling. Terwijl vertoont een hoge mate van onvruchtbaarheid, een kleine ondergroep van deze vrouwelijke muizen van PCOS-achtige kan zwanger en hun nakomelingen laten zien van vertraagde puberteit en toegenomen testosteron als volwassenen. Dit mager muismodel van PCOS-achtige is een nuttig instrument om te studeren de pathofysiologie van PCOS en de nakomelingen van deze PCOS-achtige dammen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hyperandrogenism is het waarmerk van polycysteus ovarium syndroom (PCOS) volgens de criteria van de NIH en de overtollige androgeen en PCOS (AE-PCOS) samenleving. Vrouwen met PCOS hebben moeite om zwanger en hebben een verhoogd risico van zwangerschap complicaties1. Zelfs als ze zwanger zijn, hebben hun vrouwelijke nakomelingen een gezondheidsrisico resultaten2,3. Dierlijke modellen zijn ontwikkeld met behulp van verschillende strategieën4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 en vertonen veel kenmerken van PCOS (anovulatie en of verminderde glucose en insuline tolerantie) met verhoogd lichaamsgewicht en obesitas verbonden aan de grootte van de uitgebreide adipocyte en adipocyte gewicht toegenomen. Er zijn twee belangrijke strategieën om te produceren van dierlijke modellen die worden gebruikt voor het bestuderen van PCOS. Een is behandeling met hoge niveaus van androgenen rechtstreeks (exogene androgeen injectie/invoeging) of niet indirect (zoals het blokkeren van androgeen conversie naar oestrogeen met aromatase remmer) na geboorte13. Een andere is door foetale hyperexposure van androgenen tijdens dracht14,15 te bestuderen van de nakomelingen. Bijvoorbeeld, ontwikkelen vrouwelijke nakomelingen van rhesus monkey16,17, schapen18en knaagdieren blootgesteld aan mannelijke androgeen uteriene deperiode PCOS-achtige eigenschappen later in het leven. Deze modellen aanzienlijk verbeterd ons begrip van verhoogde androgeen effecten, en foetale programing en uteriene milieu-effecten. Echter, deze modellen hebben hun eigen beperkingen: 1) dieren ontwikkelen obesitas en daarom is het moeilijk te scheiden van de gevolgen van de hyperandrogenemia van obesitas geïnduceerde reproductieve en metabole dysfunctie; 2) vóór zwangerschap, vrouwen met PCOS vertonen al hoge niveaus van androgeen, aldus eicellen zijn blootgesteld aan androgeen overtollige vóór bevruchting; 3) de farmacologische doses van testosteron (T) of dihydrotestosteron (DHT) gebruikt na de geboorte of tijdens de zwangerschap kunnen niet overeen met de androgeen-omgeving van PCOS. Niveaus van testosteron en DHT zijn gemeten in ovariële folliculaire vloeistof en/of serum en testosteron en DHT niveaus zijn 1,5 tot 3,9 vouw hoger bij vrouwen met PCOS5,19,20,21 ,22,23 t.o.v. onaangetast vrouwen. We hebben een volwassen muis model23,24,25 dat reproductieve en metabole dysfunctie binnen twee weken na de opening van chronische DHT blootstelling ten gevolge van het inbrengen van een pellet met 4 mm lengte van ontwikkelt gemaakt Crystal DHT poeder (totale lengte van pellet is 8mm). Dit model produceert serum DHT niveaus die over 2-fold hoger (hierna: 2xDHT) dan die van controle Muizen zonder DHT behandeling. De 2xDHT muizen geen wijzigingen van de basale serum estradiol, testosteron en LH Ken vertonen niet ontwikkelen van obesitas, en Toon vergelijkbaar ovariële gewicht, serum niveaus van cholesterol, vrije vetzuren, leptine, TNFα en IL-623,24, 25 ten opzichte bepaalt zelfs maximaal 3,5 maanden na DHT invoeging23,24,25. Bovendien door de paring vrouwtjes die kenmerken van PCOS al ontwikkeld, kunnen we bestuderen het effect van een hyperandrogenic moeders omgeving op de metabolische en reproductieve gezondheid van de nakomelingen15.

Dit nieuwe paradigma (relevante NIH en AE-PCOS samenleving criteria) modellen de ziekte door het produceren van de relatief vergelijkbare niveaus van androgenen aan die van de vrouwen met PCOS 2 - 3-voudig hoger testosteron of DHT niveaus ten opzichte van onaangetast vrouwen. Dit model wordt echter gehandhaafd door de voortdurende exogene DHT en niet van geprogrammeerde endogene hyperandrogenism zodra DHT wordt ingetrokken. Het algemene doel van dit artikel is gericht op 1) hoe maak je de DHT pellet; 2) hoe te genereren een lean-PCOS zoals muismodel; 3) strategieën te evalueren van de vrouwelijke nakomelingen van deze dammen. Andere metingen en evaluatie van fenotypen worden niet behandeld in dit manuscript maar kunnen worden gevonden in24,25,26,5,15,23,.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor DHT pellet voorbereiding en inbrengen, en voor reproductieve en metabole testen. De muizen gebruikt in deze studie werden een gemengde achtergrond (C57/B6, CD1, 129Sv) en werden onderhouden met voedsel en water ad libitum in een 14/10 h licht/donker cyclus bij 24 ° C in de Broadway onderzoek gebouw dier faciliteit aan de Johns Hopkins University School of Geneeskunde. Alle procedures zijn door de Johns Hopkins Universiteit Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.

1. Maak PCOS-achtige muismodel

  1. DHT pellet voorbereiding
    1. Autoclaaf silastic buis te steriliseren. Silastic buizen snijden aan een lengte van 15 mm met een scheermesje;
    2. Zegel van één kant door het injecteren van medische zelfklevende siliconen in de buis met een afgestompte naald van 20 G, gekoppeld aan een 3 mL spuit. Plunjer moet geschrapt worden van de spuit en vervolgens lijm ingevoegd in het reservoir. De plunjer wordt opnieuw opgenomen en lijm ingedrukt totdat deze begint te blijken uit de naald. De afgestompte naald is gemaakt door het snijden van de kant van de scherpe uiteinde van 20 G naald met een sterke schaar. De lengte van silicium in de buis moet meer dan 2 mm te voorzien in postproductie trimmen;
    3. Droog 's nachts; Controleer op luchtbellen aan de verzegelde kant. Mensen met geen luchtbellen worden gebruikt voor DHT pellets. Anderen kunnen worden gebruikt voor neen-DHT controle pellets.
    4. Draag handschoenen, masker, bril en laboratoriumjas alvorens DHT-pellet in een zuurkast te voorkomen DHT Gasbedwelming met behulp van de huid.
    5. Pour DHT poeder in een plastic wegen boot en druk op de open zijde van de lijm buizen afgetopt (geproduceerd in A1.1) tot de DHT-poeder.
    6. DHT poeder kan omlaag worden aangedruct met een grote paperclip die is rechtgetrokken.  Voortgezet totdat DHT een hoogte van 4 mm (of gewenste lengte bereikt). Controleer de lengte van DHT met een liniaal en verzegel de open zijde met siliconen, droog 's nachts.
    7. Snijd elke verzegelde kant om de lengte van silicium 2 mm lang. De totale lengte van pellet zullen 8 mm.
    8. Zegel van beide kant van lege silastic buis als controle (neen-DHT) pellet.
    9. Houd de korrels in een conische tube van 50 mL, omwikkeld met een folie (om te voorkomen dat blootstelling aan licht) bij kamertemperatuur tot gebruik. De DHT pellets handhaven volledige werkzaamheid gedurende ten minste 3 maanden van opslag.
  2. DHT inbrengen en vervanging
    1. Tot 20 DHT zijn pellets of besturingselement pellets afzonderlijk ondergedompeld in een conische tube van 50 mL met 30 mL steriele 0,9% zoutoplossing gedurende 24 uur bij 37 °C gedurende evenwichtsinstelling net voor de insertdatum.
    2. Voorafgaand aan de operatie, de oppervlakken en handschoenen zijn ontsmet met clidox en het werkoppervlakten zijn bedekt met schone plastic back absorberend papier (het stootkussen van het chirurgische).  Alle instrumenten die in contact met dieren komen zijn ontsmet vóór het binnenrijden van het dier faciliteit in autoclaaf.  Instrumenten kunnen droog en koel voorafgaand aan gebruik.
    3. 2-maand oude vrouwelijke muizen worden gebruikt (4 – 5 muizen/kooi). Muizen zijn intraperitoneally ingespoten met Xylazine (3,5 mg/kg bw) en Ketamine (78,8 mg/kg bw) met behulp van een insuline spuit. Berekeningen voor mengen en doseren van anesthesie is in tabel 1.
    4. Nadat voldoende verdoving wordt bereikt, zoals gemeten door verlies van Teen reflex en ademhaling vertraagde, zal de muis worden klaargestoomd voor chirurgie.
    5. Desinfecteren van de huid van het gebied met betadine met steriel gaas en reinig met 70% ethanol.  Het gebied zal opnieuw worden geschilderd met betadine.
    6. Een gat rond 5 mm lengte met onder de huid in de buurt van de nek scharen. Maak een kleine tunnel (15 mm) met een trochar van 10 G in de rostraal richting. De pellet is dorsally ingevoegd met de trochar.
    7. De opening wordt vervolgens verzegeld met chirurgische lijm. Handmatig bij benadering de wond randen met pincet en zachte poetsen lijnen toe te passen van een dunne film van vloeibare lijm op de randen benaderd wond. Opbouw 3 dunne lagen plakband over de opening om ervoor te zorgen dat de lijm is gelijkmatig verdeeld over de wond. De lijm moet 1 cm aan elke kant van de randen apposed wond uitbreiden. Sutuur (geologie) of chirurgische clips kunnen ook worden gebruikt om te sluiten van het gat. Zet muizen terug in de kooi, individueel gehuisvest, met een warmte pad voor herstel. Vervang pellet elke 4 weken om een constant peil van androgeen blootstelling. De oorspronkelijke pellet zal worden verwijderd en nieuwe pellet wordt ingevoegd zoals beschreven in A1.15 in de vergelijkbare positie.
    8. Test Oestrische cyclicity na 3 dagen van DHT inbrengen. Oestrische cyclus fase wordt beoordeeld door vaginale cytologie.  Vaginale cellen worden verzameld voor 16 opeenvolgende dagen met behulp van een pipet p10 te spuiten steriele zoutoplossing (ongeveer 10 µL) in de vaginale Holte en dan het intrekken van de zoutoplossing met de dezelfde steriele Pipetteer tip.  Vaginale cellen endometriumvoering van de vaginale wand meng met zoutoplossing en worden verzameld.
    9. Gespreide zoutoplossing met cellen op een gelabelde dia. Elke dia kan zes monsters bevatten. Dia's worden aangeduid te merken welk monster is geplaatst in elk van de zes locaties.
    10. Na de zoutoplossing heeft volledig uitgedroogd op de dia, dia's in een container met 100% ethanol cellen vast te zetten. Dia's moeten worden vastgesteld voor ten minste 5 minuten, maar in fixeerspray voor onbepaalde tijd tot verder gebruik kunnen blijven.
    11. Dia's gestoken door kleuring oplossingen voor 1 min voor buffer B en C. Wash dia met kraanwater en droog, bij kamertemperatuur.
    12. Cel morfologie onder een 10 X objectieve lichte Microscoop te onderzoeken.  Cel morfologie te onderscheiden van de proestrus (P), estrus (E), metestrus (M) en diestrus (D) wordt beschreven in verwijzingen27,28,29.
    13. Tellen de dagen in elk stadium en gedeeld door het totale aantal dagen te berekenen percentage tijd in elke fase.
    14. Test glucosetolerantie bij 21 dagen na DHT inbrengen door vasten de muizen 's nachts (16u) en injecteren van 2 g/kg lichaamsgewicht van 20% dextrose intraperitoneally. Bijvoorbeeld, als een muis lichaamsgewicht 25 g bedraagt, zullen deze muis worden ingespoten met 250 µL van 20% dextrose met een 50 cc (0,5 mL) insuline spuit. Glucoseniveaus worden beoordeeld door glucometer en test strips door bemonstering van bloed uit staart ader op 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Dit wordt beschreven in detail elders30.
  3. Bloedinzameling
    1. Verzamelen van bloed op verschillende dagen na DHT inbrengen (wij beperken collectie volume 100 µL voor steroïde en 30ul voor LH/FSH assay) tussen 9 en 10u door submandibulaire ader bloeden met lancet. Dit wordt beschreven in11.
    2. Centrifugeren van bloed bij 6.000 x g bij 4 ˚C gedurende 10 minuten, en het verzamelen van de serum-laag in een andere 1,5 mL-buis die kan worden opgeslagen op-80 °C tot assay.

2. beoordelen van reproductieve profielen van vrouwelijke nakomelingen van chronisch DHT ingevoegd dammen

  1. Paring
    1. De vrouwelijke muis te beproeven wordt verplaatst naar de kooi met een bewezen vruchtbare man (die eerder pups met een vrouwelijke muis) 15 dagen na pellet inbrengen.
    2. Document van dam lichaamsgewicht elke week om te bepalen als de muis zwanger is. Dam gewicht toename van meer dan 3 g een week geeft aan zwangerschap.
    3. Het verzamelen van bloed van dammen de tweede week nadat we verhoogd lichaamsgewicht van dammen groter is dan 3 g van de week daarvoor observeren.
  2. Puberteit beoordeeld door vaginale opening en eerste estrus
    1. Controleren van de vaginale opening door visuele inspectie elke dag nadat pups gespeend zijn op 21 postnatale dag (PND), meet de afstand van de anogenital en de leeftijd van de vaginale opening opnemen.
    2. Zodra vagina opent, verzamelen vaginale cellen dagelijks, zoals beschreven in 1.2.8–1.2.11 om te controleren Oestrische cyclicity.
    3. Cel morfologie als beschreven 1.2.12 te observeren, en de eerste estrus is gedefinieerd als de datum dat alle cellen cornified epitheliale cellen zijn.
  3. Lichaam gewicht en oor punch
    1. Dompel de lancet tip in de tattoo-pasta en elke pup met tatoeage op de teen markeren zoals wordt beschreven in referentie12 7 PND en weeg muizen elke 7 dagen tot 70 dagen oud.
    2. Oor punch muizen om te nummeren hen met behulp van systeem in Figuur 1 tussen 12 tot en met 16 PND. Onderscheid van geslacht, onderzoeken van de ventrale zijde van lichaam, zal vrouwtjes moeten zichtbaar tepels.
    3. Het verzamelen van bloed aan 21, 26, 70 PND na geboorte zoals hierboven beschreven in punt 1.3.1
  4. Hormonale Assay
    1. DHT niveaus in het bloedserum door beide enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) worden gemeten en door vloeistofchromatografie tandem massa spectrometrie (LC-MS)23,24,31,32. T wordt gemeten door LC-MS of een rat/muis ELISA die is gevalideerd door de Universiteit van Virginia Ligand Assay kern in het Center for Research in reproductie23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Serum DHT niveaus en Glucose tolerantie test

DHT niveaus werden gemeten vanaf verzamelde serum door beide ELISA en LC-MS volgens protocol 1,24-1,25, 2.9 en 3.0. De DHT absolute waarden verschillen tussen massaspectrometrie en ELISA, echter de relatieve vouw (rond 2-fold) van DHT vs neen-DHT inbrengen van beide tests vergelijkbaar is en experimenten over15,23,24 ( Figuur 2A).  DHT niveaus zijn aanzienlijk gestegen van vooroordeel door zwangerschap in zowel DHT en neen-DHT Mouses, DHT niveaus zijn echter 2-fold hoger in de DHT Mouses vergeleken met de neen-DHT Mouses op beide pregestational (één dag vóór de paring) en zwangerschapsduur (ongeveer 14 dagen) tijdstippen (figuur 2B). Aangezien absolute niveaus van DHT tussen ELISA en LC-MS verschillen, we berekenen de relatieve niveaus (vouw verandering: DHT niveau met DHT invoeging vs neen-DHT plaatsingskosten) binnen testen. Vrouwelijke muizen met DHT toonde een verminderde glucosetolerantie ten opzichte van neen-DHT (Figuur 3) op 2 weken na DHT inbrengen volgens protocol 1.23.

Vrouwelijke nakomelingen body gewicht en puberteit

Terwijl over het algemeen onvruchtbaar, sommige dammen zwanger en hebben pups (ongeveer 30% zwangerschap tarief, zodat we testen vruchtbaarheid van 10 dammen meestal krijgen 3 zwangere dammen, verwijzen naar protocol 2.1). We kunnen dus chronische androgeen effecten in dammen op de vrouwelijke nakomelingen evalueren. Vrouwelijke nakomelingen van moederdieren DHT ingevoegd DHT-dochters zijn genoemd zijn, en die van neen-DHT ingevoegd dammen neen-DHT dochters. We hebben vastgesteld geen verschil tussen de nee-DHT en DHT-dochters voor de leeftijd van de vaginale opening. De eerste estrus van DHT-dochters is echter aanzienlijk vertraagd (dag 35 voor neen-DHT dochter; dag 42 voor DHT-dochter). Dit is geassocieerd met verminderde lichaamsgewicht bij zowel 35 en 42 PND in DHT-dochters ten opzichte van neen-DHT dochters (Figuur 4; verwijzen naar protocol 2.4-2.7).

Hormonale niveaus en Oestrische cyclicity in vrouwelijke nakomelingen

Testosteron niveaus zijn niet gewijzigd op 21 PND, maar zijn beperkt op 26PND. Echter testosteron op 70 PND is toegenomen (Figuur 5, verwijzen naar protocol 2.9-3.0). Volwassen dochters van DHT toonde verstoord Oestrische cyclicity in vergelijking met volwassen neen-DHT dochters, ervaren aanzienlijk langere tijden in M/D en minder tijd in de P en E (figuur 6A, B; volgens de methode in protocol 1.17-1.22).

Figure 1
Figuur 1: muis identificatie. In een kooi is muis oor geslagen op verschillende positie te vertegenwoordigen van het nummer van de muis. Muis #1 tot 3 is geperforeerd op het rechteroor, en #4 tot en met 6 is geperforeerd op de linker oor dorsally bekeken. Als de muis is geperforeerd op oren op zowel #1 en #4 positie, is het #7; op 2 en 5, is #8; is op 3 en 6 #9; in het midden van de linker oor is #10; op 1 en 10 positie is #11; enz. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Serum DHT niveaus. Serum DHT niveaus. (A) Serum DHT niveaus worden gemeten door zowel de ELISA en de massa-spectrometrie. Hoewel de absolute waarden verschillend zijn, de twee tests bleek soortgelijke vouwen verschillen tussen DHT en neen-DHT Mouses behandeld. (B) Serum DHT vouw verandering ten opzichte van niet-DHT niveaus op preconceptional en zwangerschapsduur tijdstippen. No-DHT (open balken) en DHT-ingeplant (zwarte balken) vrouwelijke muizen vóór (één dag voordat de paring) en tijdens de zwangerschap (ongeveer 14 dagen van de dracht). Waarden zijn gemiddelde ±S.E.M N = 5-8 per groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Glucose tolerantie test (GTT). No-DHT en DHT geïmplanteerd muizen werden 's nachts gevast en glucose (2 g/kg BW) intraperitoneally werd geïnjecteerd en staart bloedglucose werd gemeten op verschillende tijdstippen. DHT behandeld toonde beduidend verhoogd glucoseniveaus tussen 30 tot 120 min in vergelijking met neen-DHT behandeld muizen muizen. Waarden zijn gemiddelde ±S.E.M N = 4-12 per groep. * P < 0.05 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: pre-zwangerschap-moeders DHT behandeling geleid tot verminderd lichaamsgewicht in vrouwelijke nakomelingen op 35 en 42 PND. Lichaamsgewicht (y-as) werd gemeten op postnatale dagen als getoond (x-as). DHT-blootgesteld nakomelingen: zwarte balk; geen nakomelingen-DHT: open bar. Waarden zijn gemiddelde ±S.E.M N = 9-14 per groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Serum DHT niveaus. Bloed is verzameld in de ochtend op PND 21, 26, 70 in de ochtend. Serum DHT niveaus (y-as) van de vrouwelijke nakomelingen van neen-DHT dochters (open balken) en DHT-dochters (zwarte balken). Waarden zijn gemiddelde ±S.E.M N = 5-11 per groep. Dit cijfer is gewijzigd van referentie2Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: chronische moeders androgeen overtollige leidt tot verstoorde cyclicity in volwassen dochters. (A) vertegenwoordiging van Oestrische cyclicity van vrouwelijke nakomelingen. (B) het percentage van de tijd besteed elk stadium Oestrische (y-as) gedurende 15 dagen (x-as) gemeten bij een cytologische onderzoek van vaginale cellen. Waarden zijn gemiddelde ±S.E.M N = 5-9 per groep. De oestrische cyclus stadium (y-as). M/D: ontmoet/diestrus; P: proestrus; E: estrus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Table 1
Tabel 1: Ketamine/xylazine cocktail.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hyperandrogenism is een belangrijk kenmerk van PCOS. Het serum DHT niveaus (twee vouwen hoger in DHT Mouses dan in neen-DHT Mouses) gebruikt in dit protocol lager zijn dan die door andere onderzoekers in eerdere studies gerapporteerd en zijn gekalibreerd om na te bootsen proportioneel vrouwen met PCOS5,19, 20,21. In tegenstelling tot andere modellen verandert dit 2-fold DHT model niets aan het lichaamsgewicht en de samenstelling van het hele lichaam in vergelijking met neen-DHT Mouses voor maximaal 3,5 maanden na DHT invoeging23,24. Deze volwassen muizen DHT geïmplanteerd worden onderhouden door voortdurende exogene DHT. Hoewel het hele lichaamssamenstelling is niet veranderd, heeft wijziging van de structuur en functie van de adipocytes waargenomen in mager PCOS vrouwen20. Een zorgvuldig onderzoek van de verschillende depots gerechtvaardigd is. We verminderde Oestrische cyclicity waargenomen binnen één week nadat DHT invoeging15 en verminderde vruchtbaarheid tijdens een 3 maand vruchtbaarheid evaluatie23.

De kleine ondergroep van DHT behandelde vrouwelijke muizen die konden zwanger te raken en zijn nakomelingen bood een gelegenheid om het effect van pre-gestational, zwangerschapsduur en verpleegkundig hyperandrogenemia op foetale ontwikkeling. Om een goed gecontroleerde experiment, meerdere vrouwelijke fokdieren nodig zijn die vereist dat ten minste 10 paren van paring tot stand worden gebracht. DHT-dochters zijn alleen blootgesteld aan DHT tijdens dracht en vóór 21 PNA. DHT-dochters toonde verminderd lichaamsgewicht in vergelijking met neen-DHT dochters, die aangeeft dat obesitas of overgewicht niet een storende variabele in de waargenomen fysiologische effecten15 is.

In de aanvankelijke studies, we gevalideerd de serum DHT niveaus na verloop van tijd. We vonden geen significante verschillen in serum DHT op 1, 2, 3 en 4 weken23,24. DHT niveaus daalde na 4 weken, dus we vervangen DHT pellet elke 4 weken. We respecteren verminderde effecten van DHT zelfs zij zijn opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende 3 maanden niet. Het is belangrijk om te broeden pellets in een zoutoplossing gedurende 24 uur enkel voor de insertdatum. Deze stap is cruciaal voor zelfs vrijlating van DHT uit de pellet (DHT release langzaam door de slang van de silastic). Oestrische cyclicity kan worden onderzocht na 3 dagen van DHT inbrengen, en vaginale uitstrijkjes kan ook onderzocht worden direct in het zout zonder droog en vlek onder een lichte Microscoop nadat u vertrouwd met de cel27heeft getypt.

Metabole fenotype kan worden beoordeeld op, of na 2 weken (14 dagen) van DHT inbrengen. Echter, de effecten van DHT op metabolisme aan het einde van de vierde week (28 dagen) zijn enigszins verzwakt, hoewel geen demping wordt waargenomen voor reproductieve dysfunctie. Daarom beoordelen we metabolisme functie normaal aan het eind van 2, 3, 5, 6, 7 weken (14, 21, 35, 42 en 49 dagen, 2 keer totaal plaatsingskosten). De productie van langzaamwerkend steroïde pellets in het lab is een volwassen techniek die wijd door verschillende laboratoria33,34is aangenomen.  Het vertegenwoordigt een kosteneffectief alternatief voor verkrijgbare producten, die kan meer dan $50/pellet (90 dag DHT pellet, 5mg/pellet, IRA, nb-161). Het commerciële product heeft het voordeel van niet hoeft te worden vervangen voor maximaal 90 dagen, terwijl de pellet in dit verslag beschreven moet elke 28 dagen worden vervangen. Voor grootschalige studies wellicht onderzoekers zuiniger te produceren hun eigen pellets zelfs met het extra werk nodig ter vervanging van pellets elke 4 weken.

Zoals opgemerkt door anderen, modellen met chronische DHT implantatie na geboorte vertonen geen verhoogde LH Pulsatiele frequentie en dit kunnen wijzen op verschillende pathologische mechanismen van verhoogde androgeen geïnduceerde voortplantingsfunctie tussen ontwikkelings en Late-onset verworven hyperandrogenism. Met dit protocol zijn wij kunnen onderzoeken van vrouwelijke nakomelingen van chronisch hyperandrogenic dammen. We kunnen dit model als u wilt proberen om volledig te begrijpen de reproductieve (bijv . follikel ontwikkeling, ovulatie (corpora lutea) en vruchtbaarheid) en metabolische gevolgen (bijvoorbeeld glucose of lipide metabolisme, lichaamssamenstelling, obesitas depot hefboomeffect distributie). Ons protocol voegt nieuwe tool om te onderzoeken verhoogde androgeen geïnduceerde reproductieve en metabole dysfunctie; en ontbindt de pathofysiologie veroorzaakt door verhoogde androgeen uit die wijten zijn aan obesitas te kan. Dit model kan worden gebruikt om te verkennen van de specifieke effecten van weefsel van verhoogde androgenen bij vrouwtjes. Bovendien, kan de methodologie hier gemeld voor de productie van DHT pellet gemakkelijk worden toegepast op de studie van andere steroïde hormonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (subsidies R00-HD068130 naar S.W.) en de Baltimore Diabetes Research Center: piloten en haalbaarheid subsidie (S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21, (5), 575-592 (2015).
  2. Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125, (6), 1397-1406 (2015).
  3. de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. 1933719117749761 (2018).
  4. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155, (8), 3146-3159 (2014).
  5. van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153, (6), 2861-2869 (2012).
  6. Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102, (3), 226-237 (2015).
  7. Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8, (2), 127-141 (2007).
  8. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93, (3), 69 (2015).
  9. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11, (1), e0146509 (2016).
  10. Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35, (2), 103-108 (2004).
  11. Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32, (3), 183-193 (2014).
  12. Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8, (2), 103-115 (2011).
  13. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93, (3), 69 (2015).
  14. Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS? Hum. Reprod. Update. 23, (4), 421-432 (2017).
  15. Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159, (2), 1242-1252 (2018).
  16. Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome? Hum. Reprod. Update. 11, (4), 357-374 (2005).
  17. Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome - a hypothesis. J. Endocrinol. 174, (1), 1-5 (2002).
  18. Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373, (1-2), 8-20 (2013).
  19. Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102, (11), (2017).
  20. Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101, (11), 4178-4188 (2016).
  21. Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88, (6), 2760-2766 (2003).
  22. Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279, (3), 321-327 (2009).
  23. Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. en20161608 (2016).
  24. Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. en20161553 (2016).
  25. Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314, (4), E353-E365 (2018).
  26. van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function? Reprod. Biol. 14, (1), 32-43 (2014).
  27. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. Appendix 4, Appendix 4I (2009).
  28. Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28, (10), 1670-1681 (2014).
  29. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27, (2), 327-339 (1982).
  30. Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  31. Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156, (7), (2015).
  32. McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121, (3-5), 611-618 (2010).
  33. Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74, (17), 8213-8217 (2000).
  34. Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180, (3), 1423-1431 (2008).
Een muismodel van Hyperandrogenic te bestuderen polycysteus ovarium syndroom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter