Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Hyperandrogenic mus modell å studere polycystisk ovariesyndrom

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,4, 1,4,5
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Vi beskrive utviklingen av en mager PCOS-lignende musemodell med dihydrotestosteron pellet å studere i Patofysiologien ved PCOS og avkom fra disse PCOS-lignende dammer.

Abstract

Hyperandrogenemia spiller en avgjørende rolle i reproduktiv og metabolske funksjon hos kvinner og er kjennetegnet av polycystisk eggstokk-syndrom. Utvikle en mager PCOS-lignende musemodell som etterligner kvinner med PCOS er klinisk meningsfull. I denne protokollen beskriver vi slik modell. Ved å sette inn en 4 mm lengde av DHT (dihydrotestosteron) krystall pulver pellet (totale lengden av pellets er 8 mm), og erstatte den månedlig, er vi i stand til å produsere en PCOS-lignende musemodell med serum DHT nivåer 2 ganger høyere enn mus ikke implantert med DHT (no-DHT). Vi observerte reproduktive og metabolske dysfunksjon uten å endre kroppsvekt og kroppssammensetning. Mens viser en høy grad av ufruktbarhet, en undergruppe av disse PCOS-lignende kvinnelige mus kan bli gravid og deres avkom Vis forsinket puberteten og økt testosteron som voksne. Denne PCOS-lignende mager musemodell er en nyttig verktøyet å studere i Patofysiologien ved PCOS og avkom fra disse PCOS-lignende dammer.

Introduction

Hyperandrogenism er kjennetegnet av polycystisk ovariesyndrom (PCOS) i henhold til NIH kriterier og av Androgen overflødig og PCOS (AE-PCOS) samfunnet. Kvinner med PCOS har problemer med å bli gravid og har økt risiko for graviditet komplikasjoner1. Selv om de bli gravid, har deres kvinnelige avkom en uønskede helse utfall2,3. Dyr modeller er utviklet ved hjelp av ulike strategier4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 og viser mange funksjoner i PCOS (anovulasjon og eller svekket glukose og insulin toleranse) med økt kroppsvekt og fedme forbundet med forstørret adipocyte og økt adipocyte. Det er to viktige strategier for å produsere dyr modeller som brukes til å studere PCOS. En er behandling med høye nivåer av androgener direkte (eksogene androgen injeksjon/innsetting) eller indirekte (som blokkerer androgen konvertering til østrogen med aromatase hemmere) etter fødselen13. En annen er av fetal hyperexposure av androgener under svangerskapet14,15 å studere avkom. For eksempel utvikle kvinnelige avkom fra rhesus monkey16,17, sauer18og gnagere utsatt for mannlige nivåer av androgen under intrauterine perioden PCOS-lignende egenskaper senere i livet. Disse modellene betydelig forbedret vår forståelse av opphøyet androgen effekter, og fosterets programmering og livmor miljømessige effekter. Men disse modellene har sine egne begrensninger: 1) dyr utvikle fedme og det er derfor vanskelig å skille effekten av hyperandrogenemia fra fedme indusert reproduktiv og metabolske dysfunksjon; 2) før svangerskapet, kvinner med PCOS viser allerede høye nivåer av androgen, dermed oocytes har vært utsatt for androgen overflødig før befruktning; 3) den farmakologiske doser av testosteron (T) eller dihydrotestosteron (DHT) etter fødsel eller under svangerskapet kan ikke gjenspeile androgen miljøet av PCOS. Testosteron og DHT nivåer har vært målt i eggstokkreft follikulær væske og/eller serum og testosteron og DHT nivåer er 1.5 til 3,9 ganger høyere hos kvinner med PCOS5,19,20,21 ,22,23 sammenlignet med upåvirket kvinner. Vi laget en voksen mus modell23,24,25 som utvikler reproduktive og metabolske dysfunksjon innen to uker etter initiering av kronisk DHT eksponering fra innsetting av pellets med 4 mm lengde Crystal DHT pulver (totale lengden av pellets er 8mm). Denne modellen gir serum DHT nivåer som om 2-fold høyere (referert til som 2xDHT) enn kontroll mus uten DHT behandling. 2xDHT mus ikke vise endringer av basale serum østradiol, testosteron, LH og gjøre ikke utvikle fedme og Vis lignende ovarian vekt, serum nivåer av kolesterol, frie fettsyrer, leptin, TNFα og IL-623,24, 25 forhold til kontroller med opp til 3,5 måneder etter DHT innsetting23,24,25. I tillegg av mating kvinner som allerede har utviklet funksjonene i PCOS, kan vi studere virkningen av hyperandrogenic mors miljø på metabolske og reproduktive helsen av avkom15.

Denne nye paradigmet (relevant for NIH og AE-PCOS samfunn) modeller sykdommen ved å produsere relativt samme nivå androgener de kvinner med PCOS 2 - til 3 ganger høyere testosteron eller DHT nivåer sammenlignet med upåvirket kvinner. Men er denne modellen vedlikeholdt av kontinuerlig eksogene DHT og ikke fra programmert endogene hyperandrogenism når DHT trekkes. Det overordnede målet med denne artikkelen er å fokusere på 1) Hvordan lage DHT pellet; 2) hvordan å generere en lean-PCOS som musemodell; 3) strategier for å evaluere kvinnelige avkom fra disse dammer. Andre målinger og vurdering av fenotyper nevnes ikke i dette manuskriptet, men finnes i5,,15,,23,,24,,25,,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Her presenterer vi detaljerte protokoller for DHT pellet forberedelse og innsetting og reproduktiv og metabolske testing. Musene som brukes i denne studien var en blandet bakgrunn (C57/B6, CD1, 129Sv) og ble opprettholdt med mat og vann annonse libitum i en 14/10 h lys/mørke syklus på 24 ° C i Broadway forskning bygningen dyr anlegget ved Johns Hopkins University School of Medisin. Alle prosedyrer ble godkjent av Johns Hopkins University Animal Care og bruk komiteen.

1. Opprett PCOS-lignende musemodell

  1. DHT pellet forberedelse
    1. Autoclave silastic slangen å sterilisere. Kuttet silastic rør til en lengde på 15 mm med et barberblad;
    2. Seal ene ved å injisere medisinsk selvklebende silikon inn i røret med en 20 G avstumpet nål festet til en 3 mL sprøyte. Stempelet skal trekkes fra sprøyten og deretter Lim inn i reservoaret. Stempelet settes og lim presset til den begynner å dukke opp fra nålen. Avstumpet nålen er gjort ved å kutte skarp tips siden av 20 G nål med noen sterke saks. Lengden på silisium i røret skal være mer enn 2 mm å tillate etterproduksjon trimming;
    3. Tørr overnatting; Sjekk for luftbobler på forseglet side. De med ingen luftbobler brukes til DHT pellets. Andre kan brukes til ikke-DHT kontroll pellets.
    4. Bruk hansker, maske, briller og Laboratoriefrakk før DHT-pellets i hette å unngå DHT eksponering til huden.
    5. Hell DHT pulver i en plast veie båt og trykk den åpne siden av limet avkortet rør (produsert i A1.1) i DHT pulver.
    6. DHT pulver kan være tamped med en stor binders som er rettet.  Fortsett til DHT når en høyde på 4 mm (evt til ønsket lengde). Kontrollere lengden på DHT med en linjal, og forsegle den åpne siden med silisium, tørre over natten.
    7. Skjær hver forseglet side slik at lengden på silisium 2 mm lang. Den totale lengden på pellet blir 8 mm.
    8. Forsegle begge sider av Tom silastic rør som kontroll (no-DHT) pellets.
    9. Holde pellets i en 50 mL konisk tube innpakket i folie (for å hindre eksponering) ved romtemperatur før bruk. DHT pellets opprettholde full effekt i minst 3 måneder lagringsplass.
  2. DHT innsetting og erstatning
    1. Opptil 20 DHT senkes pellets eller kontroll pellets separat i en 50 mL konisk rør med 30 mL steril 0,9% saltløsning i 24 h på 37 °C for balanse like før innsetting.
    2. Før kirurgi, overflater og hansker er desinfisert med clidox og arbeid overflater er dekket med ren plast støttet tørkepapir (kirurgiske tastaturet).  Alle instrumenter som kommer i kontakt med dyr er dekontaminert før inn dyr anlegget ved autoklavering.  Instrumenter vil kunne tørt og kjølig før bruk.
    3. 2 måneder gamle kvinnelige mus brukes (4-5 mus/cage). Mus er injisert intraperitoneally med Xylazine (3,5 mg/kg bw) og ketamin (78.8 mg/kg bw) bruker en insulinsprøyte. Beregninger for miksing og dosering anestesi er i tabell 1.
    4. Når tilstrekkelig anestesi er oppnådd, målt ved tap av tå refleks og redusert puste, vil musen bli prepped for kirurgi.
    5. Rense huden i området med betadine bruker sterilt gasbind og ren med 70% etanol.  Området vil igjen bli malt med betadine.
    6. Skjære hull rundt 5 mm lengde med saks under huden i nærheten halsen. Bruke en 10 G trochar, lage en liten tunnel (15 mm) i rostral retning. Pellet inn på ryggen med trochar.
    7. Åpningen er deretter forseglet med inngrep lim. Manuelt omtrentlig såret kanter med tang og mild børste gjelder en tynn film av flytende lim til tilnærmet såret kantene. Buildup 3 tynne lag av limet å sikre limet er jevnt fordelt over såret. Limet bør utvide 1 cm på hver side av apposed såret kantene. Sutur eller kirurgisk klipp kan også brukes til å lukke hullet. Sett mus tilbake i bur, individuelt huses, med en heten pute for utvinning. Erstatte pellets hver 4 uker for å opprettholde et konstant nivå av androgen eksponering. Den opprinnelige pellet fjernes og nye pellet settes som beskrevet i A1.15 i den tilsvarende stillingen.
    8. Teste estrous cyclicity etter 3 dager for innsetting av DHT. Estrous syklus scenen vurderes av vaginal cytologi.  Vaginal celler er samlet inn for 16 dager, ved å bruke en p10 hindre for å sprute sterilt saltvann (rundt 10 µL) inn i vaginale hulrommet og deretter trekke saltkildene samme sterilt pipette spissen.  Vaginal celler sloughed vaginal veggen bland med saltvann og er samlet.
    9. Spre saline med celler på et merket lysbilde. Hvert lysbilde kan inneholde seks utvalgene. Lysbilder er merket for å merke som eksempel er plassert i hver av seks stedene.
    10. Etter saltkildene har helt tørket på lysbildet satt lysbilder i en container med 100% etanol fikse celler. Lysbildene skal festes i minst 5 min, men kan forbli i bindemiddel uendelige inntil videre bruk.
    11. Sette lysbilder i flekker løsninger for 1 min hver bufferen B og C. Wash lysbilder med vann fra springen og tørr ved romtemperatur.
    12. Undersøke celle morfologi under 10 X objektiv lett mikroskop.  Celle morfologi å skille proestrus (P), estrus (E), metestrus (M) og diestrus (D) er beskrevet i referanser27,28,29.
    13. Antall dager i hver scene og delt på totalt antall dager å beregne prosent tid på hvert trinn.
    14. Teste glukosetoleranse for 21 dager etter DHT innsetting av faste mus over natten (16 h) og injisere 2 g/kg kroppsvekt av 20% druesukker intraperitoneally. For eksempel hvis en mus kroppsvekt 25 g, vil denne musen bli injisert med 250 µL av 20% druesukker med en 50 cc (0,5 mL) insulinsprøyte. Blodsukkeret vurderes av glukosemåler og test strimler av prøvetaking blod fra halen blodåre på 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutter. Dette er beskrevet i detalj andre steder30.
  3. Blod samling
    1. Samle blod på ulike dager etter DHT innsetting (vi begrense samling volum 100 µL for steroid og 30ul for LH/FSH analysen) mellom 9 og 10 am av submandibular blodåre blødning med lancet. Dette er beskrevet i11.
    2. Sentrifuge blod på 6000 x g ved 4 ˚C i 10 min, og samle serum laget i en annen 1,5 mL tube som kan lagres på-80 °C før analysen.

2. vurdere reproduktiv profiler av kvinnelige avkom fra kronisk DHT inn dammer

  1. Mating
    1. Kvinnelige musen å bli testet er flyttet inn i buret med en bevist fruktbare mann (som har tidligere hatt pups med kvinnelige mus) på 15 dager etter pellet innsetting.
    2. Dokumentere demningen kroppsvekt hver uke om musen er gravid. Dam vekten øker mer enn 3 g i en uke angir graviditet.
    3. Samle blod av dammer andre uke når vi observerer økt kroppsvekt av dammer større enn 3 g fra uken før.
  2. Puberteten vurdert av skjedeåpningen og første estrus
    1. Sjekk skjedeåpningen ved by visuell inspeksjon hver dag etter pups er avvent på 21 postnatal dag (PND), måle avstanden anogenital og registrere en alder av skjedeåpningen.
    2. Når vagina åpnes, samle vaginal celler daglig, som beskrevet i 1.2.8–1.2.11 å sjekke estrous cyclicity.
    3. Observere celle morfologi som beskrevet 1.2.12, og den første estrus defineres som at alle cellene er cornified epitelceller.
  3. Kroppen vekt og øret punch
    1. Dyppe lancet spissen i tatovering lim merker hver pup med tatovering på tå som beskrevet i referanse12 7 PND og veie mus hver 7 dager inntil 70 dager gammel.
    2. Øret punch mus til å nummerere dem bruker i figur 1 mellom 12 til 16 PND. Skille sex, undersøke ventral side av kroppen, vil kvinner ha synlige brystvorter.
    3. Samle blod på 21, 26, 70 PND etter fødselen som beskrevet ovenfor i 1.3.1
  4. Hormonelle analysen
    1. DHT nivåer i blodårene er målt ved begge enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) og av flytende kromatografi tandem masse massespektrometri (LC-MS)23,24,31,32. T er målt ved LC-MS, eller en rotte/mus ELISA som har blitt godkjent av University of Virginia Ligand analysen kjernen i senter for forskning i reproduksjon23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Serum DHT nivåer og glukose toleranse test

DHT nivåer ble målt fra samlet serum ved begge ELISA og LC-MS etter protokollen 1.24-1.25, og 2.9, 3.0. DHT absoluttverdier er forskjellige mellom massespektrometri og ELISA, men relative fold (rundt 2-fold) av DHT vs ikke-DHT innsetting ligner fra begge analyser og over eksperimenter15,23,24 ( Figur 2A).  DHT nivåer er betydelig økt fra preconception gjennom graviditet i både DHT og ingen-DHT mus, men DHT nivåer er 2-fold høyere i DHT mus forhold til no-DHT mus både pregestational (en dag tidligere mating) og svangerskapsdiabetes (rundt 14 dager) tidspunkt (figur 2B). Siden absolutte nivåer av DHT varierer mellom ELISA og LC-MS, vi beregne relative nivåer (kaste endring: DHT nivå med DHT innsetting vs ikke-DHT innsettingspunktet) innen analyser. Kvinnelige mus med DHT viste nedsatt glukosetoleranse i forhold til no-DHT (Figur 3) to uker etter DHT innsetting i henhold til protokollen 1,23.

Kvinnelige avkom kroppen vekt og pubertet

Mens generelt ufruktbare, noen dammer gravid og har pups (rundt 30% suksessrate, slik testing fruktbarhet 10 damer vi vil vanligvis få 3 gravid dammer, refererer til protokollen 2.1). Vi kan derfor vurdere kronisk androgen effekter i demninger på kvinnelige avkom. Kvinnelige avkom fra DHT inn demninger kalles DHT-døtre, og de fra no-DHT inn demninger kalles ikke-DHT døtre. Vi observerte noen forskjell mellom no-DHT og DHT-døtre for aldersgruppen skjedeåpningen. Den første estrus DHT-døtre er imidlertid betydelig forsinket (dag 35 for nei-DHT datter, dag 42 for DHT-datter). Dette er knyttet til redusert kroppsvekt på både 35 og 42 PND i DHT-døtre i forhold til no-DHT døtre (Figur 4; se protokollen 2.4-2.7).

Hormonelle nivåer og estrous cyclicity i kvinnelige avkom

Testosteronnivå er ikke endret på 21 PND, men er redusert til 26PND. Men testosteron er økt på 70 PND (figur 5, se 2.9-3.0-protokollen). Voksne DHT døtre viste forstyrret estrous cyclicity forhold til voksen no-DHT døtre, opplever betydelig lengre tid d og mindre tid i P og E (figur 6A, B, i henhold til metoden i protokollen 1.17-1,22).

Figure 1
Figur 1: mus identifikasjon. Innenfor en bur er musen øret slo på annen posisjon representerer hvor musen. Musen #1 til 3 er stemplet på høyre øre, og #4 til 6 er slått på venstre øre vises på ryggen. Hvis musen er hullet på ørene på både #1 og #4 posisjon, er det #7; 2 og 5, er #8; 3 og 6 er #9; midt på venstre øre er #10; 1 og 10 er #11; osv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Serum DHT nivåer. Serum DHT nivåer. (A) Serum DHT nivåer måles av både ELISA og massespektrometri. Selv om de absolutte verdiene er forskjellige, de to analyser viste lignende brett forskjellene mellom DHT og ingen-DHT behandlet mus. (B) Serum DHT fold endring i forhold til ikke-DHT nivåer på preconceptional og svangerskapsdiabetes poeng. No-DHT (åpne barer) og DHT-implantert (svarte striper) kvinnelige mus før (en dag tidligere mating) og under graviditet (rundt 14 dager av svangerskapet). Verdiene er bety ±S.E.M. N = 5-8 per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: glukose toleranse test (GTT). No-DHT og DHT implantert mus var fastet natten glukose (2 g/kg BW) ble injisert intraperitoneally og hale blodsukker ble målt på ulike tidspunkt. DHT behandlet mus viste betydelig økt blodsukkeret mellom 30 og 120 min sammenlignet med no-DHT behandlet mus. Verdiene er bety ±S.E.M. N = 4-12 per gruppe. * P < 0,05 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: pre-graviditet mors DHT behandlingen resulterte i en redusert kroppsvekt i kvinnelige avkom på 35 og 42 PND. Kroppsvekt (y-aksen) ble målt på stolpe-natal dager som vises (x-aksen). DHT-eksponerte avkom: svart bar; ingen-DHT avkom: åpen bar. Verdiene er bety ±S.E.M. N = 9-14 per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Serum DHT nivåer. Blod var samlet i morgen på PND 21, 26, 70 i morgen. Serum DHT nivåer (y-aksen) fra kvinnelige avkom no-DHT døtre (åpne barer) og DHT-døtre (svarte). Verdiene er bety ±S.E.M. N = 5-11 per gruppe. Dette tallet er endret fra referanse2Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: kronisk mors androgen overflødig fører til forstyrret cyclicity i voksne døtre. (A) representasjon av estrous cyclicity kvinnelige avkom. (B) prosentandelen av tid brukt på hvert estrous Stadium (y-aksen) under 15 dager (x-aksen) målt ved fargemaskin undersøkelse av vaginal celler. Verdiene er bety ±S.E.M. N = 5-9 per gruppe. Estrous syklus scenen (y-aksen). D: møtte/diestrus; P: proestrus; E: estrus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: Ketamin/xylazine cocktail.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hyperandrogenism er et viktig trekk ved PCOS. De serum DHT nivåene (to fold høyere i DHT mus enn i no-DHT mus) brukes i denne protokollen er lavere enn de som rapporteres av andre etterforskere i tidligere studier og er kalibrert for å etterligne proporsjonalt kvinner med PCOS5,19, 20,21. I motsetning til andre modeller endrer ikke denne 2-fold DHT modellen kroppsvekt og hele kroppssammensetning sammenlignet med no-DHT mus for opptil 3,5 måneder etter DHT innsetting23,24. Disse voksen DHT implantert mus vedlikeholdes av kontinuerlig eksogene DHT. Selv om hele kroppssammensetning ikke endres, har endring av strukturen og funksjonen til adipocytter blitt observert i mager PCOS kvinner20. En omsorgsfull undersøkelse av ulike depoter er garantert. Vi observerte svekket estrous cyclicity innen en uke etter DHT innsetting15 og redusert fruktbarhet under en 3 måneders fruktbarhet evaluering23.

Undergruppe av DHT behandlet kvinnelige musene som kunne bli gravid og har avkom gitt en mulighet til å vurdere virkningen av pre-gestational, svangerskapsdiabetes og sykepleie hyperandrogenemia på fosterets utvikling. For å få et riktig kontrollert eksperiment, flere avl kvinner er nødvendig som nødvendiggjør at minst 10 parring par opprettes. DHT-døtre er bare utsatt for DHT under svangerskapet og før 21 PNA. DHT-døtre viste redusert kroppsvekt i forhold til no-DHT døtre, som indikerer at overvekt eller overvekt ikke er en forvirrende variabel i observerte fysiologiske effekter15.

I første studier validert vi serum DHT nivåer over tid. Vi fant ikke signifikante forskjeller i serum DHT på 1, 2, 3 og 4 uker23,24. DHT nivåer avslått etter 4 uker, derfor vi erstatte DHT pellet enhver 4 ukens. Vi følger ikke redusert virkningene av DHT selv de har vært lagret i romtemperatur i 3 måneder. Det er viktig å ruge pellets i saltvann for 24 timer rett før innsetting. Dette trinnet er viktig for med utgivelsen av DHT fra pellet (DHT utgivelse sakte gjennom silastic slangen). Estrous cyclicity kan undersøkes etter 3 dager for innsetting av DHT, og vaginal smear kan også undersøkes direkte i saltvann uten tørr og flekk under lys mikroskop etter at du kjent med cellen typer27.

Metabolsk fenotypen kan vurderes på eller etter 2 uker (14 dager) av DHT innsetting. Men er effekten av DHT på stoffskifte på slutten av den fjerde uken (28 dager) litt svekket, men ingen demping er observert i reproduktive dysfunksjon. Derfor vurderer vi metabolisme fungere normalt på slutten av 2, 3, 5, 6, 7 uker (14, 21, 35, 42 og 49 dager, 2 ganger totalt innsetting). Produksjon av steroid langsom løslate-pellets i laboratoriet er en moden teknikk som er allment vedtatt av ulike laboratorier33,34.  Det representerer et kostnadseffektivt alternativ til kommersielt tilgjengelige produkter, som kan overstige $50/pellet (90 dagers DHT pellets, 5mg/pellets, IRA, NA-161). Kommersielle produktet har fordelen av ikke å måtte erstattes i opptil 90 dager, mens pellet beskrevet i denne rapporten må skiftes hver 28 dager. For omfattende studier, kan etterforskere være mer økonomisk å lage egne pellets selv med ekstra arbeidet som kreves for å erstatte pellets hver 4 uker.

Som observert av andre, modeller med kronisk DHT implantasjon etter fødsel ikke Vis økt LH pulsatile frekvens, og dette kan peke ut forskjellige patologisk mekanismer av opphøyet androgen indusert reproduktive funksjonen mellom utviklingsmessige og sen-utbruddet kjøpt hyperandrogenism. Med denne protokollen er vi undersøke kvinnelige avkom fra kronisk hyperandrogenic damer. Vi kan utnytte denne modellen for å prøve å forstå den reproduktive (f.eks hårsekken utvikling, eggløsning (corpora lutea) og fruktbarhet) og metabolske konsekvenser (f.eks glukose eller lipid metabolisme, kroppssammensetning, adipose depot distribusjon). Våre protokollen legger nytt verktøy undersøke opphøyet androgen indusert reproduksjons- og metabolske dysfunksjon; og dissociates i patofysiologien forårsaket av opphøyet androgen fra de som kan være fedme. Denne modellen kan brukes til å undersøke vev bestemte effekten av opphøyet androgener i kvinner. I tillegg kan metodikken rapporteres her for DHT pellet produksjon lett brukes til studiet av andre steroid hormoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (tilskudd R00-HD068130 til S.W.) og Baltimore Diabetes Research Center: piloter og gjennomførbarhet Grant (til S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
  2. Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
  3. de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , 1933719117749761 (2018).
  4. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  5. van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
  6. Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
  7. Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
  8. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  9. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
  10. Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
  11. Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
  12. Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
  13. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  14. Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS? Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
  15. Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
  16. Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome? Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
  17. Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome - a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
  18. Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
  19. Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
  20. Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
  21. Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
  22. Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
  23. Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
  24. Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
  25. Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
  26. van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function? Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
  27. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).
  28. Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
  29. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  30. Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  31. Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
  32. McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
  33. Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
  34. Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 140 polycystisk eggstokk-syndrom dihydrotestosteron (DHT) Estrous cyclicity Androgen puberteten kvinnelige avkom
En Hyperandrogenic mus modell å studere polycystisk ovariesyndrom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., … More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter