Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

En Hyperandrogenic musen Model til at studere polycystisk ovariesyndrom

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379

Summary

Vi beskriver udviklingen af et lean PCOS-lignende musemodel med dihydrotestosteron pellet at studere Patofysiologi af PCOS og afkom fra disse PCOS-lignende dæmninger.

Abstract

Hyperandrogenemia spiller en afgørende rolle i reproduktiv og metabolisk funktion hos kvinder og er kendetegnende for polycystisk ovariesyndrom. Udvikle en lean PCOS-lignende musemodel, der efterligner kvinder med PCOS er klinisk meningsfulde. I denne protokol beskriver vi sådan en model. Ved at indsætte en 4 mm længde af DHT (dihydrotestosteron) krystal pulver pellet (totallængde pellet er 8 mm), og erstatte det månedlige, vi er i stand til at producere en PCOS-lignende musemodel med serum DHT niveauer 2 gange højere end mus ikke implanteret med DHT (no-DHT). Vi observerede reproduktiv og metabolisk dysfunktion uden at ændre kropsvægt og kropssammensætning. Mens udviser en høj grad af infertilitet, en lille delmængde af disse PCOS-lignende hunmus kan blive gravide og deres afkom Vis forsinket pubertet og øget testosteron som voksne. Denne PCOS-lignende musemodel for lean er et nyttigt værktøj til at studere Patofysiologi af PCOS og afkom fra disse PCOS-lignende dæmninger.

Introduction

Hyperandrogenism er kendetegnende for polycystisk ovariesyndrom (PCOS) Ifølge NIH kriterier og af Androgen overskydende og PCOS (AE-PCOS) samfund. Kvinder med PCOS har svært ved at blive gravid og har øget risiko for graviditet komplikationer1. Selv hvis de bliver gravid, har deres kvindelige afkom en sundhedsskadelige resultater2,3. Dyremodeller er blevet udviklet ved hjælp af forskellige strategier4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 og udstiller mange funktioner af PCOS (anovulation, og/eller nedsat glukose og insulin tolerance) med øget kropsvægt og fedme forbundet med øget adipocyt vægt og udvidede adipocyt størrelse. Der er to store strategier til at producere dyremodeller, der bruges til at studere PCOS. En er behandling med høje niveauer af androgener direkte (eksogene androgen indsprøjtning/indsættelse) eller indirekte (f.eks. blokering androgen konvertering til østrogen med aromatasehæmmer) efter fødsel13. En anden er af føtal hyperexposure af androgener under drægtigheden14,15 at studere afkommet. For eksempel, udvikle kvindelige afkom fra rhesus abe16,17, får18og gnavere udsat for mandlige androgen intrauterin periode PCOS-lignende træk senere i livet. Disse modeller betydeligt udvidet vores forståelse af forhøjede androgen virkning, og føtal programmering og uterin miljøvirkninger. Men disse modeller har deres egne begrænsninger: 1) dyr udvikler fedme og det er derfor vanskeligt at adskille virkningerne af hyperandrogenemia fra fedme induceret reproduktiv og metabolisk dysfunktion; 2) før graviditeten, kvinder med PCOS udstille allerede høje niveauer af androgen, således oocyter har været udsat for androgen overskydende før befrugtningen; 3) de farmakologiske doser af testosteron (T) eller dihydrotestosteron (DHT) anvendes efter fødslen eller under drægtigheden kan ikke afspejle androgen miljøet af PCOS. Testosteron og DHT niveauer er blevet målt i æggestokkene follikulært væske og/eller serum, og testosteron og DHT niveauer er 1,5 til 3,9 gange højere hos kvinder med PCOS5,19,20,21 ,22,23 sammenlignet med kvinder, upåvirket. Vi skabt en voksen mus model23,24,25 , udvikler reproduktiv og metabolisk dysfunktion senest to uger efter indledningen af kronisk DHT eksponering fra indsættelse af en pellet med 4 mm længde krystal DHT pulver (totallængde pellet er 8mm). Denne model producerer serum DHT niveauer, der er om 2-fold højere (benævnt 2xDHT) end kontrol mus uden DHT behandling. 2xDHT mus, udviser ikke ændringer af basal serum østradiol, testosteron, LH og ikke udvikle fedme, og Vis lignende æggestokkene vægt, serumniveauer af kolesterol, frie fedtsyrer, leptin, TNFα og IL-623,24, 25 forhold til styrer selv op til 3,5 måneder efter DHT Indsættelse23,24,25. Derudover ved parring hundyr, der allerede har udviklet funktioner af PCOS, kan vi studere virkningen af en hyperandrogenic maternel miljø på den metaboliske og reproduktiv sundhed af afkom15.

Dette nye paradigme (relevant for NIH og AE-PCOS samfund kriterier) modeller sygdommen ved at producere forholdsvis ensartede niveauer af androgener til dem af kvinder med PCOS 2 - til 3-fold højere testosteron eller DHT niveauer i forhold til upåvirket kvinder. Men denne model vedligeholdes af løbende eksogene DHT og ikke fra programmeret endogene hyperandrogenism når DHT er trukket tilbage. Det overordnede mål med denne artikel er at fokusere på 1) hvordan man laver DHT pellet; 2) Hvordan til at generere en lean-PCOS som musen model; 3) strategier til at evaluere kvindelige afkom fra disse dæmninger. Andre målinger og vurdering af fænotyper er ikke behandlet i dette manuskript, men kan findes i5,15,23,24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vi præsenterer her, detaljerede protokoller for DHT pellet forberedelse og indsættelse, og reproduktive og metaboliske test. Musene brugt i denne undersøgelse var en blandet baggrund (C57/B6, CD1, 129Sv) og blev opretholdt med mad og vand ad libitum i en 14/10 h lys/mørke cyklus på 24 ° C i Broadway forskning bygning dyr facilitet på Johns Hopkins University School of Medicin. Alle procedurer blev godkendt af Johns Hopkins University Animal Care og brug udvalget.

1. Opret PCOS-lignende musemodel

  1. DHT pellet forberedelse
    1. Autoklave silastic slanger til at sterilisere. Skære silastic rør til en længde på 15 mm med et barberblad;
    2. Seal ene side ved at indsprøjte medicinsk klæbende silikone ind i røret med en 20 G afrundede kanyle tilknyttes en 3 mL sprøjten. Stemplet skal trækkes fra sprøjten og derefter lim indsat i reservoiret. Stemplet er genindsat og selvklæbende skubbet indtil det begynder at dukke fra nålen. Afrundede nålen er lavet ved at skære den skarpe spids side af 20 G kanyle med nogen stærk saks. Længden af silicium i røret bør være mere end 2 mm til at tillade trimning af post-produktion;
    3. Tørre natten over; Check for luftbobler på den lukkede side. Dem med ingen luftbobler bruges til DHT pellets. Andre kan bruges til no-DHT kontrol pellets.
    4. Bære handsker, maske, beskyttelsesbriller og laboratoriekittel før DHT-pellet i en hætte til at undgå DHT eksponering til huden.
    5. Hæld DHT pulver i en plastik vejer båden og tryk på den åbne side af dobbeltklæbende udjævnede rør (fremstillet i A1.1) til DHT pulver.
    6. DHT pulver kan bankes med en stor papirclips, der er glattet.  Fortsætte indtil DHT når en højde på 4 mm (eller ønsket længde). Kontrollere DHT længde med en lineal, og forsegle den åbne side med silicium, tørre natten over.
    7. Skær hver forseglet side for at gøre længden af silicium 2 mm lang. Den samlede længde af pellet vil være 8 mm.
    8. Forsegle både side af Tom silastic slanger som kontrol (no-DHT) pellet.
    9. Holde pellets i en 50 mL konisk tube indpakket med folie (for at undgå lys eksponering) ved stuetemperatur indtil brug. DHT pellets opretholde fuld virkning for mindst 3 måneders opbevaring.
  2. DHT indsætning og udskiftning
    1. Op til 20 DHT er pellets eller kontrol pellets neddykket separat i en 50 mL konisk slange med 30 mL steril 0,9% saltvand i 24 timer ved 37 °C i ækvilibrering lige før indsættelse.
    2. Forud for operationen, overflader og handsker er desinficeres med clidox og arbejde overflader er dækket med ren plast bakkes absorberende papir (kirurgisk pad).  Alle instrumenter, der kommer i kontakt med dyr er dekontamineres før den Dyrefacilitet ved autoklavering.  Instrumenter vil være tilladt til tørt og køligt inden brug.
    3. 2-måned-forhenværende kvindelig mus bruges (4 – 5 mus/bur). Mus er indsprøjtet intraperitoneal med xylazin (3,5 mg/kg bw) og ketamin (78,8 mg/kg bw) ved hjælp af en insulin sprøjte. Beregninger til blanding og dosering anæstesi er i tabel 1.
    4. Efter passende anæstesi er nået, målt ved tab af tå refleks og langsommere vejrtrækning, prepped musen for kirurgi.
    5. Desinficere huden i området med betadine ved hjælp af steril gaze og rene med 70% ethanol.  Området vil igen være malet med betadine.
    6. Skær et hul på ca. 5 mm længde med saks under huden i nærheden af halsen. Brug en 10 G trochar, lave en lille tunnel (15 mm) i rostralt retning. Pellet indsættes dorsalt med trochar.
    7. Åbningen er derefter forseglet med kirurgisk klæbemiddel. Manuelt omtrentlige såret kanter med pincet og skånsom tandbørstning streger til at anvende en tynd film af flydende lim til tilnærmet sår kanter. Oprustning 3 tynde lag af lim til at sikre, at limen er jævnt fordelt over såret. Limen skal udvide 1 cm på hver side af apposed sår kanter. Sutur eller kirurgiske clips kan også bruges til at lukke hullet. Sæt mus tilbage i buret, individuelt til huse, med en varme pude til recovery. Erstatte pellet hver 4 uger for at opretholde et konstant niveau af androgen eksponering. Den oprindelige pellet vil blive fjernet og der indsættes nye pellet, som beskrevet i A1.15 i den tilsvarende stilling.
    8. Teste duft tidsrækkemodeller efter 3 dage af DHT Indsættelse. Estrous cyklus scene er vurderet af vaginal cytologi.  Vaginal celler er indsamlet i 16 dage i træk ved hjælp af en p10 pipette til at sprøjte sterilt saltvand (omkring 10 µL) i de vaginale hulrum og derefter trække saltvand med samme steril pipette spidsen.  Vaginal celler afstødning fra vaginal væg blandes med saltvand og indsamles.
    9. Sprede saltvand med celler en mærket diaset. Hver side kan indeholde seks prøver. Dias er mærket for at konstatere, hvor prøven placeres i hver af seks steder.
    10. Efter saltvand er helt tørret på diaset, sat dias i en container med 100% ethanol til fix celler. Dias bør fastsættes til mindst 5 min, men kan forblive i fiksativ på ubestemt tid indtil videre anvendelse.
    11. Sæt dias i farvning løsninger for 1 min til buffer B og C. Wash dias med vand fra hanen og tørt ved stuetemperatur.
    12. Undersøg celle morfologi under en 10 X objektive lysmikroskop.  Celle morfologi til at skelne proestrus (P), estrus (E), metestrus (M) og diestrus (D) er beskrevet i referencer27,28,29.
    13. Antal dage i hver fase og divideret med det samlede antal dage til at beregne procent tid på hvert trin.
    14. Teste glukosetolerance på 21 dage efter DHT Indsættelse af fastende mus natten (16 h) og intravenøs 2 g/kg legemsvægt af 20% dextrose intraperitoneal. For eksempel, hvis en mus kropsvægt er 25 g, injiceres denne mus med 250 µL af 20% dextrose med en 50 cc (0,5 mL) insulin sprøjte. Blodsukkerniveauet er vurderet af glucometer og test strips ved at indsamle blod fra hale vene på 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Dette er beskrevet i detaljer andetsteds30.
  3. Blod samling
    1. Indsamle blod på forskellige dage efter DHT Indsættelse (vi begrænse samling volumen til 100 µL til steroid og 30ul for LH/FSH assay) mellem 9 og 10 am af submandibulære vene blødning med lancet. Dette er beskrevet i11.
    2. Centrifugeres blod på 6.000 x g ved 4 ˚cC i 10 min, og indsamle serum lag ind i en anden 1,5 mL rør, der kan opbevares ved-80 °C indtil assay.

2. vurdere reproduktive profiler af kvindelige afkom fra kronisk DHT indsat dæmninger

  1. Parring
    1. Den kvindelige mus skal testes er flyttet ind i buret med en dokumenteret frugtbar mandlige, (der tidligere har haft unger med en kvindelig mus) på 15 dage efter pellet indsættelse.
    2. Dokumentere Dams kropsvægt hver uge for at afgøre, om musen er gravid. Dam vægt stiger mere end 3 g i ugen angiver graviditet.
    3. Indsamle blod af dæmninger i anden uge efter vi observere øget kropsvægt af dæmninger større end 3 g fra ugen før.
  2. Puberteten vurderet af vaginal åbning og første estrus
    1. Kontrollere vaginal åbning ved besigtigelse hver dag efter hvalpene er vænnet fra på 21 efter fødslen dag (PND), måle anogenitale afstand og optage en alder af vaginal åbning.
    2. Når skeden åbner, indsamle vaginal celler hver dag, som beskrevet i 1.2.8–1.2.11 til at kontrollere duft tidsrækkemodeller.
    3. Observere celle morfologi som beskrevet 1.2.12, og den første estrus er defineret som datoen at alle celler er cornified epitelceller.
  3. Kroppens vægt og øre punch
    1. Dyppe den lancet tip til tatovering pasta og markere hver hvalp med tatovering på tåen, som beskrevet i henvisning12 på 7 PND, og vejer mus hver 7 dage indtil 70 dage gammel.
    2. Øre punch mus til at nummerere dem ved hjælp af systemet i figur 1 mellem 12 til 16 PND. At skelne sex, undersøge ventrale side af kroppen, vil kvinder har synlige brystvorter.
    3. Indsamle blod på 21, 26, 70 PND efter fødslen som beskrevet ovenfor i 1.3.1
  4. Hormonelle Assay
    1. DHT niveauer i blodserum er målt ved begge enzymmaerket assay (ELISA) og masse af væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS)23,24,31,32. T måles med LC-MS, eller en rotte/mus ELISA, der er blevet valideret ved University of Virginia Ligand Assay kernen i Center for forskning i reproduktion23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Serum DHT niveauer og glukose tolerance test

DHT niveauer blev målt fra indsamlede serum ved både ELISA og LC-MS ifølge protokollen 1,24 – 1,25, og 2,9, 3.0. DHT absolutte værdier er forskellige mellem massespektrometri og ELISA, men den relative fold (omkring 2-fold) af DHT vs no-DHT Indsættelse svarer fra begge assays og på tværs af eksperimenter15,23,24 ( Figur 2A).  DHT niveauer er steget betydeligt fra fordom gennem graviditet i både DHT og no-DHT mus, men DHT niveauer er 2-fold højere i DHT mus i forhold til no-DHT mus på begge pregestational (en dag før parring) og svangerskabsuge (omkring 14 dage) tidspunkter (figur 2B). Eftersom absolutte niveauer af DHT varierer mellem ELISA og LC-MS, vi beregne relative niveauer (fold ændring: DHT niveau med DHT Indsættelse vs no-DHT Indsættelse) inden for assays. Hunmus med DHT viste nedsat glukosetolerance i forhold til no-DHT (figur 3) på 2 uger efter DHT Indsættelse efter protokol 1.23.

Kvindelige afkom body vægt og puberteten

Mens generelt ufrugtbar, nogle dæmninger blive gravid og har hvalpe (ca. 30% graviditetsrate, så test frugtbarhed af 10 dæmninger vi normalt får 3 gravid dæmninger, henvise til protokollen 2.1). Vi kan derfor vurdere kronisk androgen effekter i dæmninger på den kvindelige afkom. Kvindelige afkom af DHT indsat hundyr kaldes DHT-døtre er, og dem af no-DHT indsat hundyr no-DHT døtre. Vi observerede ingen forskel mellem no-DHT og DHT-døtre i en alder af vaginal åbning. Men den første estrus af DHT-døtre er betydeligt forsinket (dag 35 for no-DHT datter; dag 42 for DHT-datter). Dette er forbundet med reduceret kropsvægt på 35 og 42 PND i DHT-døtre i forhold til no-DHT døtre (figur 4; henviser til protokol 2,4-2.7).

Hormonelle niveauer og duft tidsrækkemodeller i kvindelige afkom

Testosteronniveauer er ikke ændret på 21 PND, men reduceres på 26PND. Men testosteron er steget 70 PND (figur 5, henvise til protokollen 2,9-3,0). Voksen DHT døtre viste forstyrret duft tidsrækkemodeller sammenlignet med voksne no-DHT døtre, oplever betydeligt længere tid i m og mindre tid i P og E (fig. 6A, B; efter metoden i protokollen 1,17-1,22).

Figure 1
Figur 1: mus identifikation. I et bur er musen øre udstansede på forskellige holdning til at repræsentere mus nummer. Musen #1 til 3 er slået på højre øre, og #4 til 6 er hullede på det venstre øre set på dorsalt. Hvis musen er udstansede på ører på #1 og #4 position, er det #7; på 2 og 5, er #8; på 3 og 6 er #9; i midten af venstre øre er #10; på 1 og 10 position er #11; osv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Serum DHT niveauer. DHT serumniveauer. (A) Serum DHT niveauer måles ved både ELISA og massespektrometri. Selv om de absolutte værdier er forskellige, de to assays viste lignende fold forskelle mellem DHT og no-DHT behandlede mus. (B) Serum DHT fold ændring i forhold til ikke-DHT niveauer ved preconceptional og svangerskabsuge tidspunkter. No-DHT (åben bar) og DHT-implanteret (sorte bjælker) hunmus før (en dag før parring) og under graviditeten (omkring 14 dage af drægtighedsperioden). Værdier er mean ±S.E.M. N = 5-8 pr. gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: glukose tolerance test (GTT). No-DHT og DHT implanterede mus var fastede natten over og glukose (2 g/kg BW) blev sprøjtet intraperitoneal, og halen blodsukkeret blev målt på forskellige tidspunkter. DHT behandlede mus viste signifikant øget glucose niveauer mellem 30-120 min. i forhold til no-DHT behandlede mus. Værdier er mean ±S.E.M. N = 4-12 pr. gruppe. * P < 0,05 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: pre-graviditet maternel DHT behandling resulteret i reduceret kropsvægt i kvindelige afkom på 35 og 42 PND. Kropsvægt (y-aksen) blev målt på postnatal dage som vist (x-aksen). DHT-eksponerede afkom: sorte bjælke; ingen – DHT afkom: åben bar. Værdier er mean ±S.E.M. N = 9-14 pr. gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Serum DHT niveauer. Blodet blev indsamlet i morgen på PND 21, 26, 70 i morgen. Serum DHT niveauer (y-akse) fra kvindelige afkom af no-DHT døtre (åben bar) og DHT-døtre (sorte bjælker). Værdier er mean ±S.E.M. N = 5-11 pr. gruppe. Dette tal er blevet ændret fra reference2Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: kronisk maternel androgen overskydende fører til forstyrret tidsrækkemodeller i voksne døtre. (A) repræsentation af duft tidsrækkemodeller af kvindelige afkom. (B) procentdelen af tid brugt på hver duft Stadium (y-aksen) i løbet af 15 dage (x-aksen) målt ved cytologiske undersøgelse af vaginal celler. Værdier er mean ±S.E.M. N = 5-9 pr. gruppe. Estrous cyklus scene (y-aksen). M: mødte/diestrus; P: proestrus; E: estrus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: Ketamin/xylazin cocktail.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hyperandrogenism er et centralt element af PCOS. Serum DHT niveauer (to folde højere i DHT mus end i no-DHT mus) anvendes i denne protokol er lavere end dem, der indberettes af andre efterforskere i tidligere undersøgelser og er kalibreret til at efterligne forholdsmæssigt kvinder med PCOS5,19, 20,21. I modsætning til andre modeller, er denne 2-fold DHT model ændrer ikke kropsvægt og hele kroppens sammensætning sammenlignet med no-DHT mus i op til 3,5 måneder efter DHT Indsættelse23,24. Disse voksne DHT implanterede mus er vedligeholdt af konstante eksogene DHT. Selv om hele kroppens sammensætning ikke er ændret, er ændring af struktur og funktion af adipocytter blevet observeret i lean PCOS kvinder20. En omhyggelig undersøgelse af forskellige depoter er berettiget. Vi observeret nedsat duft tidsrækkemodeller senest en uge efter DHT Indsættelse15 og reduceret fertilitet under en 3 måneders fertilitet evaluering23.

Den lille delmængde af DHT behandlet hunmus, som var i stand til at blive gravid og har afkom gav mulighed for at vurdere virkningen af pre-gestational, svangerskabsuge og ammende hyperandrogenemia på fostrets udvikling. For at få et ordentligt kontrolleret eksperiment, flere ynglende hunner er påkrævet som nødvendiggør at mindst 10 parring par være etableret. DHT-døtre er kun udsat for DHT under drægtighed og før 21 PNA. DHT-døtre viste reduceret kropsvægt i forhold til no-DHT døtre, der angiver, at fedme eller overvægt ikke er en forstyrrende variabel i de observerede fysiologiske virkninger15.

I indledende undersøgelser valideret vi serum DHT niveauer over tid. Vi fandt ingen væsentlige forskelle i serum DHT på 1, 2, 3 og 4 uger23,24. DHT niveauer faldt efter 4 uger, derfor vi erstatte DHT pellet hver 4 uge. Vi overholder ikke reducerede virkningerne af DHT selv de har opbevaret ved stuetemperatur i 3 måneder. Det er vigtigt at udruge pellets i saltvand i 24 timer lige før indsættelse. Dette trin er kritisk for selv udgivelse af DHT fra pellet (DHT release langsomt gennem silastic slangen). Duft tidsrækkemodeller kan undersøges efter 3 dage af DHT Indsættelse, og vaginal smøre kan også undersøgt direkte i saltvand uden tør og plet under et lysmikroskop efter du fortrolig med cellen typer27.

Metabolisk fænotype kan vurderes på eller efter 2 uger (14 dage) af DHT Indsættelse. Virkningerne af DHT på stofskiftet ved udgangen af den fjerde uge (28 dage) er dog lidt dæmpet, men ingen dæmpning er observeret for reproduktiv dysfunktion. Derfor vurderer vi stofskifte funktion normalt i slutningen af 2, 3, 5, 6, 7 uger (14, 21, 35, 42-49 dage, 2 gange i alt indsættelse). Produktionen af langsom frigivelse steroid pellets i lab er en moden teknik, der er blevet bredt vedtaget af forskellige laboratorier33,34.  Det repræsenterer en omkostningseffektiv alternativ til kommercielt tilgængelige produkter, der kan overstige $50/pellet (90 dages DHT pellet, 5mg/pellet, IRA, NA-161). Det kommercielle produkt har fordelen ikke at behøve at blive erstattet i op til 90 dage, mens den pellet, der er beskrevet i denne rapport skal udskiftes hver 28 dage. For store undersøgelser, kan efterforskere finde det mere rentabelt at producere deres egne pellets selv med det ekstra arbejde skal erstatte pellets hver 4 uge.

Som bemærket af andre, modeller med kronisk DHT implantation efter fødslen ikke vise øget LH pulsatile frekvens, og dette kan påpege forskellige patologiske mekanismer af forhøjede androgen induceret reproduktive funktion mellem udviklingsmæssige og sent indsættende erhvervet hyperandrogenism. Med denne protokol kan vi undersøge kvindelige afkom fra kronisk hyperandrogenic dæmninger. Vi kan udnytte denne model for at forsøge at fuldt ud forstå de reproduktive (f.eks. udvikling af hårsækken, ægløsning (corpora lutea) og fertilitet) og metabolisk konsekvenser (f.eks. glucose eller lipid metabolisme, kropssammensætning, fedt depot distribution). Vores protokollen tilføjer nyt værktøj til at undersøge forhøjede androgen induceret reproduktiv og metabolisk dysfunktion; og dissocieres Patofysiologi forårsaget af forhøjede androgen fra dem, der kunne være på grund af fedme. Denne model kan bruges til at udforske væv specifikke virkninger af forhøjede androgener hos kvinder. Desuden kan den metode, der er rapporteret her for DHT pellet produktion let anvendes til undersøgelse af andre steroidhormoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (tilskud R00-HD068130 til S.W.) og Baltimore Diabetes Research Center: piloter og gennemførlighed Grant (til S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
  2. Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
  3. de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , 1933719117749761 (2018).
  4. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  5. van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
  6. Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
  7. Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
  8. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  9. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
  10. Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
  11. Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
  12. Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
  13. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  14. Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS? Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
  15. Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
  16. Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome? Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
  17. Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome - a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
  18. Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
  19. Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
  20. Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
  21. Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
  22. Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
  23. Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
  24. Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
  25. Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
  26. van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function? Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
  27. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).
  28. Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
  29. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  30. Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  31. Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
  32. McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
  33. Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
  34. Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmål 140 polycystisk ovarie syndrom dihydrotestosteron (DHT) duft tidsrækkemodeller Androgen puberteten kvindelige afkom
En Hyperandrogenic musen Model til at studere polycystisk ovariesyndrom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter