Summary
Vi beskriver utvecklingen av en lean PCOS-liknande musmodell med dihydrotestosteron pellets att studera patofysiologin av PCOS och avkomman från dessa PCOS-liknande dammar.
Abstract
Hyperandrogenemia spelar en avgörande roll i reproduktiv och metabola funktion hos kvinnor och är kännetecknande för polycystiskt ovariesyndrom. Utveckla en lean PCOS-liknande musmodell som härmar kvinnor med PCOS är kliniskt betydelsefull. I detta protokoll beskriver vi en sådan modell. Genom att sätta in en 4 mm längd av DHT (dihydrotestosteron) kristall pulver pellet (Totallängd pellet är 8 mm), och ersätta det varje månad, har vi möjlighet att producera en PCOS-liknande musmodell med serum DHT nivåer 2 gånger högre än möss inte implanteras med DHT (nr-DHT). Vi observerade reproduktiv och metabolisk dysfunktion utan att ändra kroppsvikt och kroppssammansättning. Samtidigt uppvisar en hög grad av infertilitet, en liten delmängd av dessa PCOS-liknande honmöss kan bli gravid och deras avkomma Visa försenad pubertet och ökad testosteron som vuxna. Detta PCOS-liknande musmodell för lean är ett användbart verktyg att studera patofysiologin av PCOS och avkomman från dessa PCOS-liknande dammar.
Introduction
Hyperandrogenism är kännetecknet av polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) enligt NIH kriterier och Androgen överskott och PCOS (AE-PCOS) samhälle. Kvinnor med PCOS har svårigheter att bli gravid och har ökad risk för graviditet komplikationer1. Även om de blir gravida, har deras kvinnliga avkommor en negativa hälsoeffekter utfall2,3. Djurmodeller har utvecklats med hjälp av olika strategier4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 och uppvisar många funktioner av PCOS (anovulation, och eller nedsatt glukos och insulin tolerans) med ökad kroppsvikt och fetma som är associerad med utvidgade fettceller storlek och ökad fettceller vikt. Det finns två stora strategier att producera djurmodeller som används för att studera PCOS. En är behandling med höga nivåer av androgener direkt (exogena androgen injektion/insertion) eller indirekt (till exempel blockera androgen konvertering till östrogen med aromatashämmare) efter födelse13. En annan är av fostrets hyperexposure av androgener under dräktigheten14,15 studera avkomman. Till exempel utvecklas kvinnliga avkommor från Rhesusapa16,17, får18och gnagare som utsätts för manliga nivåer av androgen i intrauterin perioden PCOS-liknande drag senare i livet. Dessa modeller förbättrats avsevärt vår förståelse av förhöjda androgena effekter, och fetal programmering, och livmoder miljöeffekter. Dessa modeller har dock sina egna begränsningar: 1) djur utvecklar fetma och det är därför svårt att skilja effekterna av hyperandrogenemia från fetma inducerad reproduktiv och metabolisk dysfunktion; (2) före graviditet, kvinnor med PCOS uppvisar redan höga nivåer av androgen, således oocyter har exponerats för androgen överskott före befruktningen; (3) de farmakologiska doserna av testosteron (T) eller dihydrotestosteron (DHT) användas efter födseln eller under dräktigheten kanske inte återspeglar androgen miljö av PCOS. Testosteron och DHT nivåer har mätts i äggstockarna follikulära vätska och/eller serum, och testosteron och DHT nivåer är 1,5-3,9 gånger högre hos kvinnor med PCOS5,19,20,21 ,22,23 jämfört med opåverkade kvinnor. Vi skapade en vuxen mus modell23,24,25 som utvecklar reproduktiv och metabolisk dysfunktion inom två veckor efter inledandet av kronisk DHT exponering från införandet av en pellet med 4 mm längd Crystal DHT pulver (Totallängd pellet är 8mm). Denna modell producerar DHT-nivåerna i serum som är om 2-faldigt högre (kallad 2xDHT) än för kontroll möss utan DHT behandling. 2xDHT möss inte uppvisar förändringar av basala serum estradiol, testosteron, LH och inte utveckla övervikt och Visa liknande ovarial vikt, serumnivåer av kolesterol, fria fettsyror, leptin, TNFα och IL-623,24, 25 förhållande till styr ända upp till 3,5 månader efter DHT införande23,24,25. Dessutom, genom parning honor som redan har utvecklat funktioner av PCOS, kan vi studera effekterna av en hyperandrogenic maternell miljö på den metabola och reproduktiv hälsan avkommor15.
Detta nya paradigm (relevant för NIH och AE-PCOS samhället kriterier) modeller sjukdomen genom att producera relativt liknande nivåer av androgener till de av kvinnor med PCOS 2 - till 3-faldigt högre testosteron eller DHT nivåer jämfört med opåverkade kvinnor. Men upprätthålls denna modell av ständiga exogena DHT och inte från programmerade endogena hyperandrogenism när DHT dras. Det övergripande målet med denna artikel är att fokusera på 1) hur man gör DHT pelleten; (2) hur man skapar en lean-PCOS som musmodell; (3) strategier för att utvärdera kvinnliga avkommor från dessa dammar. Andra mätningar och bedömning av fenotyper behandlas inte i detta manuskript men kan hittas i5,15,23,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Här presenterar vi detaljerade protokoll för DHT pellet utarbetande och införande och reproduktiv och metabolisk kontroll. De möss som används i denna studie var en blandad bakgrund (C57/B6, CD1, 129Sv) och underhölls med mat och vatten ad libitum i en 14/10 h ljus/mörk cykel på 24 ° C i Broadway forskning byggnad djuranläggningen vid Johns Hopkins University School of Medicin. Alla förfaranden godkändes av Johns Hopkins University djur vård och användning kommittén.
1. skapa PCOS-liknande musmodell
-
DHT pellet förberedelse
- Autoklav silastic slangar att sterilisera. Skär silastic rören till en längd av 15 mm med ett rakblad;
- Förslut ena sidan genom att injicera medicinsk självhäftande silikon i röret med en 20 G trubbiga nål bifogas en 3 mL spruta. Kolven ska dras upp i sprutan och sedan limmet in i reservoaren. Kolven är återinförs och självhäftande tryckas ned tills den börjar växa fram från nålen. Trubbiga nålen görs genom att skära vass spets sidan av 20 G nål med någon stark sax. Längden av kisel i röret bör vara mer än 2 mm för efterproduktion trimning;
- Torka över natten; Kontrollera om luftbubblor på den slutna sidan. De med inga luftbubblor används för DHT pellets. Andra kan användas för no-DHT kontroll pellets.
- Bär handskar, mask, skyddsglasögon och labbrock innan DHT-pellets i en huva att undvika DHT exponering för hud.
- Häll DHT pulver i en plast väger båten och tryck på den öppna sidan av limmet utjämnade rör (produceras i A1.1) till DHT pulvret.
- DHT pulver kan vara stampad med ett stort gem som är rätade. Fortsätt tills DHT når en höjd av 4 mm (eller önskad längd). Kontrollera längden på DHT med en linjal och försegla den öppna sidan med kisel, torrt över natten.
- Skär varje förseglade sida för att göra längden på kisel 2 mm lång. Den totala längden av pellets kommer att vara 8 mm.
- Försegla båda sidor av Tom silastic slangar som kontroll (nr-DHT) pellet.
- Hålla pellets i en 50 mL konisk röret lindade med folie (för att förhindra ljusexponering) i rumstemperatur fram till användning. DHT pellets behålla full effekt under minst 3 månaders lagring.
-
DHT införande och ersättning
- Upp till 20 DHT är pellets eller kontroll pellets nersänkta separat i en 50 mL konisk tub med 30 mL steril 0,9% koksaltlösning för 24 h vid 37 °C för Jämviktstiden strax före införande.
- Före operation, de ytor och handskar desinficeras med clidox och arbetsytorna är täckta med ren plast uppbackning absorberande papper (kirurgiska pad). Alla instrument som kommer i kontakt med djur är dekontamineras före införseln djuranläggningen genom autoklavering. Instrument får torr och sval före användning.
- 2-månad-gammal honmöss används (4 – 5 möss/buren). Möss injiceras intraperitonealt med xylazin (3,5 mg/kg bw) och ketamin (78,8 mg/kg bw) använder en insulinspruta. Beräkningar för blandning och dosering anestesi är i tabell 1.
- Efter adekvat anestesi uppnås, mätt som förlust av tå reflex och långsammare andning, kommer att musen vara förberedd för kirurgi.
- Desinficera huden på området med betadine med steril gasbinda och rengör med 70% etanol. Området kommer igen målas med betadine.
- Skär ett hål runt 5 mm längd med sax under huden nära halsen. Använda en 10 G trochar, göra en liten tunnel (15 mm) i rostralt riktning. Pelleten infogas dorsalt med trochar.
- Öppningen är sedan förseglas med kirurgisk tejp. Manuellt ungefärliga såret kanter med pincett och skonsam borstning stroke att applicera ett tunt lager av flytande lim tillnärmade såret kanter. Uppbyggd 3 tunna lager av lim att säkerställa limmet är jämnt fördelade över såret. Limmet bör omfatta 1 cm på varje sida av apposed såret kanterna. Sutur eller kirurgiska klämmor kan också användas för att stänga hålet. Placera möss i bur, individuellt inrymt, med en hetta madrassera för återvinning. Ersätta pellet var fjärde vecka för att bibehålla en konstant nivå på androgen exponering. Den ursprungliga pelleten tas bort och nya pellet infogas som beskrivs i A1.15 i liknande position.
- Testa estrous cyclicity efter 3 dagar av DHT införande. Östruscykel skede bedöms av vaginal cytologi. Vaginal celler samlas för 16 dagar genom att använda en p10 vi rekommenderar för att spruta steril koksaltlösning (cirka 10 µL) i vaginal kaviteten och sedan återkalla saltlösning med samma sterila pipettspetsen. Vaginal celler sloughed från vaginalväggen blanda med koksaltlösning och samlas.
- Sprida saltlösning med celler i en märkt bild. Varje diabild kan innehålla sex prover. Bilderna är märkta för att notera vilka provet placeras i varje av de sex platserna.
- Efter saltlösning har helt torkat ut på den bilden, lägga bilder i en behållare med 100% etanol fixar celler. Bilder bör fastställas för minst 5 minuter, men kan förbli i fixativ på obestämd tid tills vidare användning.
- Placera bilder i färgning lösningar för 1 min varje buffert B och C. Wash diabilder med kranvatten och torka i rumstemperatur.
- Undersöka cellmorfologi under en 10 X objektiva ljusmikroskop. Cellmorfologi att skilja Proöstrus (P), brunst (E), metestrus (M) och diöstrus (D) beskrivs i referenser27,28,29.
- Antal dagar i varje skede och dividerat med det totala antalet dagar att beräkna procent tid i varje skede.
- Testa glukostolerans 21 dagar efter DHT införande genom fasta möss över natten (16 h) och injicera 2 g/kg kroppsvikt av 20% dextros intraperitonealt. Exempelvis om en mus väger 25 g, kommer den här musen att injiceras med 250 µL 20% dextros med en 50 cc (0,5 mL) insulinspruta. Glukosnivåer bedöms av Glukometer och test strips genom provtagning av blod från svans ven på 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Detta beskrivs i detalj på annan plats30.
-
Blodinsamling
- Samla in blod på olika dagar efter DHT inläggning (vi begränsa collection volym 100 µL för steroid och 30ul för LH/FSH assay) mellan 9 och 10 am av submandibular vein blödning med lancet. Detta beskrivs i11.
- Centrifugera blodet vid 6000 x g vid 4 ˚C i 10 min och samla in serum lagret i en annan 1,5 mL tub som kan lagras vid-80 °C tills assay.
2. bedöma reproduktiv profiler av kvinnliga avkommor från kroniskt DHT införas dammar
-
Parning
- Kvinnliga musen ska testas flyttas in i buren med en beprövad fertila hane (som tidigare har fått valpar med kvinnliga musen) på 15 dagar efter pellet insertion.
- Dokument DAMS kroppsvikt varje vecka för att avgöra om musen är gravid. Dammen vikt ökar mer än 3 g i veckan tyder på graviditet.
- Samla in blod av dammar den andra veckan efter vi Observera ökad kroppsvikt av dammar större än 3 g från veckan innan.
-
Pubertet bedöms av slidöppningen och första brunst
- Kontrollera slidöppningen genom visuell inspektion varje dag efter valpar är avvanda vid 21 postnatal dag (PND), Mät anogenital avståndet och spela in en ålder av slidöppningen.
- När slidan öppnar, samla vaginal celler dagligen, som beskrivs i 1.2.8–1.2.11 att kontrollera estrous cyclicity.
- Observera cellmorfologi som beskrivs 1.2.12 och den första brunst definieras som datum att alla celler är cornified epitelceller.
-
Kroppens vikt och örat punch
- Doppa lansetten spetsen i tatuering pastan och markera varje valp med tatuering på tån som beskrivs i referens12 på 7 PND, och väga möss varje 7 dagar tills 70 dagars ålder.
- Öra punch möss att numrera dem med system i figur 1 mellan 12 till 16 PND. Att skilja kön, granska ventrala sida av kroppen, kommer kvinnor har synliga bröstvårtor.
- Samla in blod på 21, 26, 70 PND efter födseln som beskrivs ovan i 1.3.1
-
Hormonella analys
- DHT nivåer i blodet serum mäts av båda enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) och av liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS)23,24,31,32. T mäts av LC-MS, eller en råtta/mus ELISA som validerats av universitetar av Virginia Ligand Assay kärnan i centrum för forskning i reproduktion23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DHT-nivåerna i serum och glukostoleranstest
DHT nivåerna mättes från insamlade serum genom båda ELISA och LC-MS enligt protokollet 1,24 – 1,25, och 2,9, 3.0. DHT absolutvärdena skiljer mellan masspektrometri och ELISA, dock relativa luckan (cirka 2-faldig) av DHT vs no-DHT införande är liknande från båda analyser och över experiment15,23,24 ( Figur 2A). DHT nivåerna avsevärt ökar från preconception genom graviditet i både DHT och nr-DHT möss, men DHT nivåer är 2-faldigt högre DHT mössen jämfört med no-DHT mössen på båda pregestational (en dag innan parning) och graviditetsdiabetes (cirka 14 dagar) tidpunkter (figur 2B). Eftersom absoluta nivåer av DHT varierar mellan ELISA och LC-MS, vi beräkna relativa nivåer (faldig förändring: DHT nivå med DHT införande vs no-DHT införande) inom analyser. Honmöss med DHT visade nedsatt glukostolerans i förhållande till no-DHT (figur 3) på 2 veckor efter DHT införande enligt protokollet 1.23.
Kvinnliga avkommor kropp vikt och pubertet
Medan generellt infertila, några dammar bli gravid och har valpar (cirka 30% dräktighetsfrekvens, så testa fertilitet av 10 dammar vi kommer vanligtvis få 3 gravid dammar, hänvisa till protokollet 2.1). Därför kan vi utvärdera kronisk androgena effekter i dammar på kvinnlig avkomma. Kvinnlig avkomma från DHT införas dammar kallas DHT-döttrar, och de från no-DHT införas dammar kallas no-DHT döttrar. Vi observerade någon skillnad mellan no-DHT och DHT-döttrar för åldern av slidöppningen. Den första brunst av DHT-döttrar är dock kraftigt försenat (dag 35 för no-DHT dotter; dag 42 för DHT-dotter). Detta är förknippat med reducerade kroppsvikten på både 35 och 42 PND i DHT-döttrar nr-DHT döttrar (figur 4, hänvisa till protokollet 2.4 – 2,7).
Hormonnivåerna och estrous cyclicity i kvinnliga avkommor
Testosteronnivåer ändras inte på 21 PND, men reduceras vid 26PND. Dock testosteron ökar på 70 PND (figur 5, hänvisa till protokollet 2,9 – 3,0). Vuxna DHT döttrar visade störs estrous cyclicity jämfört med vuxna nr-DHT döttrar, upplever betydligt längre gånger i M/D och mindre tid i P och E (figur 6A, B; enligt metoden i protokollet 1.17 – 1,22).
Figur 1: mus identifiering. Inom en bur är mus öra stansade annan position att representera antalet mus. Mus #1 till 3 är stansade på höger öra, och #4 till 6 är stansade på vänster öra tittade på dorsalt. Om musen är stansade på öronen på både #1 och #4 position, är det #7; vid 2 och 5, är #8; vid 3 och 6 är #9; vid mitten av vänster öra är #10; på 1 – 10 position är #11; m.m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Serum DHT nivåer. DHT-nivåerna i serum. (A) Serum DHT nivåerna mäts av både ELISA och Mass-Spektrometri. Även om de absoluta värdena är olika, de två analyser visade liknande vika skillnader mellan DHT och nr-DHT behandlade möss. (B) Serum DHT faldig förändring i förhållande till icke-DHT nivåer vid preconceptional och graviditetsdiabetes tidpunkter. Nr-DHT (öppen bar) och DHT-implanterade (svarta staplar) honmöss innan (en dag innan parning) och graviditet (ca 14 dagar av dräktigheten). Värden är medelvärdet ±S.E.M. N = 5-8 per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: glukostoleranstest (GTT). Nr-DHT och DHT implanteras möss var fastade under natten och glukos (2 g/kg Kroppsvikt) var injiceras intraperitonealt och svans blodglukos mättes vid olika tidpunkter. DHT behandlade möss visade signifikant ökad glukosnivåer mellan 30 till 120 min jämfört med no-DHT behandlade möss. Värden är medelvärdet ±S.E.M. N = 4-12 per grupp. * P < 0,05 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Bild 4: före graviditeten maternell DHT behandling resulterade i minskad kroppsvikt hos kvinnliga avkomman vid 35 och 42 PND. Kroppsvikt (y-axeln) mättes på postnatal dagar som visas (x-axeln). DHT-exponerade avkommor: svart bar; ingen – DHT avkommor: öppen bar. Värden är medelvärdet ±S.E.M. N = 9-14 per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Serum DHT nivåer. Blod samlades på morgonen på PND 21, 26, 70 på morgonen. DHT-nivåerna i serum (y-axeln) från kvinnliga avkommor nr-DHT döttrar (öppen bar) och DHT-döttrar (svarta staplar). Värden är medelvärdet ±S.E.M. N = 5-11 per grupp. Denna siffra har ändrats från referens2vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: kronisk maternell androgen överskott leder till störd cyclicity i vuxna döttrar. (A) framställning av estrous cyclicity kvinnliga avkommor. (B) procentandelen av tiden tillbringade varje estrous skede (y-axeln) under 15 dagar (x-axeln) mätt vid Cytologisk undersökning av vaginal celler. Värden är medelvärdet ±S.E.M. N = 5-9 per grupp. Östruscykel scenen (y-axeln). M/D: träffade/diöstrus; P: Proöstrus; E: brunst. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Ketamin/xylazin cocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hyperandrogenism är en nyckelfunktion i PCOS. De DHT nivåerna i serum (två gånger högre i DHT möss än hos nr-DHT möss) används i detta protokoll är lägre än de som rapporterats av andra utredare i tidigare studier och är kalibrerade för att proportionellt efterlikna kvinnor med PCOS5,19, 20,21. Till skillnad från andra modeller ändrar inte denna 2-faldig DHT-modell av kroppsvikt och hela kroppssammansättning jämfört med no-DHT möss upp till 3,5 månader efter DHT införande23,24. Dessa vuxna DHT implanteras möss upprätthålls av ständiga exogena DHT. Även om hela kroppssammansättning inte ändras, har förändring av struktur och funktion av adipocyter observerats i lean PCOS kvinnor20. En noggrann undersökning av olika depåer är befogad. Vi observerade nedsatt estrous cyclicity inom en vecka efter DHT införande15 och minskad fertilitet under en 3 månaders fertilitet utvärdering23.
En liten delmängd av DHT behandlas honmöss som skulle kunna bli gravid och lämnat avkomma en möjlighet att bedöma effekterna av pre-gestational, graviditetsdiabetes och ammande hyperandrogenemia på fostrets utveckling. För att få ett ordentligt kontrollerade experiment, krävs flera avelshonor som kräver att minst 10 parning par fastställas. DHT-döttrar utsätts endast för DHT under dräktigheten och innan 21 PNA. DHT-döttrar visade minskad kroppsvikt jämfört med no-DHT döttrar, som visar att fetma eller övervikt inte är en förbryllande variabel i de observerade fysiologiska effekter15.
I inledande studier validerat vi de DHT-nivåerna i serum över tiden. Vi hittade inga signifikanta skillnader i serum DHT vid 1, 2, 3 och 4 veckor23,24. DHT nivåer minskat efter 4 veckor, därför vi ersätta DHT pellet var fjärde vecka. Vi iakttar inte minskade effekterna av DHT som även de har förvarats i rumstemperatur i 3 månader. Det är viktigt att Inkubera pellets i saltlösning för 24 h strax före införande. Detta steg är avgörande för även frisättning av DHT från pelleten (DHT release långsamt genom silastic slangen). Estrous cyclicity kan granskas efter 3 dagar av DHT införande och vaginala utstryk också kan undersökas direkt i saltlösning utan torr och fläcken under ett ljusmikroskop efter du bekant med cellen typer27.
Metaboliska fenotyp kan bedömas vid, eller efter, 2 veckor (14 dagar) av DHT införande. Effekterna av DHT på metabolism i slutet av den fjärde veckan (28 dagar) är dock något försvagade, även om ingen dämpning observeras för reproduktiv dysfunktion. Därför bedömer vi ämnesomsättning fungerar normalt i slutet av 2, 3, 5, 6, 7 veckor (14, 21, 35, 42 och 49 dagar, 2 gånger totalt införande). Produktionen av långsam frisättning steroid pellets i labbet är en mogen teknik som har allmänt antagits av olika laboratorier33,34. Det representerar ett kostnadseffektivt alternativ till kommersiellt tillgängliga produkter, som kan överstiga $50/pellet (90 dagars DHT pellet, 5mg/pellet, IRA, NA-161). Den kommersiella produkten har fördelen av att inte behöva ersättas i upp till 90 dagar, medan den pelleten som beskrivs i denna rapport behöver bytas varje 28 dagar. För storskaliga studier, kan utredarna hitta det mer ekonomiskt att producera sin egen pellets även med det extra arbete som krävs för att ersätta pellets varje 4 veckor.
Som andra har påpekat, modeller med kronisk DHT implantation efter födelsen inte visar ökad LH pulserande frekvens och detta får påpeka olika patologiska mekanismer av förhöjda androgen inducerade reproduktiv funktion mellan utvecklings och sen debut förvärvade hyperandrogenism. Med detta protokoll har vi möjlighet att undersöka kvinnliga avkommor från kroniskt hyperandrogenic dammar. Vi kan utnyttja denna modell att fullt förstå reproduktiv (e.g. follikeln utveckling, ägglossning (corpora lutea) och fertilitet) och metabola konsekvenser (t.ex. glukos eller lipid metabolism, kroppssammansättning, fett depå fördelning). Våra protokoll lägger till nya verktyg för att undersöka förhöjda androgen inducerade reproduktiv och metabolisk dysfunktion; och dissocierar patofysiologin orsakas av förhöjda androgen från dem som kan bero på övervikt. Denna modell kan användas för att utforska de vävnad specifika effekterna av förhöjda androgener hos kvinnor. Dessutom kan den metod som redovisas här för DHT pelletsproduktion tillämpas enkelt på studiet av andra steroidhormoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (bidrag R00-HD068130 att S.V.) och Baltimore Diabetes Research Center: piloter och genomförbarhet Grant (att S.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystalline 5α-DHT powder | Sigma-Aldrich | A8380-1G | |
| Dow Corning Silastic tubing | Fisher Scientific | 11-189-15D | 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter |
| Medical adhesive silicone | Factor II, InC. | A-100 | |
| Goggles, lab coats, gloves and masks. | |||
| 10 µL pipette tips without filter | USA Scientific | 11113700 | |
| Microscope slide for smear | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Diff Quik for staining cells | Fisher Scientific | NC9979740 | |
| Lancet | Fisher Scientific | NC9416572 | |
| 3 mL Syring | Becton, Dickinson and Company (BD), | 30985 | |
| attached needle: 20 G | BD | 305176 | |
| Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale. | |||
| Xylazine | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100 mg/mL |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100 mg/mL |
| Surgical staple | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe |
| Trocar | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Microscope | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | Germany |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | |
| Testosterone rat/mouse ELISA kit | IBL | B79174 | |
| DHT ELISA kit | Alpha Diagnostic International | 1940 | |
| One touch ultra glucometer | Life Scan, Inc. | ||
| One touch ultra test stripes | Life Scan, Inc. | ||
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-18 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Clidox | Fisher Scientific | NC0089321 | |
| surgical underpad | Fisher Scientific | 50587953 | Manufacturer: Andwin Scientific 56616018 |
| Betadine Antiseptic Solution | Walgreens | ||
| 3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) | 3M Science. Applied to Life |
References
- Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
- Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
- de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , 1933719117749761 (2018).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
- Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
- Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
- Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
- Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
- Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
- Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
- Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS? Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
- Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
- Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome? Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
- Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome - a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
- Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
- Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
- Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
- Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
- Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
- Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
- Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
- Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
- van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function? Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).
- Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
- Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
- McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
- Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
- Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).
