Summary
我们描述了一个瘦的 pcos 样小鼠模型的发展与 dihydrotestosterone 丸研究 pcos 的病理生理学和这些 pcos 样水坝的后代。
Abstract
Hyperandrogenemia 在女性生殖和代谢功能中起着至关重要的作用, 是多囊卵巢综合征的标志。开发一种瘦的 pcos 样小鼠模型, 模仿妇女与 PCOS 是临床意义。在本协议中, 我们描述了这样一个模型。通过插入4毫米的氢睾酮 (dihydrotestosterone) 晶体粉末颗粒 (总长度的颗粒是8毫米), 并在每月更换, 我们能够产生一个 PCOS 样的小鼠模型与血清氢睾酮水平2倍高于未植入 dht (无氢睾酮) 的小鼠。我们观察到生殖和代谢功能障碍, 而不改变体重和身体组成。在表现出高度不孕症的同时, 这些 PCOS 样雌性小鼠的一小部分可以怀孕, 他们的后代显示延迟青春期和增加睾酮作为成人。这种 pcos 样瘦老鼠模型是一个有用的工具, 研究 pcos 的病理生理学和这些 pcos 样水坝的后代。
Introduction
Hyperandrogenism 是多囊卵巢综合征 (PCOS) 的标志, 根据 NIH 标准和雄激素过剩和 pcos (AE pcos) 社会。患有 PCOS 的妇女很难怀孕, 并增加了妊娠并发症的风险1。即使他们怀孕了, 他们的雌性后代也会有不良的健康结局2,3。动物模型已经开发使用各种策略4,5,6,7,8,9,10,11,12并表现出多囊卵巢综合征 (停止排卵、葡萄糖和胰岛素耐受) 的特点, 体重增加和肥胖与脂肪细胞体积增大和脂肪细胞重量增加有关。生产用于研究 PCOS 的动物模型有两种主要的策略。一是治疗与高水平的雄激素直接 (外源性雄激素注射/插入) 或间接 (如阻断雄激素转化为雌激素与芳香化酶抑制剂) 出生后13。另一种是由胎儿 hyperexposure 的雄激素在妊娠期14,15学习的后代。例如, 恒河猴16、17、绵羊18的雌性后代和在宫内期间接触雄性雄激素水平的啮齿类动物, 在以后的生活中发育成 PCOS 样特征。这些模型大大增强了我们对雄激素效应的认识, 以及胎儿的编程和子宫环境的影响。然而, 这些模型有自己的局限性: 1) 动物发育肥胖, 因此很难将 hyperandrogenemia 的影响与肥胖引起的生殖和代谢功能障碍分开;2) 在怀孕前, 有 PCOS 的妇女已经表现出高水平的雄激素, 因此卵母细胞在受精前暴露在雄激素过剩的水平;3) 出生后或妊娠期间使用的睾酮 (T) 或 dihydrotestosterone (DHT) 的药理剂量可能不能反映 PCOS 的雄激素环境。在卵巢滤泡液和/或血清中测定睾酮和 dht 水平, 睾酮和 dht 水平在女性 PCOS5、19、20、21 的妇女中高出1.5 至3.9 倍. ,22,23与未受影响的妇女相比。我们创建了一个成年小鼠模型23,24,25 , 发展生殖和代谢功能障碍在两周内启动慢性双氢睾酮暴露从插入一个球团与4mm 长度的水晶 DHT 粉 (球团总长度为 8mm)。该模型产生的血清氢睾酮水平约2 倍以上 (称为 2xDHT) 比控制小鼠没有 DHT 治疗。2xDHT 小鼠不表现基底血清雌二醇、睾酮、LH 和不发育肥胖的变化, 并显示类似的卵巢重量, 血清胆固醇水平, 游离脂肪酸, 瘦素, TNFα和 IL-623,24, 25相对于控制, 甚至3.5 月后, DHT 插入23,24,25。此外, 通过交配雌性已经开发出 PCOS 的特点, 我们可以研究 hyperandrogenic 的产妇环境对后代的新陈代谢和生殖健康的影响15。
这种新范式 (与 NIH 和 AE-PCOS 社会标准有关) 通过生产相对较不受影响的妇女的雄激素水平与 2-到3倍高的睾酮或 DHT 水平较高的男性荷尔蒙的比例来模拟这种疾病。然而, 这一模型是由连续外源双氢睾酮, 而不是从编程内源 hyperandrogenism 一旦 DHT 被撤回。本文的总体目标是集中于 1) 如何使 DHT 颗粒;2) 如何生成像小鼠模型这样的瘦 PCOS;3) 评估来自这些水坝的雌性后代的战略。对表型的其他测量和评估在本手稿中没有提到, 但可以在5、15、23、24、25、26中找到。
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Protocol
在这里, 我们提出了氢睾酮颗粒的准备和插入, 以及生殖和新陈代谢测试的详细协议。在这项研究中使用的老鼠是一个混合的背景 (C57/B6, CD1, 129Sv), 并保持与食品和水广告随意在14/10 小时/暗循环24°c 在百老汇研究建筑动物设施在约翰霍普金斯大学学校医学。所有程序均经约翰霍普金斯大学动物保育和使用委员会批准。
1. 创建类似 PCOS 的小鼠模型
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氢睾酮颗粒制剂
- 高压釜硅橡胶油管消毒。用剃刀刀片将硅橡胶管切割至长度为15毫米的管子;
- 将医用粘合剂硅胶注射到管中, 用20克钝针附着在3毫升注射器上, 密封一侧。应从注射器中取出柱塞, 然后将粘合剂插入储层中。柱塞被重新插入, 粘合剂推下, 直到它开始出现从针。钝针是用任何强力剪刀切割20克针尖侧。管中硅的长度应超过2毫米, 以允许生产后修整;
- 夜间干燥;检查密封一侧的气泡。没有气泡的人被用来做氢睾酮丸。其他可用于无氢睾酮控制丸。
- 戴上手套, 面具, 护目镜和实验室大衣, 然后在罩里做氢睾酮颗粒, 以避免双氢睾酮暴露在皮肤上。
- 将双氢睾酮粉倒入塑料称重船中, 并按在 A1.1 上的胶封管的开口侧 (在中产) 加入 dht 粉末。
- 双氢睾酮粉可以用一个大的回形针来夯实。 继续, 直到双氢睾酮达到4毫米 (或期望长度) 的高度。用尺子检查双氢睾酮的长度, 用硅密封开边, 一夜之间晾干。
- 切割每个密封的一侧, 使硅的长度2毫米长。球团总长度为8毫米。
- 将空硅橡胶管两侧密封为控制 (无 DHT) 颗粒。
- 保持颗粒在50毫升圆锥管包裹与箔 (以防止光暴露) 在室温下, 直到使用。双氢睾酮丸保持充分的功效, 至少3月的贮存。
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插入和替换 DHT
- 多达20个氢睾酮丸或控制丸分别淹没在50毫升圆锥管与30毫升不育0.9% 盐水24摄氏度在 37 °C 为平衡前插入。
- 手术前, 表面和手套用 clidox 消毒, 工作表面用干净的塑料支持吸水纸 (手术垫) 覆盖。 所有与动物接触的仪器在热处理进入动物设施之前都会被净化。 仪器在使用前将被允许干燥和冷却。
- 2月大的雌性小鼠被使用 (第4-5 鼠/笼)。小鼠注射腹腔与甲苯噻嗪 (3.5 毫克/千克) 和氯胺酮 (78.8 毫克/千克体重) 使用胰岛素注射器。混合和剂量麻醉的计算表 1。
- 在充分的麻醉完成后, 由于脚趾反射丧失和呼吸减慢, 老鼠将准备手术。
- 用无菌纱布消毒 betadine 区皮肤, 用70% 乙醇清洁。 该地区将再次与 betadine 油漆。
- 用剪刀在颈部附近的皮肤上剪下5毫米长的洞。使用10克套管针, 使一个小隧道 (15 毫米) 在延髓方向。颗粒入背与套管针。
- 开口用手术粘合剂密封。手工近似的伤口边缘与镊子和温和的刷牙笔触, 应用一个薄膜的液体胶粘剂的接近伤口边缘。积累3层薄薄的粘合剂, 确保胶粘剂均匀分布在伤口上。胶粘剂应在并列伤口边缘的两侧延伸1厘米。缝合或手术夹也可用于闭合孔。把老鼠放回笼子里, 单独安置, 用热垫恢复。每4周更换颗粒以保持雄激素的持续暴露水平。原始颗粒将被删除, 新的颗粒将插入如 A1.15 中所描述的相似的位置。
- 测试发情周期性后3天的 DHT 插入。发情周期阶段由阴道细胞学评估。 阴道细胞连续16天收集, 使用 p10 pipettor 将不育生理盐水 (约10µL) 喷入阴道腔内, 然后用同样的不育吸管尖将生理盐水取出。 阴道细胞脱落从阴道壁混合生理盐水和收集。
- 将生理盐水与细胞一起传播到标签的幻灯片上。每张幻灯片可以包含六个样本。幻灯片被标记为注意在六个位置中放置了哪个样本。
- 当盐水完全干燥后, 在幻灯片上, 把幻灯片放入一个容器, 100% 乙醇, 以修复细胞。幻灯片应至少固定5分钟, 但可以无限期保留在定影, 直到进一步使用。
- 将幻灯片放入1分钟的染色溶液中, 用于缓冲 B 和 c. 用自来水冲洗幻灯片, 室温干燥。
- 在10X 物镜显微镜下检查细胞形态学。 细胞形态学的区别发情前期 (P), 发情 (E), metestrus (M) 和 diestrus (D) 在参考27,28,29中描述。
- 计算每个阶段中的天数, 并按总天数除以每个阶段的百分比时间。
- 在21天内通过禁食小鼠 (16 小时) 和注射2克/千克体重20% 葡萄糖腹腔, 测试葡萄糖耐受性。例如, 如果鼠标体重是25克, 这只老鼠将注射250µL 20% 葡萄糖与 50 cc (0.5 毫升) 胰岛素注射器。葡萄糖水平是由嘉和试验条评估的血液从尾静脉在 0, 15, 30, 60, 90, 120 分钟。这在其他地方30详细地被描述。
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血液收集
- 在注射 DHT 后的不同日子收集血液 (我们限制100µL 类固醇和30ul 的 LH/FSH 检测) 之间的9和上午10点的颌下腺静脉出血与柳叶刀。这在11被描述。
- 离心血液在 6000 x g在 4 ˚C 为10分钟, 并收集血清层到另1.5 毫升管, 可以储存在-80摄氏度C, 直到化验。
2. 评估长期用 DHT 插入水坝的雌性后代的生殖剖面
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交配
- 被测试的雌性老鼠被移动入笼子与被证明的肥沃的男性 (以前有幼崽与一只雌性老鼠) 在15天以后在药丸插入以后。
- 每周记录大坝的体重, 确定老鼠是否怀孕。大坝重量在一周内增加3克, 表明怀孕。
- 收集水坝的血液在我们观察到从一周前3克以上的水坝增加的体重之后的第二周。
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青春期阴道开放和首次发情评估
- 每天在21产后 (PND) 断奶后, 通过目视检查检查阴道开口, 测量生殖器距离, 记录阴道开口的年龄。
- 一旦阴道打开, 每天收集阴道细胞, 如1.2 所述. 8–1.2 11 检查发情周期性。
- 观察细胞形态学, 如1.2.12 所述, 第一次发情定义为所有细胞 cornified 上皮细胞的日期。
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体重和耳拳
- 将柳叶刀的尖端蘸到纹身膏中, 并在脚趾上标记每只小狗, 如参考12在 7 PND 中所描述的, 并且每7天对老鼠进行体重70days。
- 耳朵冲压小鼠, 以数字他们使用系统在图 1之间的12至 16 PND。要区分性, 检查身体的腹侧, 雌性会有可见的奶头。
- 21, 26, 70 PND 在出生后收集的血液, 如上文所述1.3。1
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荷尔蒙测定
- 用酶联免疫吸附法 (ELISA) 和液相色谱串联质谱 (LC-MS)23、24、31、32测定血清中的双氢睾酮水平。T 是由 LC-MS, 或鼠/鼠 ELISA, 已经验证了弗吉尼亚大学配体化验核心在生殖研究中心23,24。
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Representative Results
血清双氢睾酮水平与葡萄糖耐受试验
用 ELISA 法和 LC-MS 根据1.24–1.25 和2.9、3.0 测定血清中的双氢睾酮水平。双氢睾酮的绝对值在质谱和 ELISA 上是不同的, 但是, dht 的相对折叠 (大约2倍) 与无氢睾酮的插入是相似的从测试和横跨实验15,23,24 (图 2A)。 在双氢睾酮和无氢睾酮的小鼠中, 睾酮水平明显增加, 从怀孕的偏见, 但是, 双氢睾酮水平是2倍以上的双氢睾酮的小鼠相比, 在两个 pregestational (前一天交配前一天) 和妊娠 (约14天)时间点 (图 2B)。由于双氢睾酮的绝对水平不同, ELISA 和 LC MS, 我们计算相对水平 (褶皱变化: 双氢睾酮水平与无氢睾酮插入) 在化验。双氢睾酮的雌性小鼠显示, 相对于 no (图 3), 在2周后, 根据1.23 号协议插入 dht 的葡萄糖耐受性受损。
雌性后代体重和青春期
虽然一般不育, 一些水坝怀孕和有幼崽 (约30% 的怀孕率, 所以测试10水坝的生育率, 我们通常会得到3个怀孕水坝, 参考协议 2.1)。因此, 我们可以评估慢性雄激素在水坝对雌性后代的影响。从氢睾酮插入水坝的雌性后代被称为 "双氢"-女儿, 而那些从没有 dht 插入水坝被称为无氢睾酮的女儿。我们观察到, 在阴道开放的年龄, 没有双氢睾酮和双氢睾酮的女儿没有区别。然而, 第一次发情的双氢睾酮-女儿是显着延迟 (35 天的无 dht 的女儿; 42 天的双氢睾酮-女儿)。这与35和 42 PND 在双氢睾酮-女儿相对于无氢睾酮的女儿的体重减少有关 (图 4; 请参阅协议 2.4–2.7)。
雌性后代的激素水平和发情周期性
睾酮水平没有改变 21 PND, 但减少26PND。然而, 睾酮增加 70 PND (图 5, 参考协议 2.9–3.0)。成年双氢睾酮的女儿表现出扰乱发情周期性相比, 成年无氢睾酮的女儿, 经历了很长时间在 M/D 和较少的时间在 P 和 E (图 6A, B; 根据协议1.17–1.22 的方法)。
图 1: 鼠标标识.在一个笼子里, 鼠标在不同位置的耳朵被打, 以表示鼠标数。鼠标 #1 到3被打在右耳上, #4 到6被打在左耳上看背。如果鼠标在 #1 和 #4 位置上被打耳, 则 #7;在2和 5, 是 #8;在3和6是 #9;在左耳中间 #10;在1和10位置是 #11;等请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 血清氢睾酮水平.血清氢睾酮水平。(A) 血清双氢睾酮水平由 ELISA 和质谱法测定。虽然绝对值不同, 但两种测定结果显示, 双氢睾酮和无氢睾酮治疗小鼠的褶皱差异相似。(B) 血清双氢睾酮在 preconceptional 和妊娠时间点与非氢睾酮水平的变化有关。无氢睾酮 (开放酒吧) 和 dht 植入 (黑条) 雌性小鼠之前 (交配前一天) 和怀孕期间 (约14天的妊娠)。值是平均的 S.E.M. N = 每组5-8。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 葡萄糖耐受性试验 (GTT).无氢睾酮和双氢睾酮植入小鼠夜间禁食, 葡萄糖 (2 克/千克) 注射腹腔, 尾部血糖测定在不同的时间点。与无氢睾酮治疗小鼠相比, 双氢睾酮治疗小鼠的葡萄糖含量显著提高 30-120 分钟。值是平均的 S.E.M. N = 每组4-12。* P < 0.05请点击这里查看这个数字的大版本.
图 4: 孕前孕产妇双氢睾酮治疗导致雌性后代体重减少35和 42 PND.体重 (Y 轴) 测量后, 产后天, 如图所示 (X 轴)。双氢睾酮暴露的后代: 黑吧;没有–DHT 的后代: 打开吧。值是平均的 S.E.M. N = 每组9-14。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 血清氢睾酮水平.早晨, PND 21, 26, 70 在早上采集血液。血清双氢睾酮水平 (Y 轴) 从女性后代的无 DHT 的女儿 (开放酒吧) 和双氢睾酮-女儿 (黑酒吧)。值是平均的 S.E.M. N = 每组5-11。此图已从参考2修改,请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 慢性产妇雄激素过剩导致成年女儿周期性不安.(A) 雌性后代发情周期性的表现。(B) 在15天 (X 轴) 期间, 在每个发情阶段 (Y 轴) 所花的时间占阴道细胞细胞学检查的百分比。值是平均的 S.E.M. N = 每组5-9。发情周期阶段 (Y 轴)。M/D: 满足/diestrus;P: 发情前期;E: 发情。请单击此处查看此图的较大版本.
表 1: 氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒。
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Discussion
Hyperandrogenism 是 PCOS 的一个重要特征。本协议所用的血清氢睾酮水平 (dht 小鼠的两倍以上) 比以前的研究中其他研究者报告的要低, 并且被校准成比例模拟的妇女与 PCOS5,19, 20,21。与其他模型不同的是, 这种2倍的 dht 模型不会改变体重和全身成分, 与无氢睾酮的小鼠相比, 3.5 月后, dht 插入23,24。这些成年的双氢睾酮植入小鼠是由连续外源性 dht 维持。虽然全身成分没有改变, 但在瘦 PCOS 妇女中观察到脂肪细胞结构和功能的改变20。对不同的仓库进行仔细的检查是有必要的。在3月的生育率评估23中, 我们观察到在15的双氢睾酮植入后一周内周期性的发情和降低生育率。
双氢睾酮的小子集治疗雌性小鼠, 能够怀孕和有后代提供了一个机会来评估孕前, 妊娠和护理 hyperandrogenemia 对胎儿发育的影响。为了得到一个适当的控制实验, 需要多种育种雌性, 必须至少建立10交配对。双氢睾酮-女儿只暴露于睾酮在怀孕期间和21肽。双氢睾酮-女儿显示体重减少比没有 DHT 的女儿, 表明肥胖或超重不是一个混淆变量在观察到的生理效应15。
在初步研究中, 我们验证了血清氢睾酮水平随着时间的推移。我们发现血清双氢睾酮在1、2、3和4周23、24之间没有显著差异。4周后, 双氢睾酮水平下降, 因此, 我们每4周更换一次氢睾酮颗粒。我们不观察氢睾酮的减少效果, 即使他们已经储存在室温下3月。在插入前, 在生理盐水中孵化24小时是很重要的。这一步对于甚至从颗粒中释放 dht (通过硅橡胶油管缓慢释放 dht) 是至关重要的。发情周期性可以检查后3天的 DHT 插入, 和阴道涂片也可以直接检查在生理盐水没有干燥和染色后, 光显微镜下, 你熟悉的细胞类型27。
代谢表型可以评估在2周 (14 天) 的 DHT 插入。然而, 在第四周 (28 天) 结束时, 双氢睾酮对新陈代谢的影响略有减弱, 尽管没有发现生殖功能障碍的衰减。因此, 我们通常评估代谢功能在 2, 3, 5, 6, 7 周 (14, 21, 35, 42, 49 天, 2 倍总插入) 结束。在实验室中生产缓释类固醇小球是一种成熟的技术, 已被不同的实验室33,34广泛采用。 它是一种经济划算的替代品, 可以超过50元/粒 (90 天的 DHT 颗粒, 5 毫克/颗粒, IRA, NA-161)。商业产品确实有不需要更换90天的优势, 而本报告中描述的颗粒需要每28天更换一次。对于大规模的研究, 调查人员可能会发现, 即使在每4周更换药丸所需的额外工作的情况下, 生产自己的小球也更经济。
正如其他人所观察到的, 出生后慢性 DHT 植入模型不显示 LH 搏动频率增加, 这可能指出雄激素诱导生殖功能的不同病理机制发育与晚发型获得 hyperandrogenism。通过这项议定书, 我们可以调查长期 hyperandrogenic 水坝中的雌性后代。我们可以利用这个模型试图充分理解生殖 (例如卵泡发育, 排卵 (语料库牡丹) 和生育) 和代谢后果 (如葡萄糖或脂质代谢, 身体成分, 脂肪库分布)。我们的协议增加了新的工具来调查雄激素诱导的生殖和代谢功能障碍;离解雄激素升高引起的病理生理学, 可能是由于肥胖所致。该模型可用于研究女性雄激素升高的组织特异性效应。此外, 在这里报告的氢睾酮丸生产方法可以很容易地应用于其他类固醇激素的研究。
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Disclosures
没什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院 (赠款 R00-HD068130 白雪) 和巴尔的摩糖尿病研究中心的支持: 飞行员和可行性赠款 (白雪)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystalline 5α-DHT powder | Sigma-Aldrich | A8380-1G | |
| Dow Corning Silastic tubing | Fisher Scientific | 11-189-15D | 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter |
| Medical adhesive silicone | Factor II, InC. | A-100 | |
| Goggles, lab coats, gloves and masks. | |||
| 10 µL pipette tips without filter | USA Scientific | 11113700 | |
| Microscope slide for smear | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Diff Quik for staining cells | Fisher Scientific | NC9979740 | |
| Lancet | Fisher Scientific | NC9416572 | |
| 3 mL Syring | Becton, Dickinson and Company (BD), | 30985 | |
| attached needle: 20 G | BD | 305176 | |
| Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale. | |||
| Xylazine | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100 mg/mL |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100 mg/mL |
| Surgical staple | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe |
| Trocar | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Microscope | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | Germany |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | |
| Testosterone rat/mouse ELISA kit | IBL | B79174 | |
| DHT ELISA kit | Alpha Diagnostic International | 1940 | |
| One touch ultra glucometer | Life Scan, Inc. | ||
| One touch ultra test stripes | Life Scan, Inc. | ||
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-18 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Clidox | Fisher Scientific | NC0089321 | |
| surgical underpad | Fisher Scientific | 50587953 | Manufacturer: Andwin Scientific 56616018 |
| Betadine Antiseptic Solution | Walgreens | ||
| 3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) | 3M Science. Applied to Life |
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