Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Polikistik over sendromu çalışmaya Hyperandrogenic fare modeli

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,4, 1,4,5
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Biz bir yalın PCOS gibi fare modeli ile PCOS ve belgili tanımlık çoluk çocuk bu PCOS benzeri baraj üzerinden Patofizyoloji çalışmaya dihidrotestosteron Pelet gelişimi tanımlamak.

Abstract

Hyperandrogenemia kadın üreme ve metabolik işlevinde önemli bir rol oynar ve Polikistik over sendromu özelliğidir. PCOS kadınlarla taklit eden bir yalın PCOS gibi fare modeli geliştirmek klinik olarak anlamlı demektir. Bu protokol için böyle bir model açıklar. DHT (dihidrotestosteron) kristal toz Pelet 4 mm uzunluğunda ekleyerek (Pelet toplam uzunluğu ise 8 mm) ve aylık değiştirmek yerine, biz bir PCOS gibi fare modeli ile serum DHT seviyeleri 2 kat DHT (no-DHT) ile implante değil fareler daha yüksek üretmek mümkün. Biz üreme ve metabolik fonksiyon bozukluğu vücut ağırlığı ve vücut kompozisyonu değiştirmeden gözlenen. Süre kısırlık yüksek derecede sergilenmesi, küçük bir alt kümesi bu PCOS benzeri dişi fareler hamile kalabilir ve yavrularını gecikmeli ergenlik ve artan Testosteron yetişkin olarak gösterir. Bu PCOS benzer yalın fare modeli PCOS ve belgili tanımlık çoluk çocuk bu PCOS benzeri baraj üzerinden Patofizyoloji eğitim için yararlı bir araçtır.

Introduction

Hyperandrogenism polikistik over sendromu (PCOS) NIH kriterleri göre ve androjen fazlalığı ve PCOS (AE-PCOS) toplumun özelliğimizdir. PCOS ile kadın hamile zorluk ve gebelik komplikasyonları1riski artmıştır. Onlar hamile bile, dişi yavrularını bir olumsuz sağlık sonuçları2,3var. Hayvan modelleri çeşitli stratejileri4,5,6,7,8,9,10,11 ile geliştirilmiş , 12 ve PCOS (anovulation, ve/veya bozulmuş glukoz ve insülin dayanıklılık) birçok özellikleri artan vücut ağırlığı ve genişlemiş adipocyte boyut ve artan adipocyte ağırlık ile ilişkili obezite ile sergilenmesi. PCOS incelemek için kullanılır hayvan modelleri üretmek için iki büyük strateji vardır. Doğum13den sonra tedavi androjenler doğrudan (eksojen androjen enjeksiyon/ekleme) ya da dolaylı olarak (örneğin, androjen dönüşüm için östrojen aromataz inhibitörü ile engelleme) düzeyi yüksek olan biri. Başka androjenler fetal hyperexposure tarafından gebelik14,15 sırasında belgili tanımlık çoluk çocuk incelemektir. Örneğin, al yanaklı maymun16,17, koyun18ve intrauterin dönemde androjen erkek düzeyde maruz kemirgenler dişi yavru sonraki hayatında PCOS benzeri özellikleri geliştirmek. Bu modeller önemli ölçüde yükseltilmiş androjen etkileri ve fetal programlama ve rahim çevresel etkileri bizim anlayış gelişmiş. Ancak, bu modeller kendi sınırlamaları vardır: 1) hayvanlar obezite geliştirmek ve bu nedenle indüklenen obezite üreme ve metabolik fonksiyon bozukluğu; hyperandrogenemia etkilerini ayırt etmek zordur 2) daha önce gebelik, kadın PCOS ile zaten androjen yüksek düzeyde sergi, böylece yumurta androjen fertilizasyon önce aşırı maruz kalmış; 3) farmakolojik dozlarda testosteron (T) veya doğumdan sonra veya gebelik sırasında kullanılan dihidrotestosteron (DHT) PCOS androjen ortamının yansıtmıyor olabilir. Yumurtalık foliküler sıvı ve/veya serum testosteron ve DHT seviyeleri ölçüldü ve 1.5-3,9 kat PCOS5,19,20,21 olan kadınlarda daha yüksek testosteron ve DHT seviyeleri ,22,23 etkilenmemiş kadınlara kıyasla. Üreme ve metabolik fonksiyon bozukluğu bir Pelet ekleme 4 mm uzunluğu ile kronik DHT maruz inisiyasyon iki hafta içinde gelişen bir yetişkin fare modeli23,24,25 yarattık Kristal DHT toz (Pelet toplam uzunluğu 8 mm'dir). Bu model hakkında (2xDHT anılacaktır) 2 kat daha yüksek serum DHT seviyeleri kontrol fareler DHT tedavi olmadan daha üretir. 2xDHT fareler değişiklik bazal serum östradiol, testosteron, LH ve sergi değil değil obezite geliştirmek ve benzer yumurtalık ağırlık, kolesterol, serbest yağ asitleri, leptin, serum düzeyleri göster TNFα ve Il-623,24, bile ilâ 3,5 ay sonra DHT ekleme23,24,25 25 göreli olarak denetler. Ayrıca, zaten PCOS özelliklerini geliştirdik dişiler çiftleşme tarafından15yavru bir hyperandrogenic anne tarafından çevre-metabolik ve üreme sağlığı üzerinde etkisini eğitim görebilirsiniz.

Bu yeni paradigma (NIH ve AE-PCOS toplum kriterlerine uygun) hastalık nispeten benzer bu kadınların androjenler ile PCOS 2 - 3 kat daha yüksek testosteron düzeylerini veya etkilenmemiş kadınlara kıyasla DHT seviyeleri üreterek modelleri. Bununla birlikte, DHT içine kapanık bir kez bu model programlanmış endojen hyperandrogenism değil ve sürekli eksojen DHT tarafından korunur. Bu makalede genel amacı 1 odaklanmaktır) nasıl DHT Pelet; 2) nasıl bir yalın PCOS gibi fare modeli oluşturmak için; 3) stratejileri bu barajlar gelen kadın çoluk çocuk değerlendirmek için. Diğer ölçümler ve fenotipleri değerlendirilmesi bu el yazması ele değil ama5,15,23,24,25,26içinde bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada, detaylı protokol DHT Pelet hazırlık ve ekleme ve üreme ve metabolik testleri için mevcut. Bu çalışmada kullanılan fare karışık bir arka plan (C57/B6, CD1, 129Sv) olduğunu ve gıda ile muhafaza ve ad libitum Broadway araştırma bina hayvan tesiste Johns Hopkins Üniversitesi School of 24 ° c 14/10 h açık/koyu döngüsünde su Tıp. Tüm yordamları Johns Hopkins Üniversitesi hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. PCOS benzer fare modeli oluşturmak

  1. DHT Pelet hazırlık
    1. Otoklav Silastik tüp sterilize etmek için. Bir tıraş bıçağı ile 15 mm uzunluğu Silastik tüp kesme;
    2. Bir tarafta 3 mL şırınga bağlı 20 G körelmenin iğne ile tıbbi yapışkanlı silikon tüp içine enjekte edilerek kapatın. Dalgıç şırınga ve sonra göle eklediğiniz yapışkanı geri olmalıdır. Pistonu reinserted ve yapışkan iğne çıkmaya başlayana kadar itti. Körelmenin iğne 20 G iğne keskin uç tarafında güçlü herhangi bir makasla kesim tarafından yapılır. Silikon tüp uzunluğu post-prodüksiyon kırpma için izin vermek için daha--dan 2 mm olmalıdır;
    3. Gecede Kuru; mühürlü tarafında hava kabarcık açısından kontrol edin. Bu hiçbir hava kabarcıkları ile DHT parçaları için kullanılır. Başkalarının no-DHT denetim granül için kullanılabilir.
    4. Eldiven, maske, gözlük ve önlük giymek DHT Pelet cilde DHT maruz önlemek için bir mahallede yapmadan önce.
    5. Pour DHT toz haline plastik bir ağırlık tekne ve basın yapıştırıcı açık tarafına (A1.1 içinde üretilen) tüpler DHT toz haline şapkalı.
    6. DHT toz doğruldu büyük bir kağıt atacı ile yanından.  DHT (veya istenilen uzunlukta) 4 mm yüksekliğe ulaşıncaya kadar devam edin. DHT uzunluğu cetvelle kontrol ve silikon, Kuru ile açık yan gecede mühür.
    7. Silikon 2 mm uzun uzunluğu yapmak için kapalı her tarafı kesti. Pelet toplam uzunluğu 8 mm olacaktır.
    8. Her iki tarafında boş Silastik tüp kontrol (no-DHT) Pelet olarak kapatın.
    9. Granül (ışık etkilenmemek için) Oda sıcaklığında folyo ile kadar kullanmak sarılmış bir 50 mL konik tüp unutmayın. DHT granül depolama en az 3 ay süreyle tam etkinliğini korumak.
  2. DHT ekleme ve değiştirme
    1. 20 DHT ilâ granül veya denetim granül ayrı ayrı bir 50 mL konik tüp 37 °C için denge ekleme hemen önce 24 h 30 mL steril % 0,9 serum ile sular altında.
    2. Ameliyat, öncesi yüzeyler ve eldiven clidox ile dezenfekte ve çalışma yüzeyleri temiz plastik yedeklenmiş emici kağıt (cerrahi pedi) ile kaplıdır.  Bu hayvanların temas tüm aletleri hayvan tesisi girmeden önceki ısıyla tarafından dekontamine.  Aletleri kuru ve serin önce kullanımı için izin verilir.
    3. 2 aylık dişi fareler kullanılır (4 – 5 fare/kafes). Fareler intraperitoneally Xylazine ile enjekte (3.5 mg/kg bw) ve ketamin (78.8 mg/kg bw) bir insülin Ģırınga kullanarak. Karıştırma ve dozaj anestezi için hesaplamaları Tablo 1' de var.
    4. Yeterli anestezi ayak refleks kaybı tarafından ölçülen elde edilir ve solunum yavaşladı sonra fare ameliyat için hazır.
    5. Çevrenin cilt steril gazlı bez kullanarak betadin ile dezenfekte ve % 70 etanol ile temiz.  Alanı yeniden betadin ile boyalı.
    6. Yaklaşık 5 mm uzunluğu ile boyun yakınındaki deri altına makas bir delik açın. 10 G trochar kullanarak, küçük tünel (15 mm) rostral yönde olun. Pelet dorsally trochar ile eklenir.
    7. Açılış sonra cerrahi yapıştırıcı ile kilitlendi. El ile yaklaşık forseps ve sıvı yapıştırıcı ince bir film için yaklaşık yara kenarları uygulamak için nazik fırça vuruşları ile yara kenarları. Birikimini 3 ince tabakalar Yapıştırıcı Yapıştırıcı yara üzerinde eşit olarak dağıtılır emin olmak için. Yapıştırıcı apposed yara kenarları her tarafında 1 cm genişletmek. Dikiş veya cerrahi klipleri deliği kapatmak için de kullanılabilir. Fareler kafesi, tek tek yer, kurtarma için bir ısı pad ile içine koy. Pelet 4 haftada androjen pozlama sürekli düzeyini korumak için değiştirin. Özgün Pelet kaldırılacak ve A1.15 benzer pozisyonda açıklandığı gibi yeni Pelet eklenir.
    8. Estrous endüstriyel DHT ekleme 3 gün sonra sınayın. Estrous döngüsü aşamasını vajinal sitoloji tarafından değerlendirilir.  Vajinal hücreleri 16 gün üst üste steril serum fizyolojik (yaklaşık 10 µL) vajinal boşluğuna squirt p10 pipettor kullanarak ve serum aynı steril pipet ucu geri çekilmesi toplanır.  Vajinal hücreleri vajinal duvardan derisinin ı serum mix ve toplanır.
    9. Serum hücreleri etiketli bir slayt üzerine yayıldı. Her slayt altı örnekler içerebilir. Slaytlar hangi örneğin her altı yerlerde yerleştirilir dikkat edilmesi gereken etiketlenir.
    10. Sonra serum tamamen slaytta slaytlar hücreleri düzeltmek için % 100 etanol ile bir kaba koymak kurudu. Slaytlar için en az 5 dk sabit ancak sabitleştirici süresiz olarak daha fazla kullanılmasını kadar kalabilir.
    11. Slaytlar için arabellek B her 1 dk. için boyama çözümler ve C. yıkama slaytlar musluk suyu ile ve kuru oda sıcaklığında içine koymak.
    12. Hücre morfolojisi 10 X objektif hafif mikroskop altında incelemek.  Başvurular27,28,29proestrus (P), estrus (E), metestrus (M) ve diestrus (D) ayırt etmek için hücre morfolojisi açıklanmıştır.
    13. Her gün sahne ve gün her aşamada yüzde süresini hesaplamak için toplam sayısı bölü sayısı.
    14. Glikoz toleransı DHT ekleme sonra 21 gün, fareler gecede (16 h) oruç ve 2 g/kg vücut ağırlığı % 20 dekstroz intraperitoneally enjekte sınayın. Bir farenin vücut ağırlığı 25 g ise, örneğin, bu fare % 20 dekstroz 250 µL ile 50 cc (0.5 mL) insülin şırıngayla eklenecek. Glikoz seviyesi 0, 15, 30, 60, 90, kuyruk damar kan örnekleyerek şeker ölçüm ve test şeritler tarafından değerlendirildi 120 dak. Bu anlatılan ayrıntılı olarak başka bir yerde30.
  3. Kan toplama
    1. Kan çeşitli gün DHT ekleme (biz 100 µL için steroid ve 30ul LH/FSH tahlil için koleksiyon ses seviyesini sınırlandırma) sonra 9 ve 10 arasında lanset ile kanama submandibular ven tarafından toplamak. Bu11' de açıklanmıştır.
    2. 4 ˚C 10 dk de 6.000 x g kan santrifüj kapasitesi ve serum katman-80 °C-ebilmek var olmak stok tahlil kadar başka bir 1,5 mL tüp içine toplamak.

2. üreme değerlendirmek profilleri kronik DHT gelen dişi yavru eklenen barajlar

  1. Çiftleşme
    1. Test edilecek dişi fare Pelet ekleme izleyen onbeş gün (yani daha önce yavru dişi fare ile olmuştur) kanıtlanmış bir verimli erkek ile kafes içine taşınır.
    2. Barajı'nın vücut ağırlığı her hafta fare hamile olup olmadığını belirlemek için belge. Bir hafta içinde daha--dan 3 g Barajı ağırlık artar gebelik gösterir.
    3. Kan baraj baraj artan vücut ağırlığı üzerinden bir hafta önce 3 g den büyük gözlemledikten sonra ikinci hafta toplamak.
  2. Ergenlik vajinal açılış ve ilk estrus tarafından değerlendirildi
    1. Vajinal açılış görsel denetim her gün sonra yavrular sütten kesmek tarafından kontrol 21 Doğum sonrası günlük (PND), anogenital mesafeyi ölçmek ve vajinal açılış yaşın kaydetmek.
    2. Bir kez vajina açık, vajinal hücreleri günlük, estrous endüstriyel kontrol 1.2.8–1.2.11 içinde açıklandığı gibi toplamak.
    3. Hücre morfolojisi açıklanan 1.2.12 olarak gözlemlemek ve ilk estrus tüm hücreleri cornified epitel hücreleri vardır tarihi olarak tanımlanır.
  3. Vücut ağırlığı ve kulak yumruk
    1. Mazgal ipucu dövme hamur içine daldırma ve başvuru12 7 PND, açıklandığı gibi her yavru ayak parmağı dövme ile işaretlemek ve fareler her 7 günde yaş 70 gün kadar tartın.
    2. Onları numaralandırmak için kulak yumruk fare Şekil 1 12-16 PND arasında sistem kullanarak. Seks ayırt, ventral vücut yüzeyini inceleyerek, kadın görünür meme gerekir.
    3. 21, 26, 70, kan toplamak PND 1.3.1 içinde yukarıda açıklandığı gibi doğumdan sonra
  4. Hormonal tahlil
    1. Kan serum DHT seviyeleri her iki enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından ölçülür ve sıvı kromatografi tandem tarafından kütle spektrometresi (LC-MS)23,24,31,32. T LC-MS veya bir fare/fare üreme23,24saat içinde Virginia Üniversitesi Ligand tahlil çekirdek Araştırma Merkezi tarafından doğrulandı ELISA ölçülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Serum DHT seviyeleri ve glikoz tolerans testi

DHT seviyeleri toplanan serum her iki ELISA ve LC-MS tarafından ölçüldü protokolü 1,24-1,25 ve 2.9, 3.0 göre. DHT mutlak değerler farklı kütle spektrometresi ve ELISA, ancak, göreli kat no-DHT ekleme her iki deneyleri benzer ve genelinde15,23,24 ( deneyler DHT vs (yaklaşık logosuna 2 kat) arasında Şekil 2A).  DHT seviyeleri önyargı gebelik DHT ve no-DHT farelerde aracılığıyla önemli ölçüde yükselmiştir, ancak, DHT seviyeleri (yaklaşık 14 gün) 2 kat no-DHT fareler pregestational her ikisi de (çiftleşme önce bir gün) göre DHT farelerde yüksek ve gebelik zaman puan (Şekil 2B). ELISA ve LC-MS DHT mutlak seviyesi farklıdır beri göreli düzeylerini hesaplama (değişiklik kat: DHT seviyesi ile DHT ekleme vs no-DHT ekleme) deneyleri içinde. 2 hafta DHT ekleme iletişim kuralı 1.23 göre takip no-DHT (Şekil 3) göre glikoz tolerans bozukluğu olan DHT ile dişi fareler gösterdi.

Dişi yavrular vücut ağırlığı ve ergenlik

Genellikle infertil olsa da, bazı baraj hamile ve yavru var (yaklaşık % 30 gebelik oranı, doğurganlık 10 test baraj böylece biz genellikle 3 hamile barajlar almak, protokol 2.1 bakın). Bu nedenle kadın çoluk çocuk üzerinde barajlar kronik androjen etkileri değerlendirebilir. Eklenen DHT barajlar gelen kadın çoluk çocuk DHT kızları denir ve bu no-DHT eklenen barajlar no-DHT kızları denir. Vajinal açılış yaş için no-DHT ve DHT-kız arasında hiçbir fark görülmektedir. Ancak, DHT-kız ilk estrus önemli ölçüde ertelendiği (no-DHT kızı için gün 35; DHT-kız için 42 gün). Bu no-DHT kızları göre 35 ve 42 PND DHT kızları içinde düşük vücut ağırlığı ile ilişkilidir (Şekil 4; Protokolü 2,4-2,7 bakın).

Hormon düzeyleri ve içinde kadın çoluk çocuk estrous endüstriyel

Testosteron düzeylerinin 21 PND değişmiş değil ama 26PND azalır. Bununla birlikte, testosteron 70 PND artırılır (Şekil 5, protokolü 2,9 – 3.0 bakın). Yetişkin DHT kızı gösterdi bozulduğu, estrous endüstriyel yetişkin no-DHT kızları, önemli ölçüde uzun kez g ve P ve E zaman daha az yaşayan göre (Şekil 6A, B; protokolündeki 1.17-1.22 yöntemine göre).

Figure 1
Şekil 1: Mouse tanıma. Bir kafes içinde fare numarasını temsil etmek için farklı konumda yumruk kulak faredir. Fare #1-3 doğru kulak yumruk ve #4-6 dorsally görüntülendi sol kulaðýnýzda yumruk attı. #1 ve #4 pozisyonda kulaklara fare yumruk #7 mı; 2 ve 5, #8'dir; 3 ve 6 #9 arasındadır; sol kulak ortasında #10 olduğunu; #11 1 ve 10 konumunda olduğunu; vb Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Serum DHT seviyeleri. Serum DHT seviyeleri. (A)Serum DHT seviyeleri ölçülen ELISA ve kütle spektrometresi tarafından. Mutlak değerler farklı olmasına rağmen iki deneyleri benzer gösterdi DHT ve no-DHT arasındaki farklar kat tedavi fareler. (B) Serum DHT kat değişiklik olmayan DHT seviyeleri preconceptional ve gebelik süresi noktalarda göre. Hayır-DHT (açık bar) ve DHT implante (siyah çubuklar) kadın fareler daha önce (bir gün önce çiftleşme) ve gebelikte (yaklaşık 14 gün gebelik). Değerler şunlardır: ortalama ±S.E.M. N = 5-8 grubu başına. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: glikoz tolerans testi (GTT). Hayır-DHT ve implante DHT fareler gecede oruç ve glikoz (2 g/kg BW) intraperitoneally enjekte ettiler ve kuyruk kan şekeri farklı zaman noktalarda ölçüldü. Tedavi DHT fareler önemli ölçüde artmış glikoz düzeyleri arasında 30-120 dk no-DHT tedavi fareler için karşılaştırıldığında gösterdi. Değerler şunlardır: ortalama ±S.E.M. N = 4-12 Grup başına. * P < 0,05 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: önceden hamilelik anne DHT tedavi düşük vücut ağırlığı içinde 35 ve 42 PND adlı kadın çoluk çocuk sonuçlandı. Vücut ağırlığı (y ekseni) Doğum sonrası günlerde gösterilen (x ekseni) olarak ölçüldü. DHT maruz çoluk çocuk: siyah bar; yok-DHT çoluk çocuk: açık bar. Değerler şunlardır: ortalama ±S.E.M. N = 9-14 grubu başına. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Serum DHT seviyeleri. Kan PND 21, 26, 70 sabah sabah toplanmıştır. Kadın çoluk no-DHT kızları (açık bar) ve DHT-kızları (siyah çubuklar) serum DHT seviyeleri (y ekseni). Değerler şunlardır: ortalama ±S.E.M. N = 5-11 Grup başına. Bu rakam başvuru2değiştirilmiş olanBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: kronik anne androjen fazlalığı neden rahatsız endüstriyel yetişkin kızları için. (A)dişi yavru estrous endüstriyel gösterimi. (B) harcanan sürenin yüzdesi estrous her aşamada (y ekseni) 15 saytolojik incelenmesi vajinal hücreleri tarafından ölçülen gün (x ekseni) boyunca. Değerler şunlardır: ortalama ±S.E.M. N = 5-9 grup başına. Estrous döngüsü aşamasını (y ekseni). G: bir araya geldi/diestrus; P: proestrus; E: estrus. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Table 1
Tablo 1: Ketamin/xylazine kokteyl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hyperandrogenism PCOS önemli bir özelliktir. Bu protokol için kullanılan (iki yüksek no-DHT farelerde DHT farelerde kat) serum DHT seviyeleri bu önceki çalışmalarda diğer müfettişler tarafından bildirilen daha düşüktür ve PCOS5,19kadınlarla orantılı olarak taklit etmek için kalibre, 20,21. Diğer modelleri farklı olarak, vücut ağırlığı ve 3.5 ay sonra DHT ekleme23,24ile no-DHT fareler karşılaştırıldığında tüm vücut kompozisyonu logosuna 2 kat Bu DHT model değiştirmez. Bu yetişkin implante DHT fareler tarafından sürekli eksojen DHT sürdürülür. Her ne kadar tüm vücut kompozisyonu değiştirilmez, değişiklik yapısı ve fonksiyonu adiposit yalın PCOS kadınlar20dakikaya gözlenmiştir. Dikkatli bir inceleme farklı depoları, garanti kapsamındadır. Biz Engelli estrous endüstriyel DHT ekleme15 sonra bir hafta içinde gözlenen ve bir 3 ay doğurganlık değerlendirme23sırasında doğurganlık azalır.

Hamile olsun başardık dişi fareler küçük alt DHT tedavi ve çoluk çocuk pre-gestational, gebelik ve hemşirelik hyperandrogenemia fetal gelişim üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir fırsat sağladı. Birden fazla üreme kadın düzgün kontrollü bir deney almak için gerekli olan o en az 10 çiftleşme çift gerektirir kurulmuş. DHT kızları sadece gebelik sırasında ve daha önce 21 PNA DHT için sunulur. DHT kızları no-DHT kızları, obezite ya da kilolu gözlenen fizyolojik etkileri15karıştırıcı bir değişkende olmadığını belirten kıyasla düşük vücut ağırlığı gösterdi.

İlk çalışmalarda, zaman içinde serum DHT seviyeleri geçerliliği. Serum DHT 1, 2, 3 ve 4 hafta23,24hiçbir önemli farklılıklar bulduk. DHT seviyeleri 4 hafta sonra reddetti, bu nedenle, biz 4 haftada DHT Pelet yerine. Azaltılmış bile onlar için 3 ay oda sıcaklığında saklanan DHT etkilerini uygulamıyor. Granül tuz ekleme hemen önce 24 h için kuluçkaya önemlidir. Hatta sürümünden DHT Pelet (DHT yayın yavaş yavaş Silastik tüp yoluyla) için kritik bir adımdır. Estrous endüstriyel DHT ekleme 3 gün sonra incelenebilir ve hücre ile tanıdık27türleri sonra vajinal smear ayrıca doğrudan içinde serum kuru olmadan ve leke hafif bir mikroskop altında incelenebilir.

Metabolik fenotip, ya da sonra DHT ekleme 2 hafta (14 gün) tespit edilebilir. Rağmen hiçbir zayıflama için üreme disfonksiyon görülmektedir ancak, metabolizma (28 gün) dördüncü haftanın sonunda DHT etkilerini biraz, zayıflatılmış. Bu nedenle, metabolizma işlev normalde vasıl belgili tanımlık son 2, 3, 5, 6, 7 hafta (14, 21, 35, 42 ve 49 gün, 2 kez ekleme toplam) değerlendirmek. Laboratuarda yavaş salınımlı steroid briketler üretimi yaygın olarak farklı laboratuvarlar33,34tarafından kabul edilmiş olgun bir tekniktir.  Bu 50 $/ Pelet (90 gün DHT cips, 5 mg/Pelet, Ira, NA-161) aşabilir piyasada bulunan ürünler, düşük maliyetli bir alternatif temsil eder. Ticari ürün bu raporda açıklanan Pelet her 28 günde değiştirilmesi gerekir iken en fazla 90 gün, değiştirilecek ihtiyaç olmaması avantajı var mı. Büyük ölçekli çalışmalar için Müfettişler bile eklenen çalışma ile granül 4 haftada değiştirmek için gereken kendi Pelet üretmek daha ekonomik bulabilirsiniz.

Başkaları tarafından gözlemlediği gibi gelişimsel arasında üreme işlevi modelleri Doğum görünmüyor sonra artan LH pulsatil sıklığı ve bu yükseltilmiş androjen farklı patolojik mekanizmaları gelin kronik DHT implantasyon ile indüklenen ve geç başlangıçlı hyperandrogenism satın aldı. Bu iletişim kuralıyla, kronik hyperandrogenic barajlar gelen kadın çoluk çocuk araştırmak edebiliyoruz. Üreme (Örneğin folikül gelişim, ovulasyon (corpora lutea) ve doğurganlık) ve metabolik sonuçları (Örneğin glikoz veya lipid metabolizması, vücut kompozisyonu, yağ depo tam olarak anlamaya çalışmak için bu modeli kullanan bir Dağıtım). Bizim iletişim kuralı yükselmiş androjen indüklenen üreme ve metabolik fonksiyon bozukluğu araştırmak için yeni araç ekler; ve bu obezite nedeniyle olabilir tarafından yükseltilmiş androjen neden patofizyolojisi ayrışıp. Bu model içinde dişi yükseltilmiş androjenler doku belirli etkilerini araştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, rapor burada DHT Pelet üretimi için metodoloji diğer steroid hormonların çalışma odasına kolayca uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

İfşa etmek bir şey yok.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe S.W. için R00-HD068130) ve Baltimore diyabet araştırma merkezi tarafından desteklenmiştir: pilotlar ve fizibilite Grant (için S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
  2. Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implications of polycystic ovary syndrome for pregnancy and for the health of offspring. Obstet. Gynecol. 125 (6), 1397-1406 (2015).
  3. de Wilde, M. A., et al. Cardiovascular and Metabolic Health of 74 Children From Women Previously Diagnosed With Polycystic Ovary Syndrome in Comparison With a Population-Based Reference Cohort. Reprod. Sci. , 1933719117749761 (2018).
  4. Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
  5. van Houten, E. L., Kramer, P., McLuskey, A., Karels, B., Themmen, A. P., Visser, J. A. Reproductive and metabolic phenotype of a mouse model of PCOS. Endocrinology. 153 (6), 2861-2869 (2012).
  6. Cardoso, R. C., Puttabyatappa, M., Padmanabhan, V. Steroidogenic versus Metabolic Programming of Reproductive Neuroendocrine, Ovarian and Metabolic Dysfunctions. Neuroendocrinology. 102 (3), 226-237 (2015).
  7. Dumesic, D. A., Abbott, D. H., Padmanabhan, V. Polycystic ovary syndrome and its developmental origins. Rev. Endocr. Metab Disord. 8 (2), 127-141 (2007).
  8. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  9. Kelley, S. T., Skarra, D. V., Rivera, A. J., Thackray, V. G. The Gut Microbiome Is Altered in a Letrozole-Induced Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome. PLoS One. 11 (1), e0146509 (2016).
  10. Kafali, H., Iriadam, M., Ozardali, I., Demir, N. Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease. Arch. Med. Res. 35 (2), 103-108 (2004).
  11. Maliqueo, M., Benrick, A., Stener-Victorin, E. Rodent models of polycystic ovary syndrome: phenotypic presentation, pathophysiology, and the effects of different interventions. Semin. Reprod. Med. 32 (3), 183-193 (2014).
  12. Yanes, L. L., et al. Cardiovascular-renal and metabolic characterization of a rat model of polycystic ovary syndrome. Gend. Med. 8 (2), 103-115 (2011).
  13. Kauffman, A. S., et al. A Novel Letrozole Model Recapitulates Both the Reproductive and Metabolic Phenotypes of Polycystic Ovary Syndrome in Female Mice. Biol. Reprod. 93 (3), 69 (2015).
  14. Filippou, P., Homburg, R. Is foetal hyperexposure to androgens a cause of PCOS? Hum. Reprod. Update. 23 (4), 421-432 (2017).
  15. Wang, Z., Shen, M., Xue, P., DiVall, S. A., Segars, J., Wu, S. Female Offspring From Chronic Hyperandrogenemic Dams Exhibit Delayed Puberty and Impaired Ovarian Reserve. Endocrinology. 159 (2), 1242-1252 (2018).
  16. Abbott, D. H., Barnett, D. K., Bruns, C. M., Dumesic, D. A. Androgen excess fetal programming of female reproduction: a developmental aetiology for polycystic ovary syndrome? Hum. Reprod. Update. 11 (4), 357-374 (2005).
  17. Abbott, D. H., Dumesic, D. A., Franks, S. Developmental origin of polycystic ovary syndrome - a hypothesis. J. Endocrinol. 174 (1), 1-5 (2002).
  18. Padmanabhan, V., Veiga-Lopez, A. Sheep models of polycystic ovary syndrome phenotype. Mol. Cell. Endocrinology. 373 (1-2), 8-20 (2013).
  19. Pierre, A., et al. Dysregulation of the Anti-Mullerian Hormone System by Steroids in Women With Polycystic Ovary Syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 102 (11), (2017).
  20. Dumesic, D. A., et al. Hyperandrogenism Accompanies Increased Intra-Abdominal Fat Storage in Normal Weight Polycystic Ovary Syndrome Women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101 (11), 4178-4188 (2016).
  21. Fassnacht, M., Schlenz, N., Schneider, S. B., Wudy, S. A., Allolio, B., Arlt, W. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: Increased peripheral 5 alpha-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (6), 2760-2766 (2003).
  22. Dikensoy, E., Balat, O., Pence, S., Akcali, C., Cicek, H. The risk of hepatotoxicity during long-term and low-dose flutamide treatment in hirsutism. Arch. Gynecol. Obstet. 279 (3), 321-327 (2009).
  23. Ma, Y., et al. Androgen Receptor in the Ovary Theca Cells Plays a Critical Role in Androgen-Induced Reproductive Dysfunction. Endocrinology. , en20161608 (2016).
  24. Andrisse, S., et al. Low Dose Dihydrotestosterone Drives Metabolic Dysfunction via Cytosolic and Nuclear Hepatic Androgen Receptor Mechanisms. Endocrinology. , en20161553 (2016).
  25. Andrisse, S., Billings, K., Xue, P., Wu, S. Insulin signaling displayed a differential tissue-specific response to low-dose dihydrotestosterone in female mice. Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 314 (4), E353-E365 (2018).
  26. van Houten, E. L., Visser, J. A. Mouse models to study polycystic ovary syndrome: a possible link between metabolism and ovarian function? Reprod. Biol. 14 (1), 32-43 (2014).
  27. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr. Protoc. Neurosci. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).
  28. Wu, S., et al. Conditional knockout of the androgen receptor in gonadotropes reveals crucial roles for androgen in gonadotropin synthesis and surge in female mice. Mol. Endocrinol. 28 (10), 1670-1681 (2014).
  29. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  30. Dinger, K., et al. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  31. Nilsson, M. E., et al. Measurement of a Comprehensive Sex Steroid Profile in Rodent Serum by High-Sensitive Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Endocrinology. 156 (7), (2015).
  32. McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).
  33. Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats. J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).
  34. Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. 17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells. J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 140 polikistik over sendromu dihidrotestosteron (DHT) Estrous endüstriyel androjen ergenlik dişi yavru
Polikistik over sendromu çalışmaya Hyperandrogenic fare modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., … More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter