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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1,4, 1,4,5
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Descriviamo lo sviluppo di un modello murino di PCOS-come magro con pellet di diidrotestosterone per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Abstract

Iperandrogenismo svolge un ruolo critico nella funzione riproduttiva e metabolica nelle femmine ed è il segno distintivo della sindrome dell'ovaio policistico. Lo sviluppo di un modello di topo PCOS-come magro che imita le donne con PCOS è clinicamente significativo. In questo protocollo, descriviamo un tale modello. Con l'inserimento di una lunghezza di 4 mm di pellet di polvere DHT (diidrotestosterone) cristallo (lunghezza totale di pellet è di 8 mm), e sostituirlo ogni mese, siamo in grado di produrre un modello del mouse di PCOS-come con piega di 2 livelli DHT siero superiore rispetto ai topi non impiantati con DHT (no-DHT). Abbiamo osservato la disfunzione metabolica e riproduttiva senza modificare il peso corporeo e la composizione corporea. Mentre che esibiscono un alto grado di sterilità, un piccolo sottoinsieme di questi topi femminili PCOS-come può rimanere incinto e la loro prole pubertà ritardata e testosterone aumentato di adulti. Questo modello di mouse magra PCOS-come è uno strumento utile per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Introduction

Iperandrogenismo è il segno distintivo della sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) secondo criteri NIH e dell'eccesso dell'androgeno e della società PCOS (AE-PCOS). Le donne con PCOS hanno difficoltà a rimanere incinta e hanno un aumentato rischio di complicazioni di gravidanza1. Anche se sono incinta, loro prole femminile hanno un2,di esiti negativi per la salute3. Modelli animali sono stati sviluppati utilizzando varie strategie4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e che esibiscono molte caratteristiche di PCOS (anovulazione, e o alterata tolleranza al glucosio e insulina) con aumento del peso corporeo e l'obesità associata con ingrossamento degli adipociti dimensioni e il peso maggiore del adipocyte. Esistono due strategie principali per produrre modelli animali che vengono utilizzati per studiare la PCOS. Uno è il trattamento con alti livelli di androgeni direttamente (androgeni esogeni iniezione/inserimento) o indirettamente (ad esempio bloccando la conversione di androgeni in estrogeni con inibitore dell'aromatasi) dopo nascita13. Un altro è di hyperexposure fetale di androgeni durante gestazione14,15 per studiare la prole. Ad esempio, prole femminile da scimmia rhesus16,17, pecore18e roditori esposti a maschi livelli di androgeni durante il periodo intrauterino sviluppare tratti di PCOS-come più tardi nella vita. Questi modelli significativamente migliorato la nostra comprensione degli effetti androgeni e programmazione fetale e uterini effetti ambientali. Tuttavia, questi modelli hanno i loro limiti: 1) gli animali sviluppano obesità e pertanto risulta difficile separare gli effetti di iperandrogenismo da obesità indotta riproduttivo e disfunzione metabolica; 2) prima della gravidanza, le donne con PCOS presentano già alti livelli di androgeni, così gli ovociti sono stati esposti agli androgeni in eccesso prima della fecondazione; 3) le dosi farmacologiche di testosterone (T) o diidrotestosterone (DHT) utilizzato dopo la nascita o durante la gestazione potrebbero non riflettere l'ambiente dell'androgeno di PCOS. Livelli di testosterone e DHT sono stati misurati nel fluido follicolare ovarico e/o del siero, e testosterone ed i livelli di DHT sono 1.5 a 3,9 volte superiore nelle donne con PCOS5,19,20,21 ,22,23 rispetto alle donne inalterate. Abbiamo creato un topo adulto modello23,24,25 che si sviluppa la disfunzione metabolica e riproduttiva entro due settimane dall'inizio dell'esposizione cronica di DHT dall'inserimento di una pallina con lunghezza di 4 mm polvere di cristallo DHT (lunghezza totale di pellet è di 8mm). Questo modello produce livelli DHT del siero che sono circa 2 volte superiore (denominato 2xDHT) di quella dei topi di controllo senza trattamento DHT. I topi di 2xDHT non presentano alterazioni di basale del siero, testosterone, LH e non sviluppare l'obesità e mostrare peso ovarico simile, i livelli sierici di colesterolo, acidi grassi liberi, leptina, TNFα e IL-623,24, 25 relativi a controlli anche fino a 3,5 mesi dopo DHT inserimento23,24,25. Inoltre, con l'accoppiamento le femmine che hanno già sviluppato caratteristiche di PCOS, possiamo studiare l'impatto di un ambiente materno iperandrogenica sulla salute metabolica e riproduttiva della prole15.

Questo nuovo paradigma (pertinente ai criteri NIH e società AE-PCOS) modella la malattia producendo relativamente simili livelli di androgeni a quelli delle donne con PCOS 2 - 3 volte più alto testosterone o i livelli di DHT rispetto alle donne inalterate. Tuttavia, questo modello è garantito dal continuo DHT esogeno e non da iperandrogenismo endogeno programmato una volta DHT è ritirato. L'obiettivo generale di questo articolo è di concentrarsi su 1) come fare il pellet DHT; 2) come generare un lean-PCOS come modello murino; 3) strategie per valutare la prole femminile da queste dighe. Altre misure e la valutazione di fenotipi non vengono affrontati in questo manoscritto, ma possono essere trovati in5,15,23,24,25,26.

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Protocol

Qui, presentiamo protocolli dettagliati per inserimento e DHT pellet preparazione e per test riproduttivi e metabolici. I topi utilizzati in questo studio erano un fondo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e sono stati mantenuti con cibo e acqua ad libitum in un ciclo luce/buio 14/10 h a 24 ° C nella struttura animale Broadway Research Building presso la Johns Hopkins University School of Medicina. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali di Johns Hopkins University.

1. creare il modello del topo PCOS-come

  1. Preparazione di pellet DHT
    1. Tubi di silastic autoclave per sterilizzare. Tagliare tubi di silastic per una lunghezza di 15 mm con una lama di rasoio;
    2. Sigillare un lato con l'iniezione di silicone adesivo medico nel tubo con un ago smussato 20 G collegato ad una siringa da 3 mL. Stantuffo dovrebbe essere ritirato dalla siringa e poi adesivo inserito nel serbatoio. Lo stantuffo viene reinserito e adesivo spinto verso il basso fino a quando non comincia ad emergere dall'ago. L'ago blunted fatta dal lato punta tagliente dell'ago 20 G di taglio con le forbici forte. La lunghezza del silicio nel tubo dovrebbe essere più di 2 mm consentono un taglio di post-produzione;
    3. Asciugare durante la notte; Verifica per le bolle d'aria sul lato sigillato. Quelli senza bolle d'aria sono usati per pellet di DHT. Gli altri può essere utilizzati per il no-DHT controllo pellet.
    4. Indossare guanti, maschera, occhiali e camice da laboratorio prima di effettuare il DHT-pellet in un cappuccio per evitare l'esposizione DHT per la pelle.
    5. Polvere DHT di versare in una plastica pesare barca e premere il lato aperto dell'adesivo ricoperto di tubi (prodotte in a 1.1) alla polvere di DHT.
    6. Polvere DHT possa essere pestata con una graffetta che viene raddrizzata.  Proseguire fino a DHT raggiunge un'altezza di 4 mm (o la lunghezza desiderata). Controllare la lunghezza di DHT con un righello e sigillare il lato aperto con silicio, asciutto durante la notte.
    7. Tagliare ogni lato sigillato per rendere la lunghezza di silicio 2 mm di lunghezza. La lunghezza totale del pellet sarà 8 mm.
    8. Guarnizione di entrambi i lati del tubo di silastic vuota come pellet di controllo (n-DHT).
    9. Mantenere il pellet in una provetta conica 50 mL avvolta con foglio (per evitare l'esposizione alla luce) a temperatura ambiente fino all'utilizzo. I pellet DHT mantengono piena efficacia per almeno 3 mesi di deposito.
  2. Sostituzione e inserimento di DHT
    1. Fino a 20 DHT pellet o pellet di controllo sono sommerse separatamente in una provetta conica da 50 mL con 30 mL di soluzione sterile salina 0,9% per 24 h a 37 °C di equilibramento appena prima dell'inserimento.
    2. Prima dell'intervento, le superfici e i guanti vengono disinfettati con clidox e le superfici di lavoro sono coperti con carta assorbente sostenuto plastica pulito (tampone chirurgico).  Tutti gli strumenti che vengono a contatto con animali sono decontaminati prima di entrare la struttura animale in autoclave.  Gli strumenti potranno asciutto e fresco prima dell'uso.
    3. 2-mese-vecchi topi femminili sono utilizzati (4 – 5 topi/gabbia). I topi sono iniettati intraperitonealmente con xilazina (3,5 mg/kg bw) e ketamina (78,8 mg/kg bw) utilizzando una siringa da insulina. Calcoli per miscelazione e dosaggio di anestesia è nella tabella 1.
    4. Dopo un'anestesia adeguata è raggiunto, come misurato dalla perdita del riflesso di punta e rallentato la respirazione, il mouse sarà essere preparato per la chirurgia.
    5. Disinfettare la pelle della zona con betadine con garza sterile e pulire con etanolo al 70%.  L'area sarà ancora dipinto con betadine.
    6. Tagliare un foro di circa 5 mm lunghezza con forbici sotto la pelle vicino al collo. Utilizzando un trochar 10 G, fare un piccolo tunnel (15 mm) in direzione rostrale. Il pellet viene inserito dorsalmente con il trochar.
    7. L'apertura viene quindi sigillato con adesivo chirurgico. Manualmente approssimativo la ferita bordi con forcipe e tratti delicate spazzolatura per applicare un sottile strato di adesivo liquido per i bordi della ferita approssimata. Strati sottili di accumulo 3 di adesivo per garantire che l'adesivo è distribuito uniformemente sopra la ferita. L'adesivo deve estendersi di 1 cm su ogni lato dei bordi della ferita apposed. Sutura o clip chirurgiche utilizzabile anche per chiudere il foro. Rimettere topi in gabbia, alloggiato individualmente, con una piastra di calore per il recupero. Sostituire il pellet ogni 4 settimane per mantenere costante il livello di esposizione dell'androgeno. Il pellet originale verrà rimosso e verrà inserito nuovo pellet come descritto in A1.15 in posizione simile.
    8. Prova ciclicità estro dopo 3 giorni di inserimento di DHT. Fase del ciclo estrale è valutata tramite citologia vaginale.  Le cellule vaginali sono raccolti per 16 giorni consecutivi utilizzando una pipetta p10 a schizzare (circa 10 µ l) di soluzione salina sterile nella cavità vaginale e poi ritirare la soluzione fisiologica con la stessa pipetta sterile.  Le cellule vaginali sloughed da parete vaginale mescolano con soluzione fisiologica e sono raccolte.
    9. Diffondere la soluzione fisiologica con cellule su un vetrino con etichetta. Ogni diapositiva può contenere sei campioni. Diapositive sono etichettati per notare quale campione viene messo in ognuna delle sei location.
    10. Dopo la soluzione salina è completamente asciugato sulla diapositiva, mettere le diapositive in un contenitore con etanolo al 100% per fissare le cellule. Diapositive è opportuno fissare per almeno 5 min, ma possono rimanere in fissativo indefinitamente fino al successivo utilizzo.
    11. Inserire diapositive in colorazione soluzioni per 1 minuto ogni buffer B e diapositive C. Wash con acqua di rubinetto e asciugare a temperatura ambiente.
    12. Esaminare la morfologia delle cellule sotto un microscopio chiaro obiettivo di 10 X.  Morfologia delle cellule per distinguere proestro (P), estro (E), Metaestro (M) e diestro (D) è descritto in riferimenti27,28,29.
    13. Conteggio i giorni in ogni fase e dividono per il numero totale di giorni per calcolare la percentuale di tempo in ogni fase.
    14. Test tolleranza al glucosio in 21 giorni dopo l'inserimento di DHT di digiuno durante la notte i topi (16h) e iniettare 2 g/kg di peso corporeo di destrosio 20% intraperitonealmente. Ad esempio, se un peso corporeo di mouse è di 25 g, questo mouse sarà iniettato con 250 µ l di destrosio 20% con una siringa da insulina 50 cc (0,5 mL). I livelli del glucosio sono valutati da strisce glucometer e test mediante un campione di sangue dalla vena di coda a 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Questo è descritto dettagliatamente altrove30.
  3. Raccolta del sangue
    1. Raccogliere il sangue ai vari giorni dopo l'inserimento di DHT (limitiamo il volume di raccolta da 100 µ l per steroidi e 30ul per dosaggio di LH/FSH) tra il 9 e 10 dalla vena sottomandibolare sanguinamento con la lancetta. Questo è descritto in11.
    2. Centrifugare il sangue a 6.000 x g a 4 ˚C per 10 min e raccogliere il livello del siero in un'altra provetta da 1,5 mL che possa essere conservata a-80 °C fino al dosaggio.

2. valutare riproduttiva profili della prole femminile da cronicamente DHT inserito dighe

  1. Accoppiamento
    1. Nella gabbia con un maschio fertile provata (che in precedenza ha avuto cuccioli con un topo femmina) viene spostato il mouse femminile da sottoporre alle 15 giorni dopo l'inserzione della pallina.
    2. Documento di peso corporeo di diga ogni settimana per determinare se il mouse è incinto. Diga aumenti di peso di oltre 3 g in una settimana indica gravidanza.
    3. Raccogliere il sangue delle dighe, la seconda settimana dopo osserviamo il peso corporeo aumentato delle dighe superiori a 3 g dalla settimana prima.
  2. Pubertà valutata dall'apertura vaginale e primo estro
    1. Verifica apertura vaginale mediante ispezione visiva ogni giorno dopo i cuccioli sono svezzati a 21 giorno postnatale (PND), misurare la distanza anogenital e registrare l'età dell'apertura vaginale.
    2. Una volta che si apre la vagina, raccogliere le cellule vaginali al giorno, come descritto in 1.2.8–1.2.11 per verificare ciclicità estro.
    3. Osservare la morfologia delle cellule come descritto 1.2.12, e il primo estro è definita come la data che tutte le cellule sono cellule epiteliali cornificate.
  3. Pugno dell'orecchio e del peso del corpo
    1. Immergere la lancetta punta nella pasta tatuaggio e contrassegnare ogni cucciolo con il tatuaggio sulla punta, come descritto nel riferimento12 alle 7 PND e pesare topi ogni 7 giorni fino a 70 giorni di età.
    2. Topi di pugno di orecchio di numerarli utilizzando il sistema in Figura 1 tra 12 e 16 PND. Per distinguere il sesso, esaminare il lato ventrale del corpo, le femmine avranno capezzoli visibili.
    3. Raccogliere il sangue alle 21, 26, 70 PND dopo la nascita come descritto sopra in 1.3.1
  4. Analisi ormonale
    1. I livelli di DHT in siero di anima sono misurati da entrambi analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) e di cromatografia liquida tandem mass spettrometria (LC-MS)23,24,31,32. T è misurata da LC-MS, o un ratto/topo ELISA che è stato convalidato dal Università di Virginia Ligand Assay nucleo nel centro di ricerca in riproduzione23,24.

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Representative Results

Livelli sierici di DHT e test di tolleranza al glucosio

I livelli di DHT sono stati misurati dal siero raccolto da entrambi ELISA e mediante LC-MS secondo protocollo 1,24-1,25 e 2.9, 3.0. I valori assoluti DHT sono diversi tra spettrometria di massa ed ELISA, tuttavia, la relativa piega (circa 2 volte) di DHT vs no-DHT inserimento è simile in entrambe le analisi e attraverso esperimenti15,23,24 ( Figura 2A).  I livelli di DHT sono aumentati significativamente dal preconcetto attraverso la gravidanza in topi no-DHT e di DHT, tuttavia, i livelli di DHT sono 2 volte più alta nei topi DHT rispetto ai topi no-DHT sia pregestational (un giorno prima dell'accoppiamento) e gestazionale (circa 14 giorni) intervalli di tempo (Figura 2B). Dato che i livelli assoluti di DHT differiscono tra ELISA e LC-MS, calcoliamo livelli relativi (piegare cambiamento: livello di DHT con inserimento di DHT inserimento vs no-DHT) all'interno di saggi. I topi femminili con DHT ha mostrato alterata tolleranza al glucosio rispetto al no-DHT (Figura 3) a 2 settimane dopo l'inserzione di DHT secondo protocollo 1.23.

Prole femminile corpo peso e pubertà

Mentre generalmente infertili, alcune dighe rimanere incinte e avere cuccioli (circa il 30% tasso di gravidanza, quindi test di fertilità di 10 dighe ci sarà solitamente ottenere incinte 3 dighe, riferisca al protocollo 2.1). Pertanto possiamo valutare gli effetti dell'androgeno cronica in dighe sulla prole femminile. Prole femminile da DHT inserito dighe sono chiamati DHT-figlie, e quelli da no-DHT inserito dighe sono chiamati figlie no-DHT. Abbiamo non osservato alcuna differenza tra n-DHT e DHT-figlie per l'età dell'apertura vaginale. Tuttavia, il primo estro di DHT-figlie è ritardato significativamente (giorno 35 per la figlia no-DHT; giorno 42 per DHT-figlia). Questo è associato con peso corporeo ridotto alle PND sia 35 e 42 in DHT-figlie relative figlie no-DHT (Figura 4; riferirsi al protocollo 2.4-2.7).

Livelli ormonali e ciclicità estro in prole femminile

I livelli del testosterone non sono alterati alle 21 PND, ma sono ridotti a 26PND. Tuttavia, il testosterone è aumentato a 70 PND (Figura 5, riferisca al protocollo 2,9-3,0). Figlie DHT ha mostrato perturbato estro ciclicità rispetto alle figlie adulto no-DHT, vivendo tempi significativamente più lunghi in g e meno tempo in P ed E (Figura 6A, B; secondo il metodo nel protocollo 1.17 – 1,22).

Figure 1
Figura 1: Mouse identificazione. All'interno di una gabbia, mouse è orecchio perforato alla posizione differente per rappresentare il numero del mouse. Mouse n. 1 a 3 è un pugno sull'orecchio destro, e #4 a 6 è un pugno sull'orecchio sinistro hanno visualizzato dorsalmente. Se il mouse è perforato sulle orecchie sia #1 e #4 posizione, è #7; a 2 e 5, è #8; a 3 e 6 è #9; a metà dell'orecchio sinistro è #10; in posizione 1 e 10 è #11; ecc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: siero DHT livelli. Livelli sierici di DHT. (A) i livelli del siero DHT sono misurati da ELISA e spettrometria di massa. Anche se i valori assoluti sono diversi, i due dosaggi ha mostrati simili piegare le differenze tra DHT e no-DHT topi trattati. (B) variazione piega siero DHT rispetto ai livelli di DHT non a intervalli di tempo preconcezionale e gestazionale. No-DHT (bar aperto) e topi femminili di DHT-impiantati (barre nere) prima (un giorno prima dell'accoppiamento) e durante la gravidanza (circa 14 giorni di gestazione). Sono valori medi ±S.E.M. N = 5-8 per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: test di tolleranza al glucosio (GTT). No-DHT e DHT impiantati nei topi erano a digiuno durante la notte e glucosio (2G/kg BW) è stato iniettato intraperitonealmente e coda di glucosio nel sangue è stata misurata a intervalli di tempo differenti. DHT trattati topi hanno mostrato livelli significativamente aumentato del glucosio tra 30 e 120 min rispetto ai topi trattati no-DHT. Sono valori medi ±S.E.M. N = 4-12 per ogni gruppo. * P < 0.05 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: trattamento di pre-gravidanza materno DHT ha provocato peso corporeo ridotto in prole femminile a 35 e 42 PND. Peso corporeo (asse y) è stato misurato nei giorni post-partum come mostrata (asse x). Prole esposta al DHT: barra nera; senza prole – DHT: open bar. Sono valori medi ±S.E.M. N = 9-14 per ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: siero DHT livelli. Sangue è stato raccolto al mattino su PND 21, 26, 70 al mattino. Livelli del siero DHT (asse y) da prole femminile delle figlie di n-DHT (bar aperto) e DHT-figlie (barre nere). Sono valori medi ±S.E.M. N = 5-11 per ogni gruppo. Questa figura è stata modificata da riferimento2Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: eccesso dell'androgeno materna cronica conduce alla ciclicità disturbato in figlie adulte. (A) rappresentazione della ciclicità estro della prole femminile. (B) la percentuale di tempo trascorso in ciascuna fase di estro (asse y) durante 15 giorni (asse x) misurate da esame citologico delle cellule vaginali. Sono valori medi ±S.E.M. N = 5-9 per ogni gruppo. La fase del ciclo estrale (asse y). G: incontrato/diestro; P: proestro; E: estro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: Chetamina/xilazina cocktail.

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Discussion

Iperandrogenismo è una caratteristica fondamentale di PCOS. I livelli del siero DHT (due volte più alto nei topi DHT che nei topi no-DHT) utilizzati in questo protocollo sono inferiori a quelli riportati da altri ricercatori in studi precedenti e sono calibrati per imitare proporzionalmente le donne con PCOS5,19, 20,21. A differenza di altri modelli, questo modello DHT 2 volte non altera il peso corporeo e la composizione di tutto il corpo rispetto ai topi no-DHT fino a 3,5 mesi dopo DHT inserimento23,24. Questi topi adulti di DHT impiantati sono mantenuti dal continuo DHT esogeno. Anche se non è alterata composizione di tutto il corpo, alterazione della struttura e la funzione degli adipociti è stati osservati in magra PCOS donne20. Un esame attento dei diversi depositi è autorizzato. Abbiamo osservato alterata ciclicità estro entro una settimana dopo DHT inserimento15 e ridotta fertilità durante un mese 3 fertilità valutazione23.

Il piccolo sottoinsieme di DHT trattati topi femminili che erano in grado di rimanere incinta e avere prole ha fornito l'occasione per valutare l'impatto di iperandrogenismo pre-gestazionale, gestazione e allattamento sullo sviluppo fetale. Al fine di ottenere un esperimento controllato correttamente, sono necessarie più femmine riproduttrici che richiede che almeno 10 paia di accoppiamento essere stabilito. DHT-figlie sono esposti solo in DHT durante la gestazione e prima 21 PNA. DHT-figlie ha mostrato peso corporeo ridotto rispetto alle figlie no-DHT, che indica che l'obesità o in sovrappeso non è una variabile di confusione nell' osservati effetti fisiologici15.

Negli studi iniziali, abbiamo validato i livelli DHT del siero nel corso del tempo. Abbiamo non trovato nessuna differenza significativa in siero DHT a 1, 2, 3 e 4 settimane23,24. I livelli DHT sono diminuito dopo 4 settimane, pertanto, sostituiamo a pellet DHT ogni 4 settimane. Non osserviamo ridotto gli effetti del DHT anche loro sono stati conservati a temperatura ambiente per 3 mesi. È importante Incubare pellet in soluzione salina per 24 h appena prima dell'inserimento. Questo passaggio è fondamentale per il rilascio anche di DHT dal pellet (rilascio DHT lentamente attraverso il tubo di silastic). Estro ciclicità possono essere esaminati dopo 3 giorni di inserimento di DHT, e striscio vaginale possa anche essere esaminato direttamente nella soluzione salina senza a secco e macchia sotto un microscopio chiaro dopo che si ha familiarità con la cella digita27.

Fenotipo metabolico può essere valutato, o dopo, 2 settimane (14 giorni) di inserimento di DHT. Tuttavia, gli effetti del DHT sul metabolismo alla fine della quarta settimana (28 giorni) sono leggermente attenuati, anche se nessuna attenuazione è osservato per disfunzione riproduttiva. Di conseguenza, valutiamo la funzione del metabolismo normalmente alla fine di 2, 3, 5, 6, 7 settimane (14, 21, 35, 42 e 49 giorni, 2 volte totale inserimento). La produzione di pellet di steroidi a lento rilascio in laboratorio è una tecnica matura che è stato ampiamente adottata da diversi laboratori33,34.  Rappresenta un'alternativa economica ai prodotti disponibili in commercio, che può superare i $50/pellet (90 giorno DHT a pellet, pellet/5mg, IRA, NA-161). Il prodotto commerciale hanno il vantaggio di non dover essere sostituito fino a 90 giorni, mentre il pellet descritto in questo rapporto deve essere sostituita ogni 28 giorni. Per studi su larga scala, gli investigatori possono trovare più economico per produrre il proprio pellet anche con il lavoro aggiunto richiesto per sostituire pellet ogni 4 settimane.

Come osservato da altri utenti, modelli con impianto di DHT cronica dopo la nascita non mostrano aumento LH pulsatile frequenza e questo può sottolineare diversi meccanismi patologici di androgeni indotta funzione riproduttiva tra inerente allo sviluppo e tardiva acquisito iperandrogenismo. Con questo protocollo, siamo in grado di indagare la prole femminile da cronicamente iperandrogenica dighe. Possiamo sfruttare questo modello per tentare di comprendere appieno le riproduttivo (ad es. lo sviluppo del follicolo, l'ovulazione (corpi lutei) e fertilità) e le conseguenze metaboliche (es. metabolismo del glucosio o del lipido, composizione corporea, adiposo depot distribuzione). Il nostro protocollo aggiunge nuovo strumento per indagare androgeni indotto riproduttivo e disfunzione metabolica; e si dissocia la patofisiologia causata da androgeni da quelli che potrebbero essere causa di obesità. Questo modello può essere utilizzato per esplorare gli effetti specifici del tessuto degli androgeni elevati nelle femmine. Inoltre, la metodologia segnalata qui per produzione di pellet DHT può applicarsi facilmente allo studio di altri ormoni steroidei.

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Disclosures

Nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (sovvenzioni R00-HD068130 a S.W.) e il centro di ricerca del diabete di Baltimora: piloti e fattibilità Grant (a S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico
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Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., … More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

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