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Developmental Biology

Un modèle de souris Hyperandrogenic d’étudier le Syndrome des ovaires polykystiques

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58379

Summary

Les auteurs décrivent le développement d’un modèle de souris SOPK type maigre avec une boulette de dihydrotestostérone afin d’étudier la physiopathologie du SOPK et la progéniture de ces barrages de SOPK-like.

Abstract

Hyperandrogénie joue un rôle essentiel dans la fonction de reproduction et le métabolisme chez les femmes et est le signe distinctif du syndrome des ovaires polykystiques. Élaboration d’un modèle de souris de SOPK type maigre qui imite les femmes atteintes de SOPK est cliniquement significative. Dans ce protocole, nous décrivons un tel modèle. En insérant une longueur de 4 mm de pastille de poudre cristal DHT (dihydrotestostérone) (longueur totale de pellet est 8 mm), et remplacer tous les mois, nous sommes en mesure de produire un modèle de souris de SOPK type avec pli de niveaux 2 de DHT sérique plus élevé que les souris ne pas implantés avec DHT (no-DHT). Nous avons observé des dysfonctions métaboliques et reproduction sans changer le poids corporel et la composition corporelle. Bien que présentant un degré élevé de l’infertilité, un petit sous-ensemble de ces souris femelles de type SOPK peut tomber enceinte et leur progéniture montre la puberté retardée et une augmentation de testostérone en tant qu’adultes. Ce modèle de souris maigre SOPK-like est un outil utile pour étudier la physiopathologie du SOPK et la progéniture de ces barrages de SOPK-like.

Introduction

Hyperandrogénie est la marque distinctive du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) selon des critères de NIH et de la société SOPK (AE-SOPK) et de l’excès d’androgènes. Les femmes atteintes de SOPK ont du mal à tomber enceinte et ont augmenté le risque de complications de grossesse1. Même si elles tombent enceintes, leur progéniture femelle aurait une santé résultats2,3. Des modèles animaux ont été développés en utilisant diverses stratégies4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 et présentant de nombreuses caractéristiques de PCOS (anovulation, et/ou intolérance au glucose et d’insuline) avec augmentent du poids corporel et de l’obésité lié avec la taille de l’adipocyte élargie et une augmentation du poids adipocytaire. Il y a deux grandes stratégies pour produire des modèles animaux qui servent à étudier le SOPK. L’un est un traitement avec des niveaux élevés d’androgènes directement (androgènes exogènes injection/insertion) ou indirectement (par exemple de bloquer la conversion des androgènes en œstrogènes avec inhibiteur de l’aromatase) après naissance13. Une autre est de hyperexposure fœtale des androgènes au cours de la gestation14,15 pour étudier la descendance. Par exemple, la progéniture femelle de singe rhésus16,17, mouton18et les rongeurs exposés à des niveaux masculins d’androgène au cours de la période intra-utérine développer des traits de SOPK-comme plus tard dans la vie. Ces modèles a considérablement accru notre compréhension des effets élevés d’androgènes et programmation fœtale et effets sur l’environnement utérins. Cependant, ces modèles ont leurs propres limitations : 1) les animaux développent l’obésité et il est donc difficile de séparer les effets de l’hyperandrogénie de l’obésité induite par la reproduction et dysfonctionnement métabolique ; 2) avant la grossesse, les femmes atteintes de SOPK présentent déjà des niveaux élevés d’androgène, donc des ovocytes ont été exposés aux androgènes excès avant la fécondation ; 3) aux doses pharmacologiques de testostérone (T) ou de la dihydrotestostérone (DHT) utilisé après la naissance ou pendant la gestation peuvent ne pas refléter l’environnement androgènes du SOPK. Testostérone et DHT ont été mesurées dans le liquide folliculaire ovarien et/ou de sérum et de testostérone et les niveaux DHT sont 1,5 à 3,9 fois plus élevée chez les femmes atteintes de SOPK5,19,20,21 ,22,23 , comparée aux femmes affectées. Nous avons créé une souris adulte modèle23,24,25 qui développe des dysfonctions métaboliques et reproduction dans les deux semaines de l’ouverture d’une exposition chronique de DHT d’insertion d’une pastille de 4 mm de longueur de poudre DHT de cristal (longueur totale du pellet est 8mm). Ce modèle produit sériques DHT qui sont environ 2 fois plus élevé (appelés 2xDHT) que celle des souris témoins sans traitement de DHT. Les souris 2xDHT ne présentent pas d’altérations de l’estradiol sérique basale, testostérone, LH et do ne pas développer l’obésité et indique similaire poids ovarienne, les taux sériques de cholestérol, acides gras libres, leptine, TNFα et IL-623,24, 25 relatif à contrôle même jusqu'à 3,5 mois après insertion de DHT23,24,25. En outre, en s’accouplant les femelles qui ont déjà développé des caractéristiques du SOPK, nous pouvons étudier l’impact d’un environnement maternel de hyperandrogenic sur la santé génésique et métabolique de la progéniture15.

Ce nouveau paradigme (pertinent pour les critères de NIH et de la société AE-SOPK) modèles de la maladie en produisant des niveaux relativement similaires d’androgènes à ceux des femmes avec SOPK 2 - à 3 fois plus élevé de testostérone ou DHT comparée aux femmes affectées. Cependant, ce modèle est maintenu par la DHT exogène continuelle et non d’hyperandrogénie endogène programmé une fois que la DHT est retirée. L’objectif général du présent article est de mettre l’accent sur la 1) Comment faire pour que le diabolo DHT ; 2) Comment générer un maigre-SOPK comme modèle de souris ; 3) stratégies pour évaluer la progéniture femelle de ces barrages. Autres mesures et évaluation des phénotypes ne sont pas abordées dans ce manuscrit, mais peuvent être trouvées en5,15,23,24,25,26.

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Protocol

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour une insertion et préparation de boulette DHT et pour tester les reproducteurs et métaboliques. Les souris utilisées dans cette étude ont un fond mixte (C57/B6, CD1, 129Sv) et ont été maintenues avec de la nourriture et eau ad libitum dans un cycle lumière/obscurité de 14/10 h à 24 ° C dans l’animalerie de Broadway Research Building à la Johns Hopkins University School of Médecine. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Johns Hopkins University animalier.

1. Créez le modèle murin de SOPK-like

  1. Préparation de boulette DHT
    1. Silastiques autoclave pour stériliser. Couper des tubes de silastic sur une longueur de 15 mm avec une lame de rasoir ;
    2. Sceller un côté par l’injection de silicone adhésif médical dans le tube avec une aiguille atténuée de 20 G, attachée à une seringue de 3 mL. Plongeur doit être retirée de la seringue, puis adhésif inséré dans le réservoir. Le piston est réinséré et adhésif poussé vers le bas jusqu'à ce qu’il commence à émerger de l’aiguille. L’aiguille mitigée faite par le côté pointu de l’aiguille de 20 G en coupant avec des ciseaux forts. La longueur du silicium dans le tube doit être supérieure à 2 mm permettant de postproduction rasage ;
    3. Sécher pendant la nuit ; Recherchez les bulles d’air sur le côté scellé. Ceux qui ont aucune bulle d’air sont utilisés pour pastilles de DHT. D’autres peuvent être utilisés pour les no-DHT contrôle pastilles.
    4. Porter des gants, masque, lunettes et blouse de laboratoire avant d’effectuer la DHT-pellet sous une hotte pour éviter l’exposition DHT à la peau.
    5. Poudre DHT de verser dans un plastique pèsent bateau et appuyez sur le côté ouvert de l’adhésif plafonné tubes (produits en A1.1) dans la poudre DHT.
    6. Poudre DHT peut être enfoncé avec un grand trombone qui se redresse.  Continuez jusqu'à ce que la DHT atteint une hauteur de 4 mm (ou la longueur désirée). Vérifiez la longueur de la DHT avec une règle et joint le côté ouvert avec le silicium, sécher toute la nuit.
    7. Couper chaque côté scellé pour rendre la longueur du silicium 2 mm de long. La longueur totale du pellet sera de 8 mm.
    8. Sceller les deux côtés du vide silastiques comme la pastille de contrôle (no-DHT).
    9. Garder les granulés dans un tube conique de 50 mL enveloppé d’aluminium (afin d’éviter l’exposition à la lumière) à température ambiante jusqu'à utilisation. Les granules DHT maintiennent pleine efficacité pendant au moins 3 mois de stockage.
  2. Remplacement et insertion de DHT
    1. Jusqu'à 20 DHT pellets ou granulés de contrôle sont submergées séparément dans un tube conique de 50 mL avec la solution saline 0,9 % stérile 30 mL pendant 24 h à 37 °C pour l’équilibration juste avant l’insertion.
    2. Avant l’opération, les surfaces et les gants sont désinfectés avec clidox et les surfaces de travail sont recouverts de plastique propre papier absorbant sauvegardé (bloc chirurgical).  Tous les instruments qui entrent en contact avec des animaux sont décontaminés avant d’entrer dans l’animalerie par autoclavage.  Instruments pourront sec et frais avant utilisation.
    3. les souris femelles de 2 mois sont utilisés (4 – 5 souris/cage). Souris sont injectés par voie intrapéritonéale Xylazine (3,5 mg/kg p.c.) et la kétamine (78,8 mg/kg p.c.) à l’aide d’une seringue à insuline. Calculs pour l’anesthésie de dosage et de mélange est dans le tableau 1.
    4. Après que anesthésie adéquat est atteint, telle que mesurée par la perte des réflexes de l’orteil et ralentit la respiration, la souris va être préparée pour la chirurgie.
    5. Désinfecter la peau de la zone avec la bétadine à l’aide d’une gaze stérile et nettoyer avec de l’éthanol à 70 %.  La zone sera encore une fois peint avec betadine.
    6. Découpez un trou d’environ 5 mm de longueur avec ciseaux sous la peau près du cou. À l’aide d’un trocart de 10 G, faites un petit tunnel (15 mm) à la direction rostrale. Le culot est inséré sur le dos avec le trocart.
    7. L’ouverture est ensuite scellée avec de la colle chirurgicale. La plaie manuellement approximative des arêtes avec forceps et douces traits brossage à appliquer une mince couche d’adhésif liquide sur les bords de la plaie par approximation. 3 l’accumulation des couches minces d’adhésif pour s’assurer que la colle est répartie uniformément sur la plaie. L’adhésif doit dépasser de 1 cm de chaque côté des bords de la plaie apposées. Suture ou agrafes chirurgicales peuvent également servir pour fermer le trou. Remettez souris en cage, logé individuel, avec une bouillote pour la récupération. Remplacer les granulés toutes les 4 semaines afin de maintenir un niveau constant de l’exposition aux androgènes. Le granule d’origine sera supprimé et nouveau pellet sera insérée comme décrit dans A1.15 dans la même position.
    8. Éstrale d’essai après 3 jours d’insertion de la DHT. Stade du cycle oestral est évaluée par la cytologie vaginale.  Cellules vaginales sont prélevés par l’aide d’une pipette de p10 à injecter une solution saline stérile (environ 10 µL) dans la cavité vaginale et ensuite retirer la solution saline avec la même pipette stérile 16 jours consécutifs.  Les cellules vaginales entraînées de la paroi vaginale mélangent avec du sérum physiologique et sont collectés.
    9. Étaler une solution saline avec cellules sur une lame marquée. Chaque diapositive peut contenir six échantillons. Diapositives sont étiquetés de manière à noter quel échantillon est placé dans chacune des six emplacements.
    10. Après la solution saline a complètement asséchée dans la diapositive, mettre des diapositives dans un récipient avec de l’éthanol 100 % pour fixer les cellules. Diapositives doivent être fixés pendant au moins 5 min, mais peuvent rester dans le fixateur indéfiniment jusqu'à ce que d’une utilisation ultérieure.
    11. Mettre les diapositives dans des solutions de coloration de 1 min chacun, pour le tampon B et diapositives C. Wash avec l’eau du robinet et sécher à température ambiante.
    12. Examiner la morphologie cellulaire sous un microscope optique objective de 10 X.  La morphologie des cellules à distinguer le pro-oestrus (P), oestrus (E), métoestrus (M) et dioestrus (D) est décrite dans références27,28,29.
    13. Compter les jours dans chaque étape et divisé par le nombre total de jours pour calculer le pourcentage de temps à chaque étape.
    14. Tester la tolérance au glucose à 21 jours après l’insertion de DHT par le jeûne des souris pendant la nuit (16 h) et injection intrapéritonéale de 2 g/kg de poids corporel de 20 % de dextrose. Par exemple, si une souris corps pèse 25 g, cette souris sera injectée avec 250 µL de dextrose de 20 % avec une seringue à insuline 50 cc (0,5 mL). Taux de glucose est évalués par bandes glucomètre et test de prélèvement d’échantillons de sang de la veine caudale à 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Ceci est décrit en détail ailleurs30.
  3. Collecte de sang
    1. Prélever le sang à différents jours après l’insertion de DHT (nous limiter le volume de la collection de 100 µL de stéroïde et 30ul pour dosage de LH/FSH) entre le 9 et 10:00 par veine sous-maxillaire saignement avec lancette. Ceci est décrit dans le11.
    2. Centrifuger de sang à 6 000 x g à 4 ˚C pendant 10 min et recueillir la couche de sérum dans un autre tube de 1,5 mL qui peut être stocké à-80 °C jusqu'à l’analyse.

2. évaluer la reproduction profils de progéniture femelle de façon chronique de DHT inséré des barrages

  1. Accouplement
    1. La souris femelle à tester est déplacée dans la cage avec un mâle fertile éprouvée (qui a déjà eu des petits avec une souris femelle) 15 jours après insertion de pellet.
    2. Document du poids corporel du barrage chaque semaine afin de déterminer si la souris est enceinte. Barrage poids augmente de plus de 3 g en une semaine indique la grossesse.
    3. Recueillir le sang des barrages de la deuxième semaine après qu’on observe une augmentation de poids des barrages supérieure à 3 g à partir de la semaine précédente.
  2. Puberté évaluée par l’ouverture du vagin et premier oestrus
    1. Vérifier l’ouverture vaginale par une inspection visuelle tous les jours après que les petits sont sevrés à 21 jours après l’accouchement (PND), mesurer la distance ano-génitales et enregistrer l’âge d’ouverture du vagin.
    2. Une fois que le vagin s’ouvre, collecter tous les jours, cellules vaginales comme décrit dans 1.2.8–1.2.11 pour vérifier les Éstrale.
    3. Observer la morphologie cellulaire comme décrit 1.2.12, et le premier oestrus est défini comme la date que toutes les cellules sont des cellules épithéliales cornéocytaire.
  3. Corps poids et oreille punch
    1. Trempez la pointe de la lancette dans la pâte de tatouage et marquer chaque chiot avec tatouage sur l’orteil comme décrit dans référence12 à 7 PND et pèsent souris tous les 7 jours jusqu'à 70 jours d’âge.
    2. Souris de coup de poing oreille dénombrer System.* en Figure 1 entre 12 à 16 PND. Pour distinguer le sexe, examiner la face ventrale du corps, les femmes auront mamelons visibles.
    3. Recueillir le sang à 21, 26, 70 PND après la naissance, comme décrit ci-dessus à l’alinéa 1.3.1
  4. Dosage hormonal
    1. Les niveaux de DHT dans le sérum sanguin sont mesurés par les deux dosage immuno-enzymatique (ELISA) et par le tandem de chromatographie en phase liquide de la masse spectrométrie (LC-MS)23,24,31,32. T est mesuré par LC-MS, ou une rat/souris ELISA qui a été validée par l’Université de Virginie Ligand dosage Core dans le centre de recherche en Reproduction23,24.

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Representative Results

Sérique de la DHT et test de tolérance au Glucose

Les niveaux de DHT sont mesurées de sérum prélevé par les deux ELISA et par LC-MS selon protocole 1,24 – 1,25 et 2.9, 3.0. Les valeurs absolues DHT sont différents entre la spectrométrie de masse et ELISA, cependant, le pli relative (environ 2 fois) de DHT vs insertion no-DHT est similaire de deux essais et à travers des expériences15,23,24 ( Figure 2 a).  Les niveaux de DHT sont significativement augmentés de préconception grossesse chez des souris DHT et de no-DHT, cependant, les niveaux de DHT sont 2 fois plus élevée chez les souris DHT par rapport aux souris non-DHT à la fois pregestational (un jour avant l’accouplement) et le diabète gestationnel (environ 14 jours) points dans le temps (Figure 2 b). Étant donné que les niveaux absolus de DHT diffèrent entre ELISA et LC-MS, nous calculons les niveaux relatifs (plier le changement : niveau DHT avec insertion de no-DHT DHT insertion vs) dans les essais. Des souris femelles avec DHT montrent intolérants au glucose par rapport aux no-DHT (Figure 3) à 2 semaines après l’insertion de DHT selon protocole 1,23.

Progéniture femelle corps poids et puberté

Bien que généralement infertiles, certains barrages tomber enceintes et avoir des chiots (environ 30 % le taux de grossesse, ce test de fertilité de 10 barrages nous sera habituellement vous 3 barrages enceintes, se référer au protocole 2.1). Nous pouvons donc évaluer les effets androgènes chronique chez les mères sur la descendance féminine. La progéniture femelle de DHT inséré barrages est appelée DHT-filles, et ceux de no-DHT inséré barrages sont appelés les filles no-DHT. Nous avons n’observé aucune différence entre no-DHT et DHT-filles de l’âge d’ouverture du vagin. Toutefois, le premier oestrus de DHT-filles est considérablement retardé (jour 35 pour fille no-DHT ; jour 42 à DHT-fille). Ceci est associé de la réduction du poids corporel au PND 35 et 42 en DHT-filles par rapport aux filles de no-DHT (Figure 4; se reporter au protocole 2,4 2,7).

Les niveaux hormonaux et Éstrale chez la progéniture femelle

Les niveaux de testostérone ne sont pas modifiés à 21 PND, mais sont réduits à 26PND. Cependant, la testostérone est augmentée à 70 PND (Figure 5, se référer au protocole 2,9 – 3,0). Les filles DHT adultes a montré perturbé Éstrale par rapport aux filles adultes no-DHT, éprouvant beaucoup plus longs en m et moins de temps P et E (Figure 6 a, B; selon la méthode de protocole 1.17 – 1,22).

Figure 1
Figure 1 : identification de la souris. Dans une cage, la souris est oreille coup de poing à une position différente pour représenter le nombre de souris. La souris #1 à 3 est perforé sur l’oreille droite et #4 à 6 est poinçonné sur l’oreille gauche, vu dorsalement. Si la souris est frappée sur les oreilles à la position #1 et #4 fois, c’est #7 ; à 2 et 5, est #8 ; à 3 et 6 est #9 ; au milieu de l’oreille gauche est #10 ; à la position 1 à 10 est #11 ; etc. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : sérum DHT niveaux. Niveaux de sérum DHT. (A) les niveaux de DHT de sérum sont mesurés par ELISA et spectrométrie de masse. Bien que les valeurs absolues sont différentes, les deux essais ont montré même plier différences entre DHT et no-DHT traité des souris. (B) changement de pli de DHT de sérum par rapport aux niveaux de DHT-non aux moments préconceptionnelle et le diabète gestationnel. No-DHT (bars ouverts) et les souris femelles DHT-implantés (barres noires) avant (un jour avant l’accouplement) et Pendant la grossesse (environ 14 jours de gestation). Sont des valeurs moyennes ±S.E.M. N = 5-8 par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : test de tolérance au Glucose (GTT). No-DHT et souris DHT implanté ont jeûné pendant la nuit et glucose (2 g/kg de poids vif) a été injecté par voie intrapéritonéale, queue la glycémie a été mesurée à différents moments. DHT traité des souris ont montré une augmentation significative de la glycémie entre 30 et 120 min par rapport aux souris non-DHT traité. Sont des valeurs moyennes ±S.E.M. N = 4-12 par groupe. * P < 0,05 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : avant la grossesse maternelle DHT traitement conduit à la réduction du poids corporel chez la progéniture femelle à 35 et 42 PND. Poids corporel (axe y) a été mesuré sur des jours après l’accouchement comme indiqué (axe x). Les enfants exposés à la DHT : barre noire ; aucune progéniture – DHT : open bar. Sont des valeurs moyennes ±S.E.M. N = 9 à 14 par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : sérum DHT niveaux. Le PND 21, 26, 70 dans la matinée du sang a été prélevé dans la matinée. Concentrations sériques DHT (axe y) de la progéniture femelle de filles no-DHT (bars ouverts) et DHT-filles (barres noires). Sont des valeurs moyennes ±S.E.M. N = par groupe de 5-11. Ce chiffre a été modifié par référence2veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : chronique maternelle androgène excès conduit à la cyclicité perturbée dans filles adultes. (A) représentation d’Éstrale des femelles. (B) le pourcentage de temps passé à chaque étape œstru (axe y) pendant 15 jours (axe x) mesurées par examen cytologique des cellules vaginales. Sont des valeurs moyennes ±S.E.M. N = par groupe de 5-9. L’étape de cycle oestral (axe y). J : rencontre/dioestrus ; P: pro-oestrus ; E: oestrus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table 1
Tableau 1 : Kétamine/xylazine cocktail.

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Discussion

Hyperandrogénie est une caractéristique essentielle du SOPK. Les niveaux DHT de sérum (deux fois supérieur chez les souris de la DHT que chez les souris no-DHT) utilisés dans le présent protocole sont inférieurs à ceux rapportés par d’autres chercheurs dans des études antérieures et sont étalonnés pour imiter proportionnellement les femmes atteintes de SOPK5,19, 20,21. Contrairement aux autres modèles, ce modèle DHT 2 fois ne modifie pas le poids corporel et la composition du corps entier par rapport aux souris de no-DHT jusqu'à 3,5 mois après insertion de DHT23,24. Ces souris adultes de DHT implanté sont maintenus par continuelle DHT exogène. Composition de l’ensemble du corps n’est pas altérée, altération de la structure et la fonction des adipocytes a été observées dans la maigre SOPK femmes20. Un examen attentif des différents dépôts est justifié. Nous avons observé Éstrale avec facultés affaiblies dans la semaine suivant l' insertion de DHT15 et fertilité réduite pendant un mois 3 fertilité évaluation23.

Le petit sous-ensemble de DHT traité des souris femelles qui ont pu tomber enceinte et progéniture offrent l’occasion d’évaluer l’impact d’une hyperandrogénie gestationel, pendant la gestation et allaitante sur le développement du foetus. Afin d’obtenir une expérience contrôlée correctement, plusieurs femelles reproductrices sont nécessaires qui nécessite qu’au moins 10 paires correspondantes arrêtées. DHT-filles ne sont exposés à la DHT durant la gestation et avant 21 PNA. DHT-filles ont montré la diminution du poids corporel par rapport aux filles de no-DHT, ce qui indique que l’obésité ou le surpoids n’est pas une variable confusionnelle dans les effets physiologiques observés15.

Dans les études initiales, nous avons validé les niveaux DHT de sérum au fil du temps. Nous avons ne trouvé aucune différence significative dans le sérum DHT à 1, 2, 3 et 4 semaines23,24. Les niveaux de DHT a diminué après 4 semaines, par conséquent, nous remplaçons pellet DHT toutes les 4 semaines. Nous n’observons pas réduit les effets de DHT même qu’ils ont été stockés à température ambiante pendant 3 mois. Il est important pour l’incubation des granulés dans une solution saline pendant 24 h, juste avant l’insertion. Cette étape est cruciale pour la même sortie de DHT de la pastille (communiqué de DHT lentement à travers le tube de silastic). Éstrale peut être examinée après 3 jours d’insertion de DHT, et frottis vaginal peut être également examiné directement dans la solution saline sans sec et tache sous un microscope optique après que vous familiariser avec la cellule types27.

Phénotype métabolique peut être évalué à, ou après 2 semaines (14 jours) d’insertion de la DHT. Cependant, les effets de la DHT sur le métabolisme à la fin de la quatrième semaine (28 jours) sont légèrement atténués, mais aucune atténuation n’est observée pour le dysfonctionnement reproductif. Par conséquent, nous évaluons fonction métabolisme normalement à la fin du 2, 3, 5, 6, 7 semaines (14, 21, 35, 42 et 49 jours, 2 fois total d’insertion). La production de pellets stéroïdes libération lente dans le laboratoire est une maturité technique qui a été largement adoptée par différents laboratoires33,,34.  Il représente une alternative économique aux produits disponibles dans le commerce, qui peut dépasser 50 $/ pellets (granulés de DHT, 5mg/pellet, IRA, NA-161 de 90 jours). Le produit commercial a l’avantage de ne pas avoir à remplacer jusqu'à 90 jours, alors que le culot décrit dans le présent rapport doit être remplacé tous les 28 jours. Pour des études à grande échelle, les enquêteurs peuvent trouver plus économique de produire leurs propres granulés même avec le travail supplémentaire nécessaire pour remplacer les granules toutes les 4 semaines.

Tel qu’observé par d’autres, modèles avec implantation de DHT chronique après naissance ne montrent pas une augmentation de LH pulsatile fréquence et cela peuvent souligner différents mécanismes pathologiques des taux d’androgènes induite par la fonction de reproduction entre développement et tardives acquis hyperandrogénie. Avec ce protocole, nous sommes en mesure d’enquêter sur la progéniture femelle de chronique hyperandrogenic barrages. Nous pouvons tirer parti de ce modèle pour essayer de comprendre pleinement la reproduction (p. ex. le développement folliculaire, l’ovulation (corps jaunes) et la fertilité) et les conséquences métaboliques (p. ex. le métabolisme de glucose ou les lipides, composition corporelle, dépôt adipeux aire de répartition). Notre protocole ajoute le nouvel outil pour étudier les taux d’androgènes induite par la reproduction et le dysfonctionnement métabolique ; et se dissocie de la physio-pathologie provoquée par les taux d’androgènes de ceux qui pourraient être attribuables à l’obésité. Ce modèle peut être utilisé pour explorer les effets spécifiques de tissus d’androgènes élevés chez les femmes. En outre, la méthodologie rapportée ici pour la production de DHT pellet peut être facilement appliquée à l’étude des autres hormones stéroïdes.

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Disclosures

Rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (subventions R00-HD068130 à S.W.) et le centre de recherches de diabète Baltimore : pilotes et subvention de faisabilité (à S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystalline 5α-DHT powder Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter
Medical adhesive silicone Factor II, InC. A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
attached needle: 20 G BD 305176
Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale.
Xylazine Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100 mg/mL
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100 mg/mL
Surgical staple AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
Trocar Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Manufacturer: Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Developmental Biology numéro 140 syndrome des ovaires polykystiques syndrome dihydrotestostérone (DHT) Éstrale androgènes puberté progéniture femelle
Un modèle de souris Hyperandrogenic d’étudier le Syndrome des ovaires polykystiques
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Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., More

Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

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