Summary
Wir beschreiben die Entwicklung von einem schlanken PCOS-wie Maus-Modell mit Pellet-Dihydrotestosteron, die Pathophysiologie der PCOS und die Nachkommen aus diesen PCOS-wie Dämme zu studieren.
Abstract
Hyperandrogenemia spielt eine entscheidende Rolle in der reproduktiven und metabolische Funktion bei Frauen und ist das Markenzeichen der PCO-Syndrom. Entwicklung eines schlanken PCOS-wie Maus-Modells, das Frauen mit PCOS imitiert ist klinisch relevant. In diesem Protokoll beschreiben wir ein solches Modell. Durch das Einfügen einer Länge von DHT (Dihydrotestosteron) Crystal Pulver Pellets 4 mm (Gesamtlänge der Pellets beträgt 8 mm), und monatlich zu ersetzen, können wir eine PCOS-wie Maus-Modell mit Serum DHT Level 2 fache höher als Mäuse nicht implantiert mit DHT (keine-DHT) zu produzieren. Wir beobachteten reproduktive und metabolische Dysfunktion ohne Gewicht und Körperzusammensetzung zu ändern. Während ein hohes Maß an Unfruchtbarkeit ausstellen, eine kleine Teilmenge dieser PCOS-wie weibliche Mäuse schwanger kann und ihre Nachkommen verzögerte Pubertät und erhöhte Testosteron als Erwachsene zeigen. Diese PCOS-wie schlanke Maus-Modell ist ein nützliches Tool um die Pathophysiologie von PCOS und die Nachkommen aus diesen PCOS-wie Dämme zu studieren.
Introduction
Hyperandrogenism ist das Markenzeichen von PCO-Syndrom (PCOS) nach NIH-Kriterien und der überschüssige Androgen und PCOS (AE-PCOS) Gesellschaft. Frauen mit PCOS haben Schwierigkeiten, schwanger und haben ein erhöhtes Risiko von Schwangerschaft Komplikationen1. Selbst wenn sie schwanger werden, haben ihre weiblichen Nachkommen eines negativen gesundheitlichen Ergebnisse2,3. Tiermodelle sind entwickelt worden, mit verschiedenen Strategien4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 und viele Funktionen von PCOS (Anovulation und oder wertgemindert Glukose und Insulin Toleranz) mit erhöhtem Körpergewicht und Adipositas verbunden mit erweiterten Adipocyte Größe und Gewicht erhöhte Adipocyte ausstellen. Es gibt zwei Hauptstrategien, Tiermodellen zu produzieren, die verwendet werden, um PCOS zu studieren. Behandlung mit einem hohen Grad von Androgenen direkt (exogene Androgen Injektion/einstecken) oder indirekt (z. B. Sperrung Androgen-Umwandlung zu Östrogen mit Aromatase-Hemmer) ist nach der Geburt13. Ein weiterer ist von fetalen Hyperexposure von Androgenen während Schwangerschaft14,15 , die Nachkommen zu studieren. Zum Beispiel entwickeln weibliche Nachkommen von Rhesus-Affen16,17, Schafe18und Nagetiere ausgesetzt männliche Androgen während der intrauterinen Zeit PCOS-ähnliche Züge später im Leben. Diese Modelle deutlich erweitert unser Verständnis von erhöhten Androgen Effekte und fetale Programmierung und uterine Auswirkungen auf die Umwelt. Diese Modelle haben jedoch ihre eigenen Grenzen: 1) Tiere entwickeln Korpulenz und daher ist es schwierig, die Auswirkungen der Hyperandrogenemia von Adipositas verursachten Fortpflanzungs- und Stoffwechselstörungen; zu trennen (2) vor der Schwangerschaft Frauen mit PCOS weisen bereits hohe Androgen, somit Eizellen Androgen überschüssige vor der Befruchtung ausgesetzt worden; (3) die pharmakologischen Dosen von Testosteron (T) oder Dihydrotestosteron (DHT) verwendet, nach der Geburt oder während der Schwangerschaft können die Androgen-Umgebung von PCOS nicht wider. Testosteron und DHT Niveaus im Eierstock follikelflüssigkeit und/oder Serum gemessen wurden, und Testosteron und DHT-Spiegel sind 1,5 bis 3,9 fache höher bei Frauen mit PCOS5,19,20,21 ,22,23 im Vergleich zu Frauen unberührt. Wir haben einen Erwachsenen Maus Modell23,24,25 , die innerhalb von zwei Wochen über die Einleitung einer chronischen DHT aus Einfügung eines Pellet-mit 4 mm Länge des reproduktiven und metabolische Dysfunktion entwickelt Kristallpulver DHT (Gesamtlänge der Pellets beträgt 8mm). Dieses Modell produziert Serum-DHT-Spiegel, die über 2-fach höher (als 2xDHT bezeichnet) sind als die Kontroll-Mäusen ohne DHT Behandlung. Die 2xDHT Mäuse weisen nicht auf Veränderungen der basalen Serum Östradiol, Testosteron, LH und tun nicht Adipositas zu entwickeln, und zeigen ähnliches Eierstockkrebs Gewicht, Serumspiegel von Cholesterin, freie Fettsäuren, Leptin, TNF und IL-623,24, 25 gegenüber steuert sogar bis zu 3,5 Monate nach DHT Einfügung23,24,25. Bei der Paarung von Weibchen, die bereits Funktionen von PCOS entwickelt haben, können wir darüber hinaus die Auswirkungen einer Hyperandrogenic mütterlichen Umgebung auf die metabolischen und reproduktive Gesundheit der Nachkommen15studieren.
Dieses neue Paradigma (NIH und AE-PCOS Gesellschaft Kriterien relevant) Modelle die Krankheit durch die Produktion relativ ähnliche Niveaus der Androgene, die von Frauen mit PCOS 2 - 3-fold höhere Testosteron oder DHT-Spiegel im Vergleich zu Frauen unberührt. Dieses Modell wird jedoch beibehalten durch ständige exogene DHT und nicht von programmierten endogene Hyperandrogenism, sobald DHT entzogen wird. Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, Schwerpunkt 1) wie man das DHT Pellet; (2) wie ein Lean-PCOS wie Mausmodell zu generieren; (3) Strategien zur weibliche Nachkommen aus dieser Dämme zu bewerten. Andere Messungen und Bewertung der Phänotypen in dieser Handschrift nicht behandelt, aber können in5,15,23,24,25,26gefunden werden.
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Protocol
Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Protokolle für DHT Pellet Vorbereitung und Eingliederung "und" für reproduktive und metabolischen Tests. Die Mäuse, die in dieser Studie verwendeten waren eine gemischte Hintergrund (C57/B6, CD1, 129Sv) und waren gepflegt mit Nahrung und Wasser Ad Libitum in einem 14/10 h-Hell-Dunkel-Zyklus bei 24 ° C in der Broadway-Forschungsgebäude Tierhaus an der Johns Hopkins University School of Medizin. Alle Verfahren wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Erstellen Sie PCOS-wie Maus-Modell
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DHT-Pellet-Vorbereitung
- Autoklaven Silastic Schläuche zu sterilisieren. Geschnitten Sie Silastic Rohre auf eine Länge von 15 mm mit einer Rasierklinge;
- Versiegeln Sie einseitig durch die Injektion von medizinischen Klebstoff Silikon in das Rohr mit einer 20 G abgestumpften Nadel an einer 3 mL Spritze befestigt. Kolben muss aus der Spritze und dann Klebstoff eingefügt in das Reservoir zurückgezogen werden. Der Kolben wieder eingefügt und Klebstoff nach unten gedrückt, bis sie anfängt, sich von der Nadel. Die abgestumpften Nadel erfolgt durch die scharfe Spitze Seite der Nadel 20 G mit einer starken Schere schneiden. Die Länge des Siliziums in der Röhre sollte mehr als 2 mm betragen, damit für die Postproduktion Trimmen sein;
- Über Nacht trocknen; Suchen Sie nach Luftblasen auf der geschlossenen Seite. Diejenigen mit keine Luftblasen sind für DHT Pellets verwendet. Andere können für keine-DHT Kontrolle Pellets verwendet werden.
- Tragen Sie Handschuhe, Maske, Schutzbrille und Kittel vor DHT-Pellet in eine Kapuze DHT auf der Haut zu vermeiden.
- Gießen Sie DHT Pulver in einem Kunststoff wiegen Boot und drücken Sie die offene Seite des Klebers in das DHT-Pulver Röhren (produziert in a1. 1) begrenzt.
- DHT-Pulver kann mit einer Büroklammer verstopft werden nach unten, die begradigt ist. Weiter bis DHT eine Höhe von 4 mm (oder gewünschte Länge erreicht). Überprüfen Sie die Länge von DHT mit einem Lineal, und verschließen Sie die offene Seite mit Silikon, trocken über Nacht.
- Schneiden Sie jede versiegelte Seite um an die Länge des Siliziums 2 mm lang. Die Gesamtlänge der Pellet wird 8 mm betragen.
- Beide Seite des leeren Silastic Schläuche als Kontrolle (keine-DHT) Pellet zu versiegeln.
- Pellets werden in einem 50 mL konische Rohr gewickelt mit Folie (zum Lichteinfall zu verhindern) bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung. Die DHT-Pellets erhalten volle Wirksamkeit für mindestens 3 Monate Lagerung.
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DHT einsetzen und Ersatz
- Bis zu 20 DHT eingetaucht sind Pellets oder Kontrolle Pellets separat in einem 50 mL konische Röhrchen mit 30 mL sterile 0,9 % Kochsalzlösung für 24 h bei 37 °C für Gleichgewichtherstellung kurz vor einsetzen.
- Vor der Operation sind die Oberflächen und Handschuhe sind mit Clidox desinfiziert und die Arbeitsflächen mit saubere Kunststoff gesicherte saugfähiges Papier (op Pad). Alle Instrumente, die mit Tieren in Kontakt gekommen sind vor dem Eintritt in die Tierstation durch Autoklavieren dekontaminiert. Instrumente, trockenen und kühlen vor Gebrauch dürfen.
- 2 Monate alten weibliche Mäusen verwendet (4 – 5 Mäuse/Käfig). Mäuse sind intraperitoneal mit Xylazin injiziert (3,5 mg/kg bw) und Ketamin (78,8 mg/kg bw) mit einer Insulin-Spritze. Berechnungen für mischen und Dosieren Anästhesie ist in Tabelle 1.
- Nach ausreichende Anästhesie, erreicht ist gemessen am Verlust der Zehe Reflex und Atmung verlangsamte, wird die Maus für die Operation vorbereitet.
- Die Haut des Gebiets mit Betadine mit steriler Gaze desinfizieren und reinigen mit 70 % Ethanol. Das Gebiet wird wieder mit Betadine bemalt werden.
- Schneiden Sie ein Loch ca. 5 mm unter der Haut in der Nähe des Halses Länge mit Schere. Mit einer 10 G Trochar stellen Sie einen kleinen Tunnel (15 mm) in Richtung rostral. Das Pellet wird dorsal mit der Trochar eingefügt.
- Die Eröffnung ist dann mit chirurgischen Klebstoff versiegelt. Manuell ungefähre Ränder die Wunde mit Zange und sanftes Bürsten Striche, eine dünne Schicht flüssigen Klebstoff auf die angenäherten Wundränder anzuwenden. Aufbau 3 dünne Schichten Kleber um sicherzustellen, dass der Klebstoff gleichmäßig über die Wunde. Der Kleber sollte 1 cm auf jeder Seite des adaptiert Wundränder erweitern. Naht oder chirurgische Clips können auch verwendet werden, um das Loch zu schließen. Setzen Sie wieder Mäuse Käfig, einzeln untergebracht, mit einem Wärmekissen für Erholung. Ersetzen Sie Pellet alle 4 Wochen, um ein konstantes Niveau von Androgen Belichtung zu erhalten. Das ursprüngliche Pellet werden entfernt und neue Pellet wird wie beschrieben in A1.15 in der ähnlichen Position eingefügt werden.
- Testen Sie estrous Zyklizität nach 3 Tagen von DHT einsetzen. Estrous Zyklus-Phase wird durch vaginale Zytologie beurteilt. Vaginale Zellen werden mithilfe einer Pipette p10 um sterile Kochsalzlösung (etwa 10 µL) in die vaginale Hohlraum zu Spritzen und dann Rückzug der Kochsalzlösung mit der gleichen sterilen PIPETTENSPITZE für 16 aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt. Vaginale Zellen abgestoßen von vaginalen Wand mischen mit Kochsalzlösung und gesammelt werden.
- Kochsalzlösung mit Zellen in eine beschriftete Folie zu verbreiten. Jede Folie kann sechs Proben enthalten. Folien sind beschriftet, damit beachten die Probe an jedem der sechs Standorte platziert wird.
- Nach der Saline wurde vollständig auf die Folie legen Dias in einen Behälter mit 100 % Ethanol, Zellen zu beheben ausgetrocknet. Folien sollten mindestens 5 min lang behoben werden, aber können auf unbestimmte Zeit bis zur weiteren Verwendung in Fixiermittel bleiben.
- Setzen Sie Folien in befleckenden Lösungen für 1 min für Puffer B und C. Wash Folien mit Leitungswasser und bei Zimmertemperatur trocknen.
- Zellmorphologie unter einem 10 X Objektiv Lichtmikroskop zu untersuchen. Referenzen27,28,29beschreibt Zellmorphologie Proestrus (P), Östrus (E), Metestrus (M) und Diestrus (D) zu unterscheiden.
- Anzahl Tage in jedem inszenieren und dividiert durch die Gesamtzahl der Tage Prozent Zeit auf jeder Stufe zu berechnen.
- Testen Sie Glukosetoleranz 21 Tage nach dem Einsetzen von DHT durch Fasten die Mäuse über Nacht (16 h) und 2 g/kg Körpergewicht von 20 % Dextrose intraperitoneale Injektion. Zum Beispiel wenn ein Maus-Körper-Gewicht 25 g, wird diese Maus mit 250 µL 20 % Dextrose mit einer 50 cc (0,5 mL) Insulin Spritze injiziert werden. Blutzuckerspiegel bewertet Blutzuckermessgerät und Teststreifen durch Stichproben Blut vom Schweif Ader in 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Dies bezeichnet man im detail an anderer Stelle30.
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Blutentnahme
- Sammeln Sie Blut an verschiedenen Tagen nach DHT einlegen (wir beschränken Auffangvolumen 100 µL für Steroid und 30ul für LH/FSH-Assay) zwischen 9 und 10:00 von mandibulären Vene Blutungen mit Lanzette. Dies ist in11beschrieben.
- Zentrifugieren Sie Blut bei 6.000 X g bei 4 ˚C für 10 min, und sammeln Sie die Serum-Schicht in einer anderen 1,5 mL Röhrchen, die bis zum Test bei-80 °C gelagert werden kann.
2. Bewerten Sie reproduktive Profile der weiblichen Nachkommen von chronisch DHT eingefügt Dämme
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Paarung
- Die weibliche Maus getestet werden wird 15 Tage nach Pellet Einfügung in den Käfig mit einem bewährten fruchtbaren männlichen (, die Welpen mit einer weiblichen Maus zuvor hat) verschoben.
- Dokumentieren des Damms Körpergewicht wöchentlich um festzustellen, ob die Maus schwanger ist. Dam-Gewichtszunahme von mehr als 3 g in einer Woche zeigt Schwangerschaft.
- Sammeln Sie Blut von Dämmen die zweite Woche nachdem wir erhöhtes Körpergewicht von Staudämmen größer als 3 g aus der Vorwoche beobachten.
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Pubertät durch vaginale Öffnung und erste Brunst bewertet
- Überprüfen Sie vaginale Öffnung durch Sichtkontrolle täglich nach Welpen entwöhnt sind bei 21 nach der Geburt Tag (PND), Anogenital Abstand messen und aufzeichnen Lebensjahr vaginale Öffnung.
- Sobald Scheide öffnet, sammeln Sie vaginale Zellen täglich, wie beschrieben in 1.2.8–1.2.11, estrous Zyklizität zu überprüfen.
- Zellmorphologie als beschrieben 1.2.12 zu beobachten, und die erste Brunst ist definiert als das Datum, dass alle Zellen verhornten Epithelzellen sind.
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Körper-Gewicht und Ohr-Punsch
- Tauchen Sie die lanzettenspitze in die Tattoo-Paste und markieren Sie jeder Welpe mit Tattoo auf der Zehe zu, wie in Referenz12 s. 7 PND beschrieben, und wiegen Sie Mäuse Alle 7 Tage bis 70 Tage alt.
- In Abbildung 1 zwischen 12 bis 16 PND verwenden Ohr Punch Mäuse aufzählen System. Sex zu unterscheiden, Bauchseite des Körpers zu untersuchen, werden Weibchen sichtbare Brustwarzen haben.
- Sammeln Sie Blut am 21, 26, 70 PND nach der Geburt wie oben beschrieben in 1.3.1
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Hormonelle Assay
- DHT-Spiegel im Blutserum sind beide Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) gemessen und per Flüssigkeitschromatographie Tandem mass Spectrometry (LC-MS)23,24,31,32. T wird durch LC-MS oder eine Ratte/Maus ELISA, die von der University of Virginia Liganden Assay Kern in der Mitte für Forschung in Reproduktion23,24validiert wurden gemessen.
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Representative Results
Serum-DHT-Spiegel und Glukose-Toleranz-test
DHT-Spiegel wurden aus gesammelten Serum durch beide ELISA und LC-MS gemessen nach Protokoll 1,24 – 1,25, und 2,9, 3.0. Die DHT Absolutwerte unterscheiden sich zwischen Massenspektrometrie und ELISA, jedoch die relative Falte, die von DHT Vs keine-DHT einsetzen ist ähnlich von beiden Assays und über Experimente15,23,24 ( (ca. 2-fold) Abbildung 2A). DHT-Spiegel sind aus Vorurteil durch Schwangerschaft in DHT und keine-DHT Mäusen deutlich erhöht, allerdings DHT-Spiegel sind 2-fach höher in die DHT-Mäuse im Vergleich zu den keine-DHT-Mäusen an beiden pregestational (ein Tag vor der Paarung) und Gestationsalter (ca. 14 Tage) Zeitpunkten (Abb. 2 b). Da ELISA und LC-MS absoluten Niveaus von DHT unterscheiden, wir berechnen relativen Pegel (Falten Änderung: DHT Ebene mit DHT Einfügung Vs keine-DHT Insertion) innerhalb von Assays. Weibliche Mäuse mit DHT zeigte 2 Wochen nach DHT Einfügung nach Protokoll 1.23 beeinträchtigte Glukosetoleranz im Vergleich zu keine-DHT (Abbildung 3).
Weibliche Nachkommen Körper Gewicht und Pubertät
Während in der Regel unfruchtbar, einige Dämme schwanger und haben Welpen (ca. 30 % Schwangerschaftsrate, sodass wir Dämme Fruchtbarkeit von 10 Tests in der Regel erhalten 3 schwanger Dämme, beziehen sich auf Protokoll 2.1). Wir können daher chronische Androgen Effekte in Dämme auf die weiblichen Nachkommen auswerten. Weibliche Nachkommen von DHT eingefügt Dämme heißen DHT-Töchter, und jene von keine-DHT eingefügt Dämme werden keine-DHT Töchter genannt. Wir beobachteten keinen Unterschied zwischen keine-DHT und DHT-Töchtern für das Zeitalter der Vaginalöffnung. Jedoch ist die erste Brunst DHT-Töchter erheblich verzögert (Tag 35 für keine-DHT Tochter; Tag 42 für DHT-Tochter). Dies ist verbunden mit einem reduzierten Körpergewicht bei 35 und 42 PND in DHT-Töchter im Vergleich zu keine-DHT Töchter (Abbildung 4; beziehen sich auf Protokoll 2,4 – 2,7).
Hormonspiegel und estrous Zyklizität in weiblichen Nachkommen
Testosteron-Spiegel sind bei 21 PND nicht verändert, aber bei 26PND reduziert werden. Testosteron wird jedoch bei 70 PND erhöht (Abbildung 5, beziehen sich auf Protokoll 2,9 – 3,0). Erwachsene Töchter DHT zeigte gestört estrous Zyklizität im Vergleich zu Erwachsenen keine-DHT Töchter, deutlich längere Zeiten m/d und weniger Zeit in P und E (Abb. 6A, B; nach der Methode im Protokoll 1,17 – 1,22).
Abbildung 1: Mouse Kennung. In einem Käfig ist Maus Ohr gestanzt an anderen Position der Maus Zahl dargestellt. Maus #1 bis 3 ist auf dem rechten Ohr gestanzt und #4 bis 6 ist auf dem linken Ohr dorsal betrachtet gestanzt. Wenn Maus auf Ohren an #1 und #4 Stelle gestanzt wird, ist es #7; bei 2 und 5 ist #8; bei 3 und 6 befindet #9; in der Mitte des linken Ohres ist #10; an Position 1 bis 10 ist #11; etc. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Serum DHT Niveaus. Serum-DHT-Spiegel. (A) durch ELISA und Massenspektrometrie Serum-DHT-Spiegel gemessen werden. Die absoluten Werte sind, zwar unterschiedlich Falten Sie die beiden Assays zeigten ähnliche Unterschiede zwischen DHT und keine-DHT behandelten Mäuse. (B) Serum DHT Falte Änderung im Vergleich zu nicht-DHT-Spiegel zu preconceptional und Gestationsalter Zeitpunkten. No-DHT (offene Balken) und DHT implantiert (schwarze Balken) weiblichen Mäusen vor (ein Tag vor der Paarung) und während der Schwangerschaft (ca. 14 Tage der Schwangerschaft). Werte sind mittlere ±S.E.M. N = 5-8 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Glucose-Toleranz-Test (GTT). No-DHT und DHT implantiert Mäusen wurden über Nacht gefastet und Glukose (2 g/kg BW) intraperitoneal injiziert wurde, und Schweif des Blutzuckers zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen wurde. DHT behandelten Mäuse zeigten deutlich erhöhte Blutzuckerspiegel zwischen 30 bis 120 min im Vergleich zu keine-DHT behandelt Mäuse. Werte sind mittlere ±S.E.M. N = 4-12 pro Gruppe. * P < 0,05 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: vor der Schwangerschaft mütterlichen DHT Behandlung führte zu geringeren Körpergewicht in weibliche Nachkommen auf 35 und 42 PND. Körpergewicht (Y-Achse) wurde an postnatalen Tagen gezeigt (X-Achse) gemessen. DHT-exponierten Nachkommen: schwarzer Balken; keine – DHT-Nachkommen: offene bar. Werte sind mittlere ±S.E.M. N = 9-14 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Serum DHT Niveaus. Blut wurde auf PND 21, 26, 70 in der früh am Morgen gesammelt. Serum-DHT-Spiegel (Y-Achse) von weiblichen Nachkommen von keine-DHT Töchtern (offene Balken) und DHT-Töchter (schwarze Balken). Werte sind mittlere ±S.E.M. N = 5-11 pro Gruppe. Diese Zahl wurde von Referenz2geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: chronischen mütterlichen Androgen Überschuss führt zu gestörten Zyklizität in erwachsenen Töchtern. (A) Darstellung des estrous Zyklizität der weiblichen Nachkommen. (B) verbrachte der Prozentsatz der Zeit an jeder estrous Phase (Y-Achse) innerhalb von 15 Tagen (X-Achse) durch zytologische Untersuchung vaginale Zellen gemessen. Werte sind mittlere ±S.E.M. N = 5-9 pro Gruppe. Das Stadium des Estrous Zyklus (Y-Achse). M/d: erfüllt/Diestrus; P: Proestrus; E: Brunst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Ketamin/Xylazin-Cocktail.
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Discussion
Hyperandrogenism ist ein wesentliches Merkmal des PCOS. Das Serum DHT-Spiegel (zwei Falten höher in DHT Mäuse als bei keine-DHT Mäusen) verwendet in diesem Protokoll sind niedriger als die von anderen Forschern in früheren Studien gemeldet und sind so kalibriert, dass um Frauen mit PCOS5,19proportional zu imitieren, 20,21. Im Gegensatz zu anderen Modellen ändert dieses 2-fold DHT-Modell nicht das Körpergewicht und Ganzkörper-Zusammensetzung im Vergleich zu keine-DHT Mäuse bis zu 3,5 Monate nach DHT Einfügung23,24. Diese Erwachsenen Mäusen DHT implantiert werden durch ständige exogene DHT gepflegt. Obwohl ganze Körperzusammensetzung nicht verändert wird, ist Änderung der Struktur und Funktion der Adipozyten in schlanken PCOS Frauen20beobachtet worden. Eine sorgfältige Prüfung der verschiedenen Depots ist gewährleistet. Wir beobachtet beeinträchtigt estrous Zyklizität innerhalb einer Woche nach DHT Einfügung15 und Fruchtbarkeit während einer dreimonatigen Fruchtbarkeit Bewertung23reduziert.
Die kleine Teilmenge von DHT behandelt weibliche Mäusen, die schwanger werden konnten und haben Nachwuchs bot Gelegenheit zur Bewertung der Auswirkungen von pre-gestational, Schwangerschafts und pflegerischen Hyperandrogenemia auf die fetale Entwicklung. Um ein richtig kontrolliertes Experiment zu erhalten, mehrere Zuchthündinnen sind erforderlich, die erfordert, dass mindestens 10 Paarung Paare festgelegt werden. DHT-Töchter sind nur während der Schwangerschaft und vor 21 PNA zu DHT ausgesetzt. DHT-Töchter zeigten geringere Körpergewicht im Vergleich zu keine-DHT Töchter, darauf hinweist, dass Fettleibigkeit oder Übergewicht keiner konfundierenden Variablen in der beobachteten physiologischen Effekte15.
In ersten Studien validiert wir die Serum-DHT-Spiegel im Laufe der Zeit. Wir fanden keine signifikanten Unterschiede im Serum DHT bei 1, 2, 3 und 4 Wochen23,24. DHT-Spiegel sank nach 4 Wochen, deshalb ersetzen wir DHT Pellet alle 4 Wochen. Reduzierte Auswirkungen von DHT beobachten, die auch sie für 3 Monate bei Zimmertemperatur gespeichert wurden wir nicht. Es ist wichtig, die Pellets in Kochsalzlösung für 24 h vor dem Einfügen zu inkubieren. Dieser Schritt ist wichtig für sogar Freisetzung von DHT aus der Pellet (DHT Freigabe langsam durch die Silastic-Schläuche). Estrous Zyklizität geprüft werden kann, nach 3 Tagen der DHT Einfügung und vaginalen Abstrich kann auch direkt in die Kochsalzlösung ohne chemische und Fleck unter einem Lichtmikroskop untersucht werden, nachdem Sie vertraut mit der Zelle27Arten.
Metabolische Phänotyp kann bei oder nach 2 Wochen (14 Tage) DHT Einfügung, beurteilt werden. Die Wirkung von DHT auf Stoffwechsel am Ende der vierten Woche (28 Tage) werden jedoch leicht abgeschwächt, obwohl keine Dämpfung für reproduktiven Dysfunktion beobachtet wird. Daher beurteilen wir Stoffwechsel-Funktion normalerweise am Ende der 2, 3, 5, 6, 7 Wochen (14, Gesamt 21, 35, 42 und 49 Tagen 2 mal einfügen). Langsame Freisetzung Steroid pelletherstellung im Labor ist eine ausgereifte Technik, die häufig von verschiedenen Labors33,34angenommen worden ist. Es stellt eine kostengünstige Alternative zu handelsüblichen Produkten, die mehr $50/Pellet (90 Tage DHT Pellets als, 5mg/Pellet, IRA, NA-161). Das kommerzielle Produkt hat den Vorteil, nicht brauchen, um bis zu 90 Tage ersetzt werden, während das Pellet in diesem Bericht beschriebenen alle 28 Tage ersetzt werden muss. Für groß angelegte Studien Ermittler finden es möglicherweise günstiger, ihre eigenen Pellets auch mit der zusätzlichen Arbeit benötigt, um Pellets ersetzen alle 4 Wochen zu produzieren.
Wie von anderen beobachtet, Modelle mit chronischen DHT-Implantation nach Geburt zeigen keine erhöhte LH pulsierende Frequenz und dies darf darauf hinweisen, verschiedenen pathologischen Mechanismen der erhöhten Androgen induzierten reproduktive Funktion zwischen Entwicklungs- und spätem erworbenen Hyperandrogenism. Mit diesem Protokoll können wir weibliche Nachkommen von chronisch Hyperandrogenic Dämme zu untersuchen. Wir können dieses Modell zu versuchen, zu verstehen die reproduktiven (z.B. Follikel Entwicklung, Eisprung (Corpora Lutea) und Fruchtbarkeit) und metabolischen Konsequenzen (z. B. Glukose oder Lipid-Stoffwechsel, Körperzusammensetzung, adipösen Depot nutzen. (Verteilung). Unser Protokoll fügt neues Tool um erhöhten Androgen induzierten Fortpflanzungs- und Stoffwechselstörungen zu untersuchen; und distanziert sich die Pathophysiologie, verursacht durch erhöhten Androgen von denen, die auf Übergewicht zurückzuführen sein kann. Dieses Modell kann verwendet werden, um das Gewebe spezifische Wirkungen des erhöhten Androgene bei Frauen zu erkunden. Darüber hinaus kann die Methodik hier berichtet für DHT-Pellet-Produktion leicht zum Studium der anderen Steroid-Hormone angewendet werden.
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Disclosures
Nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (Zuschüsse R00-HD068130, S.W) und dem Baltimore Diabetes Research Center: Piloten und Machbarkeit Stipendium (S.W).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystalline 5α-DHT powder | Sigma-Aldrich | A8380-1G | |
| Dow Corning Silastic tubing | Fisher Scientific | 11-189-15D | 0.04in/1mm inner diameter x0.085 in/2.15 mm outer diameter |
| Medical adhesive silicone | Factor II, InC. | A-100 | |
| Goggles, lab coats, gloves and masks. | |||
| 10 µL pipette tips without filter | USA Scientific | 11113700 | |
| Microscope slide for smear | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Diff Quik for staining cells | Fisher Scientific | NC9979740 | |
| Lancet | Fisher Scientific | NC9416572 | |
| 3 mL Syring | Becton, Dickinson and Company (BD), | 30985 | |
| attached needle: 20 G | BD | 305176 | |
| Ruler: any length than 10 cm with milimeter scale. | |||
| Xylazine | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100 mg/mL |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100 mg/mL |
| Surgical staple | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe |
| Trocar | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Microscope | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | Germany |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | |
| Testosterone rat/mouse ELISA kit | IBL | B79174 | |
| DHT ELISA kit | Alpha Diagnostic International | 1940 | |
| One touch ultra glucometer | Life Scan, Inc. | ||
| One touch ultra test stripes | Life Scan, Inc. | ||
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-18 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Clidox | Fisher Scientific | NC0089321 | |
| surgical underpad | Fisher Scientific | 50587953 | Manufacturer: Andwin Scientific 56616018 |
| Betadine Antiseptic Solution | Walgreens | ||
| 3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) | 3M Science. Applied to Life |
References
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